Avaliação de MBC para X fastidiosa

Para a determinação da MBC para X. fastidiosa foram utilizadas células planctônicas e em biofilme. As células em biofilme podem ser consideradas mais resistentes a compostos antimicrobianos, em relação às células em crescimento planctônico, pois apresentam vantagem adaptativa (Costerton et al., 1995). Provavelmente, devido a isso, as doses, capazes de controlar o crescimento em biofilme costumam ser muito maiores do que as utilizadas quando as células crescem de forma planctônica, como observado por Rodrigues et al. (2007) ao utilizar o cobre e zinco como compostos antimicrobianos

Para o peptídeo AR0610, o crescimento planctônico e biofilme foram reduzidos dez vezes, quando comparados com o controle positivo (somente a bactéria), de aproximadamente 105UFC/ml (Fig. 16). Entretanto, para o crescimento em biofilme essa diferença só pode ser observada a partir de 16 µg/ml, enquanto para o planctônico foi observada essa redução de crescimento a partir de 4 µg/ml (Fig. 16). Apesar da mínima redução observada, esses resultados confirmam, que para o controle do biofilme, são necessárias concentrações superiores de peptídeos, como discutido acima.

O peptídeo Hya-1 apresentou a mesma proporção de redução de crescimento como observado com AR0610. Entretanto a redução com Hya-1 já pode ser observada a 2 µg/ml, em ambas as condições de crescimento (Fig. 17), mostrando que este peptídeo é mais efetivo para o controle de Xf.

Para os peptídeos CJ0715, EC0604, SC0902 e PE1106 não foi observado efeito antimicrobiano sobre a bactéria (Fig. 18,19,20 e 21).

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Figura 16. Determinação de MBC (UFC/ml) do peptídeo AR0610 sobre X.

fastidiosa em condições de crescimento planctônico e biofilme. (0µg/ml) controle

positivo – somente a bactéria. Média de três repetições. As barras representam o erro padrão das médias.

Figura 17. Determinação de MBC (UFC/ml) do peptídeo Hya-1 sobre X.

fastidiosa em condiçõess de crescimento planctônico e biofilme. (0µg/ml) controle

positivo – somente a bactéria. Média de três repetições. As barras representam o erro padrão das médias.

1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 planctônico biofilme 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 planctônico biofilme

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Figura 18. Determinação de MBC (UFC/ml) do peptídeo CJ0715 sobre X.

fastidiosa em condições de crescimento planctônico e biofilme. (0µg/ml) controle

positivo – somente a bactéria. Média de três repetições. As barras representam o erro padrão das médias.

Figura 19. Determinação de MBC (UFC/ml) do peptídeo EC0604 sobre X.

fastidiosa em condições de crescimento planctônico e biofilme. (0 µg/ml) controle

positivo– somente a bactéria. Média de três repetições. As barras representam o erro padrão das médias.

1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 planctônico biofilme 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 planctônico biofilme

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Figura 20. Determinação de MBC (UFC/ml) do peptídeo SC0902 sobre X.

fastidiosa em condições de crescimento planctônico e biofilme. (0µg/ml) controle

positivo – somente a bactéria. Média de três repetições. As barras representam o erro padrão.

Figura 21. Determinação de MBC (UFC/ml) do peptídeo PE1106 sobre X.

fastidiosa em condições de crescimento planctônico e biofilme. (0µg/ml) controle

positivo – somente a bactéria. Média de três repetições. As barras representam o erro padrão das médias.

1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 planctônico biofilme 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 planctônico biofilme

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13 Avaliação da fitotoxicidade dos peptídeos

Ensaios biológicos para o monitoramento da bioatividade de diversas moléculas tem sido frequentemente incorporada à identificação e monitoramento de substâncias potencialmente tóxicas às plantas (Noldin et al., 2003). Assim, com o propósito de verificar o potencial fitotóxtico dos peptídeos Makovitzki et al (2007) avaliaram a toxicidade do peptídeo C14-KLLK e melittina (controle positivo) em folhas de tabaco a concentrações de 30, 60 e 120 µg/ml. Após 12h, as folhas começaram a secar no ponto de inoculação, e depois de 24h houve necrose. Já nas folhas com C14-KLLK, nenhum sintoma de necrose pode ser observado.

