S. meliloti
19.4 RT-PCR, ELISA e sequenciamento
O sequenciamento realizado possibilitou a confirmação da inserção da sequência do AMP no vetor viral, assegurando todos os passos desde a clonagem no vetor viral do CTV até as plantas inoculadas de citros com a construção CTV + AMP, onde pode ser detectada a expressão do AMP. Para verificar se o peptídeo estava sendo expresso nas plantas a reação de RT-PCR foi realizada (Fig. 45). As plantas ELISA positivas foram utilizadas para a avaliação do efeito da expressão dos peptídeos sobre a bactéria Ca. Liberibacter asiaticus, descrito no item a seguir.
107
Figura 45. RT-PCR de plantas de citros para a detecção da expressão dos peptídeos em citros – (1) EC0604;(2) SC0902; (3) PE1106; (4) CitGASA-CS; (5) TGFP (Controle positivo).
20 Avaliação do efeito dos peptídeos sobre HLB in planta e em Diaphorina citri
Após 90 dias da infestação das plantas com D. citri (psilídeos) HLB
positivos foram realizadas duas amostragens (Ramos B e C) a partir do ramo
infestado ( A), ou seja, ramo da planta onde os psilídeos foram colocados para se
alimentarem. O ramo A foi acidentalmente removido e, portanto, não utilizado para
as análises de detecção da bactéria nas plantas contendo as construções CTV
com a presença dos peptídeos. Para a realização do diagnóstico de CaLas em
M 1 2 3 4 5
108
plantas foi realizado RT-qPCR. A avaliação por RT-qPCR foi realizada através dos
valores CtB (Ramo B) e Ctc (Ramo C), onde a bactéria já pode ser detectada no
começo da reação em torno do ciclo número 20, e que a remoção do ramo
infestado (A), não afetou a quantificação.
Além da avaliação in planta, foi realizada uma avaliação nos psilídeos 15
dias após terem sido colocados nas plantas, com o objetivo de verificar se os
peptídeos expressos in planta poderiam estar atuando sobre Ca.Liberibacter
asiaticus no inseto. Análises foram realizadas aos 30 dias para verificar se esses
peptídeos poderiam ter algum efeito sobre a transmissão da bactéria para
progênies do inseto vetor subsequentes. As análises foram realizadas para a fase
adulto do inseto. Com isso, pode-se observar uma porcentagem de psilídeos que
se mantiveram positivos para HLB (Tab. 19).
Dos 75 psilídeos colocados para cada experimento foi possível recuperar
diferentes quantidades de psilídeos aos 15 dias, por exemplo, para o PAM
SC0902 foram recuperados 48 insetos, dos quais 17% apresentavam positivos
para CaLas. Aos 30 dias obteve-se os valores estimados de 17 a 33% de
psílideos positivos, para mais de cem psilídeos amostrados. No caso do peptídeo
CitGASA-CS, aos 15 dias, foi possível recuperar os 75 psilídeos e somente 8%
109
multiplicada na progênie subsequente (mais de cem psilídeos amostrados), e essa
detecção passou para 21 % após 30 dias (Tab. 19).
Já para o peptídeo PE1106, dos 75 psilídeos foi possível recuperar 34, dos
quais 17% eram positivos. Apesar disso, não foi possível detectar a bactéria nas
progênies (número de psilídeos amostrados menor que 100), ou seja, o peptídeo
pode ter atuado de alguma forma no inseto, de modo, que alterou o processo de
transmissão da bactéria para a próxima geração.
Estudos para verificar a transmissão transovariana de CaLas pelo psilídeo
D. Citri foram conduzidos por Pelz-Stelinski et al. (2010) que demonstraram que este tipo de transmissão varia de 2 a 6%. A transmissão varia de acordo com o
estágio de desenvolvimento do inseto, sendo que a fase de ninfa é a que
apresenta maior eficiência de transmissão, em torno de 6,3%. Já a fase de ovo e
adulto, esse valor é de 2 e 2,4% respectivamente. Comparando os dados obtidos
por Pelz-Stelinski et al. (2010) e com os apresentados nesta tese, pode-se dizer
que a transmissão transovariana foi alta para os peptídeos SC0902, CitGASA-CS
e EC0604, após 30 dai. Já para o peptídeo PE1106, a porcentagem de
110
Tabela 19. Detecção de CaLas por RT-qPCR, em plantas expressando os PAMs e ação destes sobre a presença da bactéria nos psilídeos.
Plantas Psilídeos
Repetições Peptídeo value CT A value CT B value CT C 15 dai 30 dai REP1 SC0902(MV) NA 20,68 19,26 17% 17-33% REP2 NA 20,75 23,38 (48/75) REP3 NA 31,79 35,11 REP1 PE1106 (MV) NA 18,25 21,65 17% 0% REP2 NA 32,18 34,87 REP3 NA 18,21 23,13 (34/75) REP4 NA 21,74 19,25 REP5 NA 32,61 31,92 REP1 SC0902(CM) NA 22,48 20,37 25% 29-42% REP2 NA 21,40 20,39 (53/75) REP3 NA 22,24 20,99 REP1 CitGASA-CS (CM) NA 20,52 19,80 8% 21% (75/75) REP1 EC0604 (CM) NA 20,59 20,63 25% 13% REP2 NA 21,37 20,21 (36/75)
111 21 Conclusões
- Os peptídeos SC0902, CJ0714, Hya-1, C0715, EC0604, AR0610 e PE1105 apresentaram resultados coerentes e efetivos para experimentos in vitro e em folha destacada para Xcc.
- Para os experimentos em planta com Xcc, os peptídeos CJ0714, AR0610 e PE1105, apresentaram respostas diferentes aos obtidos in vitro e emfolha desatacada. Nesse caso a meia vida do PAM pode ter sido afetada por proteases, outros compostos presentes no interior da planta e as condições de casa de vegetação;
- Os dados obtidos para S. meliloti e R.radiobacter mostram o possível efeito dos PAMs sobre HLB. A utilização do vetor viral do CTV é de extrema importância pela rapidez e versatilidade para obtenção de resultados (transformação de plantas). -Para X. fastidiosa nenhum peptídeo avaliado apresentou controle significativo do patógeno. Dois peptídeos, AR0610 e Hya-1 apresentaram atividade inibitória da ordem de 10 X para o crescimento planctônico e bioflme.
- Os peptídeos (CJ0714, EC0604 e Hya-1) que apresentam boa atividade antimicrobiana para a maioria das bactérias e alta atividade hemolítica, não são recomendados para utilização em processos de transformação de plantas, devido ao risco a saúde humana;
- O peptídeo PE1105 obtido de sequências de ESTs depositadas no CitEST, pode ser considerado um dos peptídeos mais interessantes, já que apresentou atividade antimicrobiana para Xcc e nenhum efeito citotóxico. Dessa forma, esse peptídeo poderia ser utilizado para a cisgenia, que é a transformação de plantas,
112
utilizando genes da própria espécie, apresentando uma melhor aceitação pelo público.
- O peptídeo SC0902 apresentou bons resultados para o contole in vitro de Xanthomonas citri subsp. citri e S. meliloti. Em relação aos testes de avaliação de citotoxicidade, este peptídeo apresentou alta taxa de desgranulação de mastócitos. Entretanto, antes de descartar o uso deste peptídeo para a transformação de plantas, testes como os já realizados com um maior número de repetições.
113 22 Considerações Finais
- Mudanças na sequência de aminoácidos, assim como a mudança de conformação de L–aa para D-aa, podem reduzir, eliminar ou aumentar a atividade antimirobiana, assim como os efeitos citotóxicos. Dessa forma, peptídeos que apresentaram bons resultados neste trabalho em relação à atividade antimicrobiana e resultados não satisfatórios para os testes de citotoxicidade, podem ter suas configurações alteradas para que mantenham ou incrementem a atividade como AMP e reduzam a atividade tóxica dessas moléculas aos humanos.
114 23 Referências Bibliográficas
Agüero, J. et al. Development of viral vectors based on Citrus leaf blotch virus to express foreign proteins or analyze gene function in citrus plants. Molecular plant-microbe
interactions, v. 25, p. 1326–37, 2012.