Neste trabalho foi realizado a análise de fitotoxicidade somente para os peptídeos que apresentaram os melhores efeitos antimicrobianos (CJ0714, Hya- 1, SC0902, EC0604, PE1106 e PE1105) sobre as bactérias avaliadas. A análise de toxicidade foi realizada em folhas de laranja doce com as concentrações de 64 e 128 µg/ml. Após 7dpi, não foram observadas nenhuma lesão ou alteração nos tecidos foliares (Fig. 22).

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Figura 22. Avaliação da fitotoxicidade dos peptídeos em folhas de laranja doce

CJ0714, Hya-1 (Controle positivo), SC0902, EC0604, PE1106 e PE1105 para as concentrações de 128 e 64 µg/ml após 7 dpi.

14 Avaliação da MBC dos peptídeos para Xcc em folhas destacadas

Os peptídeos capazes de eliminar completamente o crescimento de Xcc nos experimentos in vitro foram utilizados para os testes em folhas destacadas. Para isso foram utilizadas as mesmas concentrações dos experimentos in vitro de células bacterianas (104 UFC/ml) e a MBC de cada AMP. Com o propósito de visualizar o crescimento bacteriano dentro da planta foi utilizado como controle positivo a bactéria Xcc marcada com a proteína fluorescente GFP.

Aproximadamente 10 µl da mistura, suspensão bacteriana e peptídeos foram inoculadas nas folhas de laranja doce. Utilizou-se quatro folhas para a inoculação de cada peptídeo, e em cada folha foram feitos três pontos de

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inoculação. Os sintomas foram avaliados qualitativamente, ao sétimo dias após a inoculação (Fig. 23 e 24) e no décimo quarto dia foi feito o isolamento da área inoculada e diluição seriada até 10-8 _{(Fig. 25 e 26).}

Para o peptídeo PE1106, o teste in vitro não foi eficiente no controle de

Xcc, porém por se tratar de um peptídeo de citros foram realizados testes em

folha destacada para 128, 256 e 512 µg/ml. Nenhuma das concentrações avaliadas foi eficiente para o controle de Xcc. Somente os tratamentos com o PE 1106 e o controle positivo para o crescimento bacteriano (Xcc sem peptídeo antimicrobiano) apresentaram colônias isoladas na ordem de 1011 UFC/ml (Fig. 25 e 26). O tampão PBS utilizado para preparar a célula bacteriana na concentração desejada, foi o controle negativo do experimento. O peptídeo Hya-1 foi utilizado como controle positivo.

Os experimentos em folhas destacadas (Fig. 23 a 26) mostraram que os PAMs SC0902, AR0610, CJ0715, EC0604, CJ0714 e PE1105, foram eficientes na inibição do crescimento bacteriano, já que não foi possível a observação de sintomas da doença de cancro cítrico (Fig. 23 e 25) e da fluorescência devido a marcação da bactéria com GFP (Fig. 24 e 26). Além disso, o isolamento bacteriano dos tecidos foliares só foram possíveis para o PE1106 e para o controle (somente a bactéria). Esses resulatdos corroboram com os dados obtidos

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Figura 23 (A e B). Efeito dos peptídeos sobre Xcc em folhas de laranja doce

destacadas, 7 dias após a inoculação. Xcc – controle positivo para o crescimento bacteriano; PBS – Tampão fosfato salino como controle negativo.

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Figura 24 (A e B). Efeito dos peptídeos sobre WT306 (Xcc – GFP) em folhas de

laranja doce destacadas, 7 dias após a inoculação. As setas indicam o ponto de inoculação. WT306 (Xcc – GFP) – controle positivo para o crescimento bacteriano; PBS – Tampão fosfato salino como controle negativo.

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Figura 25 (A e B). Efeito dos peptídeos sobre Xcc em folhas de laranja doce

destacadas, 14 dias após a inoculação. Xcc – controle positivo para o crescimento bacteriano; PBS – Tampão fosfato salino como controle negativo.

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Figura 26 (A e B). Efeito dos peptídeos sobre WT306 (Xcc – GFP) em folhas de

laranja doce destacadas,14 dias após a inoculação. As setas indicam o ponto de inoculação. WT306 (Xcc – GFP) – controle positivo para o crescimento bacteriano; PBS – Tampão fosfato salino como controle negativo.

A

B

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