Albrecht, U. e Bowman, K. D. Transcriptional response of susceptible and tolerant citrus to infection with Candidatus Liberibacter asiaticus. Plant science : an international journal
of experimental plant biology, v. 185-186, p. 118–30, 2012.
Akbarzadeh, A. et al. Liposome: classification, preparation, and Applications. Nanoscale
Research Letters, v. 8, p.2-9, 2013.
Amarnath, S. e Sharma, U.S. Liposomes in drug delivery: progress and limitations.
International Journal of Pharmaceutics, v.154, p.23–140, 1997..
Amaral, A.M. Cancro cítrico: permanente preocupação da citricultura no Brasil e no mundo. Comunicado Técnico Embrapa. n.86, p. 1-5, 2003.
Amaro, A.A. et al. Caminhos para a citricultura: uma agenda para manter a liderança mundial. São Paulo: Atlas, 2007.114p.
Aung, G. et al. Catestatin, a neuroendocrine antimicrobial peptide, induces human mast cell migration, degranulation and production of cytokines and chemokines. Immunology, v. 132, p. 527–39, 2011.
Associtrus. Disponível em:http://www.associtrus.com.br/Resolucao_SAA-147_31-10- 2013.pdf. Acesso em 31 Mar. 2014.
Araújo, W.L. et al. Diversity of endophytic bacterial populations and their interactions with
Xylella fastidiosa in citrus plants. Applied and environmental Microbiology, v.10, p.
4906-4914, 2002.
Becker, A. e Lange, M. VIGS – genomics goes functional. Trends in Plant Science. v. 15,p.1–4, 2010.
Belasque Junior, J. et al. Adult citrus leafminers (Phyllocnistis citrella) are not efficient
vectors for Xanthomonas axonopodis pv. citri. Plant disease, v. 89, p.590 - 594, 2005.
Belasque Junior, J. et al. Controlde do huanglobing no estado de São Paulo, Brasil.
Citrus Research & Technology, v. 31, p.53 - 64, 2010.
Berrocal - Lobo, M. et al. Snakin-2 , an Antimicrobial Peptide from Potato Whose Gene Is Locally Induced by Wounding and Responds to Pathogen Infection. Plant Phtsiology,v. 128, , p. 951–961, 2002.
115
Bessale , R. et al. All-D-magainin: chirality, antimicrobial activity and proteolytic resistance. FEBS Letters, v.274, p.151–155, 1990.
Bitancourt, A.A. O cancro cítrico. Biológico. n. 23, p. 101-111, 1957.
Bové, J.M. Huanglobing: A destructive, newly - emerging century - old disease of citrus.
Journal of Plant Pathology, v.88, n.1, p. 7-37, 2006.
Brown, K. Florida fights to stpos citrus canker. Science, v. 292, p. 2275-2278, 2001. Brand, G.D. Estratégias para prospecção e predição de peptídeos bioativos. 2007. 217p. Tese de Doutorado – Universidade de Brasília, UNB, Brasília.
Brender, J. R. et al. Does cholesterol play a role in the bacterial selectivity of antimicrobial peptides? Frontiers in immunology, v. 3, p. 195, 2012.
Brodgen, K.A. Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?
Nature, v.3, p. 238-248, 2005.
Brotman, Y. et al. Synthetic ultrashort cationic lipopeptides induce systemic plant defense responses against bacterial and fungal pathogens. Applied Environmental
Microbiology, v.75, p.5373–5379, 2009.
Callaway, E. Bioterror: The green menace. Nature, v.452, p.148-150, 2008.
Cammue, B.P.A. et al. A Potent Antimicrobial Protein from Onion Seeds Showing Sequence Homology to Plant Lipid Transfer Proteins. Plant Physiology,v.109, p. 445- 455, 1995.
Castro, M. S. et al. Hylin a1, the first cytolytic peptide isolated from the arboreal South American frog Hypsiboas albopunctatus (“spotted treefrog”). Peptides, v. 30, p. 291–296, 2009.
Christie, S.R. et al.Electron Microscopy of Negatively Stained Clarified Viral Concentrates Obtained from Small Tissue Samples with Appendices on Negative Staining Techniques, University of Florida, Gainesville,Agricultural Experiment Station Institute of Food and Agricultural Sciences - Institute of Food and Agricultural Sciences, 1987, Bulettin 872, 16p. Cilli, E. M. et al. Correlations between differences in amino-terminal sequences and different hemolytic activity of sticholysins. Toxicon : official journal of the International
Society on Toxinology, v. 50, p. 1201–1204, 2007.
Civerolo, E.L. Citrus bacterial canker disease: The bacterium Xanthomonas campestris pv.
citri. In: Citrus Canker: am international perepective, Lake Alfred: Citrus Research and
Education Center, University of Florida, p.11-17.
Coletta Filho, H.D. e Machado, M.A. Hospedeiros, transmissão e técnicas de diagnósticos da bactéria Xylella fastidiosa. Laranja, v.22, p.121-132, 2001.
116
Coletta Filho, H.D.et al. First report of the causal agent of huanglongbing ("Candidatus Liberibacter asiaticus") in Brazil. Plant Disease, v.88, p. 13823-13822, 2004.
Costerton, J.W. et al. Microbial Biofilms. Annual Review Microbiology, v.49, p.711-745, 1995.
Crusca, E. et al. Influence of N-terminus modifications on the biological activity, membrane interaction, and secondary structure of the antimicrobial peptide hylin-a1. Biopolymers, v. 96, p. 41–48, 2011.
Cruvinel, W. D. M. et al. Sistema Imunitário – Parte I Fundamentos da imunidade inata com ênfase nos mecanismos moleculares e celulares da resposta inflamatória. Revista Brasileira de Reumatologia, v. 50,p. 434-461, 2010.
Dathe, M. e Wieprecht, T. Structural features of helical antimicrobial peptides: their potential to modulate activity on model membranes and biological cells." Biochimestry
Biophysics Acta. v.1462, p.71-87, 1999.
Dawson, W. O. e Folimonova, S. Y. Virus-based transient expression vectors for woody crops: a new frontier for vector design and use. Annual review of phytopathology, v. 51, p. 321–37, 2013.
DePaulo, J.J. e Powell, C.A. Extraction of double-stranded RNA from plant tissue without the use of organic solvents. Plant Disease, v. 79, p. 246-248, 1995.
De Souza, A.A. e Muller, G.W. A premunização no controle da tristeza dos citros.
LARANJA, v. 27,p. 57-70,2006.
Dimova, R. et al. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. Journal of physics. Condensed matter : an Institute of Physics
journal, v. 18, p. 1151–76, 2006.
Doddapaneni, H. et al. Comparative phylogenomics and multi-gene cluster analyses of the Citrus Huanglongbing (HLB)-associated bacterium Candidatus Liberibacter. Biomed
Central research notes, v. 1, p. 72,. 2008.
Duan, Y. et al. Complete genome sequence of citrus huanglongbing bacterium, “Candidatus Liberibacter asiaticus” obtained through metagenomics. Molecular plant-
microbe interactions, v. 22, p. 1011–20, 2009.
Eisenberg, D.Three-dimensional structure of membrane and surface proteins. Annuary
Review Biochemistry, v. 53, p. 595-623, 1984.
Eisenbrand, G. et al. Methods of in vitro toxicology. Food and chemical toxicology : an
international journal published for the British Industrial Biological Research Association, v. 40,p. 193–236, 2002.
117
FAO.Statistical Yearbook. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Disponível em: http://www.fao.org./home/en/. Acesso em 05 Jan. 2014.
Ferre, R.; Badosa, E.; Feliu, L.; Planas, M.; Montesinos, E; Bardaji, E. Inhibition of Plant- Pathogenic bacteria by short synthetic Cecropin A – Melittin hybrid peptides. Applied and
Environmental Microbiolog, v.72, p. 3302-3308, 2006.
Folimonova, S. Y. et al. Examination of the responses of different genotypes of citrus to huanglongbing (citrus greening) under different conditions. Phytopathology, v. 99, p. 1346–54, 2009.
Fox, J. L. Antimicrobial peptides stage a comeback. Nature biotechnology, v. 31 , p. 379–82, 2013.
Francis, M. et al. Detached leaf inoculation of germplasm for rapid screening of resistance to citrus canker and citrus bacterial spot. European Journal of Plant Pathology, v. 127, p. 571–578, 2010.
Franco, O.L. et al. Identification of a cowpea c-thionin with bactericidal activity. FEBS
Journal, v.273, p.3489–3497, 2006.
Frézard, F. Liposomes: from biophysics to the design of peptide vaccines. Brazilian
Journal of Medical and Biological Research, v. 32, p. 181-189, 1999.
FUNDO DE DEFESA DA CITRICULTURA (Fundecitrus). Levantamentos Cancro cítrico. Disponível em: http://www.fundecitrus.com.br/levantamentos/cancro-citrico/7. Acesso em :31 Marc. 2014.
Garnsey, S.M. e Cambra, M., 1991. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for citrus pathogens. In: Roistacher, C.N. (Ed.), Graft-Transmissible Diseases of Citrus, Handbook for Detection and Diagnosis. FAO, Rome, 1991, p. 193–216.
Glukhov, E. et al. Basis for selectivity of cationic antimicrobial peptides for bacterial versus mammalian membranes. The Journal of biological chemistry, v. 280, p. 33960–7, 7 2005.
Gowda, S. et al. Characterization of the cis-acting elements controlling subgenomic mRNAs of citrus tristeza virus: production of positive- and negative-stranded 3’-terminal and positive-stranded 5’-terminal RNAs. Virology, v. 286, p. 134–151, 2001.
Gowda, S. et al. Transcrpition strategy in a closterovirus: A novel 5’-proximal controller element of citrus tristeza virus produces 5’- and 3’ terminal subgenomic RNAs and differs from 3’ open reading frane controller elements. Journal of Viriology v.77, p. 340-352, 2003.
118
Gowda, S. et al. Infection of Citrus Plants with Virions Generated in Nicotiana benthamiana Plants Agroinfiltrated with a Binary Vector Based Citrus tristeza virus. In: Proceedings 16th Conference IOCV , Riverside, CA: 2005, p.23-33.
Gravena, S. et al. Os vetores da Xylella fastidiosa. In: Donadio, L.C.; Moreira, C.S. Clorose Variegada dos Citros. Bebedouro: Estação Experimental de Citricultura. 1997a. 37-53.
Gravena, , S. et al. Manejo de cigarrinhas e CVC em pomares de citros. In: Donatto, L.C.; Moreira, C.S. Clorose Variegada dos Citros. Bebedouro: Estação Experimental de Citricultura. 1997b. 91-113.
GRUPO CULTIVAR. Disponível em:
http://www.grupocultivar.com.br/site/content/noticias/?q=31334#31334. Acesso em: 25 Set. 2013.
GRUPO CULTIVAR. CVC diminui nos pomares novos. Disponível em: http://www.grupocultivar.com.br/site/content/noticias/?q=36007#36007. Acesso em 25 Set. 2013.
Güell, I. et al. Improvement of the efficacy of linear undecapeptides against plant- pathogenic bacteria by incorporation of D-amino acids. Applied and environmental
microbiology, v. 77, p. 2667–75, 2011.
Guilhelmelli, F. et al. Antibiotic development challenges: the various mechanisms of action of antimicrobial peptides and of bacterial resistance. Frontiers in Microbiology, v.4, p. 4- 12, 2013.
Gutsmann, T. et al.Interaction of CAP18-derived peptides with membranes made from endotoxins or phospholipids. Biophysical Journal, v. 80, p. 2935–2945, 2001.
Hancock, R.E.W. Mechanisms of action of newer antibiotics for Gram-positive pathogens.
Lancet Infectious Disease,v. 5, p.:209–218, 2005.
Hung et al. Development of a rapid method for the diagnosis of citrus greening disease using the polymerase chain reaction. Journal Phytopathology. v.147, p. 599-604, 1999. Hung et al. Identification of alternative hosts of the fastidious bacterium causing citrus greening disease. Journal of Phytopathology, v. 148, p. 321-326, 2000.
Instituto de Economia Agrícola: Análise sobre os Mecanismos de Transmissão de
Preços nos Mercados de Laranja. Disponível em:
http://www.iea.sp.gov.br/out/LerTexto.php?codTexto=12123. Acesso: 23/08/2011.
Jacomino, A.P. et al. Transmissão controlada da clorose variegada dos citros (CVC).
119
Kamysz, W. et al. J.Novel properties of antimicrobial peptides. Acta Biochemistry
Polonica, v. 50, p.461–469, 2003.
Keymanesh, K. et al. Application of antimicrobial peptides in agriculture and food industry.
World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 25, p. 933–944, 2009.
Kobayashi, S. et al.Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochemistry, v. 43, p. 15610-6, 2004.
Kuroda, K. e Caputo, G. A. Antimicrobial polymers as synthetic mimics of host-defense peptides. Wiley interdisciplinary reviews. Nanomedicine and nanobiotechnology, v. 5, p. 49–66, 2013.
Lanna - Filho, R. et al. Induced defense responses in tomato against bacterial spot by proteins synthesized by endophytic bacteria. Tropical Plant Pathology, v. 38, p.295-302, 2013.
Laranjeira, F.F. et al. Avaliação serolólogica e sintomatológica da ocorrência de Xylella
fastidiosa e clorose variegada dos citros (CVC) no banco ativo de germoplasma do IAC.
Fitopatologia Brasileira, v. 21, p.335, 1996.
Laranjeira, F.F. et al. Seleção de variedades de citros tolerantes e/ou resistentes a clorose variegada dos citros. Fitopatologia Brasileira, v. 20, p.234,1995.
Laranjeira, F.F. et al. Fungos, procariotos e doenças abióticas. In: Mattos junior, D., De Negri, J.D., Pio, R.M. Pompeu Junior, J. (Ed). Citros. Campinas: Instituto Agronômico/ FUNDAG, 2005. p. 509-566.
Lee, S.B. et al. Expression and characterization of antimicrobial peptides Retrocyclin-101 and Protegrin-1 in chloroplasts to control viral and bacterial infections.Plant
Biotechnology Journal, v.9, p.100–115, 2011.
Li, W. et al. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. Journal of Microbiological
Methods, v. 66, p. 104–115, 2006.
Lico, C.et al.Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. Journal Cell
Physiology, v. 216, p. 366–377, 2008.
Lopes, S.A. et al Liberibacter associated with citrus huanglongbing in Brazil: Candidatus Liberibacter asiaticus in heat tolerant, Ca. L. americanus is heat sensitive. Plant Disease, v. 93,p. 257-263, 2009.
Lorenzón, E.Efeito do comprimento e da polaridade do espaçador entre cadeias do
peptídeo Hylina-C na forma dimérica. 2011. 71p. Dissertação de Mestrado -
120
Lorenzón, E. N. et al. Effects of dimerization on the structure and biological activity of antimicrobial peptide Ctx-Ha. Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 56, p. 3004– 10, 2012
Ma, Y. et al. Peptidomics and genomics analysis of novel antimicrobial peptides from the frog, Rana nigrovittata. Genomics, v. 95, p. 66–71, 2010.
Male D. et al. Immunology, 8 ed, Saunders, 2012,.455p.
Maji, S. et al. In vitro antimicrobial potentialities of different solvent extract of ethnomedicinal plants against clinically isolated human pathogens. Journal Of
Phytopathology, v.2,p.57-64, 2010.
Maróti, G. et al. E., Mergaert, P. Natural roles of antimicrobial peptides in microbes, plants and animals. Research Microbiology, v.162, p. 363-374, 2011.
Makovitzki, A. et al. Inhibition of fungal and bacterial plant pathogens in vitro and in planta with ultrashort cationic lipopeptides. Applied and environmental microbiology, v. 73, p. 6629–36, 2007.
Marques V.V. et al. Reaction of transgenic sweet orange plants expressing with STX-IA gene to CVC and HLB. Citrus Research & Tecnhonology, v. 31, p.60, 2010.
McClean, A.P.D. Tristeza virus of citrus: evidence for absence ofseed transmission. Plant
Disease Report, v. 41,p. 821, 1957.
Metcalfe, D. D. Mast cells and mastocytosis. Blood, v. 112, n. 4, p. 946–56,. 2008.
Montesinos, E. et al. Antimicrobial Peptides for Plant Disease Control . From Discovery to Application. In: Small Wonders: Peptides for Disease Control, RAJASEKARAN et al. ACS Symposium Series, American Chemical Society: Washington, DC, 2012, p. 235-261, 2012. Moreno, P. et al. Citrus tristeza virus: a pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology, v. 9,p. 251-225, 2008.
Moreno, P. e Ambrós, S. Bases para el control de las enfermedades causadas por el virus de la tristeza de los cítricos. Dossier cítricos. Vida Rural, p.30-35, 2011.
Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of immunological methods, v. 65, p. 55– 63, 1983.
Nascimento, A. et al. Purification, characterization and homology analysis of ocellatin 4, a cytolytic peptide from the skin secretion of the frog Leptodactylus ocellatus. Toxicon :
121
Navas-castilho, J. et al. Kinetics of accumulation of citrus tristeza virus RNAs. Virology, v.228, p. 92-97, 1997.
Niyonsaba, F. et al. Multifunctional antimicrobial proteins and peptides: natural activators of immune systems. Current pharmaceutical design, v. 15, p. 2393–413, 2009.
Niyonsaba, F. e Ogawa, H. Protective roles of the skin against infection: implication of naturally occurring human antimicrobial agents beta-defensins, cathelicidin LL-37 and lysozyme. Journal of dermatological science, v. 40, p. 157–68, 2005.
Nizet, V. Antimicrobial peptide resistance mechanisms of human bacterial pathogens.
Current issues in molecular biology, v. 8, p.11–26, 2006.
Noldin, V.F. et al. Composição química e atividade biológica de Cynara scolymus L. cultivada no Brasil. Química Nova, v.26, p.331-334, 2003.
Oard, S.V. e Enright, F.M..Expression of the antimicrobial peptides in plants to control phytopathogenic bacteria and fungi.Plant Cell Reports, v.25, p. 561–572, 2006.
Onuma, Y. et al. Identification of putative palytoxin as the cause of clupeotoxism. Toxicon, v. 37, p. 55–65, 1999.
Palazzo, D.A. e Carvalho, M.L.V. Desenvolvimento e progresso da clorose variegada dos citros (CVC) em pomares de Colina, SP. Laranja, v.13, p.489-502, 1992.
Parra, J.R.P. et al. Bioecologia do vetor Diaphorina citri e a transmissão de bactérias associadas ao huanglobing. Citrus Research & Technology, v.31, p.37-51, 2010.
Peltz-Stelinski, K.S. et al. Transmission Parameters fos Candidatus Liberibacter asiaticus by Asian Citus Psyllid (Hemiptera: Psyllidae). Journal of Economic Entomology, v. 105, p.1531-1541, 2010.
Picchi, D. G. et al.Peptídeos cíclicos de biomassa vegetal: características, diversidade, biossíntese e atividades biológicas.Quimica Nova, v. 32, p. 1262–1277, 2009.
Portieles, R. et al. NmDef02, a novel antimicrobial geneisolated from Nicotiana megalosiphon confers high-level pathogen resistance under greenhouse and field conditions.Plant Biotechnology Journal, v.8, p.678–690, 2010.
Patrzykat, A. et al. Sublethal concentrations of pleurocidin-derived antimicrobial peptides inhibit macromolecular synthesis in Escherichia coli. Antimicrobial Agents Chemotherapy, v. 46, p. 605-14, 2002.
Robertson, C.J.et al. Efficient infection of citrus plants with different cloned constructs of Citrus tristeza virus amplified in Nicotiana benthamiana protoplasts. In:Proceedings of