Avaliação por imunocitoquímica da via de ativação do inflamassoma NLRP3 em

Devido às dificuldades encontradas na padronização da técnica de Western- blotting, principalmente para a detecção das formas clivadas da IL-1β e da caspase-1,

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realizamos alguns experimentos de imunocitoquímica a fim de detectar essas moléculas por outra metodologia. Para isso, em um primeiro momento utilizamos macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico, não estimulados ou estimulados com células leveduriformes de P. brasiliensis, com ou sem a adição do inibidor específico de caspase-1 (Z-WEHD- FMK). Nas figuras abaixo, estão demonstrados resultados representativos dos experimentos realizados, no qual avaliamos a expressão de NLRP3, ASC, capase-1 (nativa e clivada), IL- 1β (nativa e clivada) e IL-18.

Na figura 18 é possível observar que macrófagos não estimulados apresentam marcação fraca para NLRP3, e que após o estímulo, a marcação das células fica mais evidente. O uso do inibidor de caspase-1 (Z-WEHD-FMK) aparentemente não interfere com a produção dessa molécula. É interessante notar que na presença do fungo, os macrófagos se associam, formando aglomerados de células ao redor das leveduras. Também é possível observar a presença de alguns fungos no interior do citoplasma das células.

Em relação à molécula adaptadora ASC, observamos que as células não estimuladas apresentam marcação fraca, com distribuição homogênea, e que após o estímulo aparentemente ocorre uma maior marcação, principalmente ao redor das leveduras do fungo. O tratamento das células com o inibidor de caspase-1 aparentemente não interfere com a expressão dessa molécula.

Para a marcação para detecção de caspase-1 (nativa) observamos fenômeno semelhante. Conforme pode ser observado, células não estimuladas apresentam marcação muito fraca, enquanto após o estímulo ocorre uma forte marcação em algumas regiões das células (setas). É interessante notar que o tratamento das células com o inibidor de caspase- 1, levou à uma diminuição da marcação. Em relação à expressão da caspase-1 clivada,

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observamos que o estímulo com o fungo, levou a um aumento na marcação das células, e que a presença do inibidor de caspase-1 levou a uma diminuição dessa marcação.

Também analisamos a produção das citocinas (IL-1β e IL-18) pelos macrófagos. Pudemos observar que macrófagos estimulados com leveduras de P. brasiliensis apresentam maior marcação para IL-1β e IL-18, em comparação às células não estimuladas, e que a presença do inibidor de caspase-1 leva a uma diminuição da marcação (principalmente da IL-18).

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Figura 18 (página anterior) - Análise por imunocitoquímica da expressão de NLRP3, ASC, caspase-1 (nativa), caspase-1 (clivada), IL-1β e IL-18 em macrófagos mantidos sem estímulo ou estimulados com células leveduriformes de P. brasiliensis (cepa Pb18 - razão 1:1). As células foram estimuladas por 6 horas na presença ou ausência do inibidor específico de caspase-1 (Z-WEHD-FMK) (25 ng/mL - R&D Systems). Marcação com DAB e contra coloração com hematoxilina. Aumento 1000X.

Com relação as células dendríticas, realizamos culturas nas quais além do inibidor de caspase-1 (Z-WEHD-FMK), testamos outros inibidores de caspase-1 (Z-VAD-FMK, VX- 795), o inibidor de NF-kB (Bay), o inibidor específico para NLRP3 (3,4-methylenedioxy- beta-nitrostyrene), o inibidor de ATPases de membrana (Bafilomicina), de bomba de prótons (Glibenclamida) e do antioxidante N-Acetyl-L-cysteine.

Em relação à expressão de NLRP3, foi possível observar que o estímulo com leveduras de P. brasiliensis levou à uma maior marcação para essa molécula e que os inibidores aparentemente não interferiram com essa marcação (figura 19).

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Figura 19 - Análise por imunocitoquímica da expressão de NLRP3 em DCs mantidas sem estímulo (A), ou estimuladas com células leveduriformes de P. brasiliensis (cepa Pb18 - razão 1:2) (B). As células foram estimuladas por 6 horas na presença ou ausência dos inibidores específico de caspase-1: Z-WEHD-FMK (C), VX-765 (D), e Z-VAD-FMK (E); com o inibidor do fator de transcrição NF-κB (Bay - F); com o inibidor específico para NLRP3 (3,4-methylenedioxy-beta-nitrostyrene - G); com o inibidor de ATPases de membrana (Bafilomicina - H); com o inibidor de bomba de prótons (Glibenclamida - I); e o antioxidante N-Acetyl-L-cysteine (J). Células contra-coradas com hematoxilina. Aumento 1000X.

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Em relação à Caspase-1 (pró-caspase 1), células não estimuladas apresentaram marcação muito fraca, enquanto que após a incubação com leveduras de P. brasiliensis, ocorre marcação maior e mais localizada em algumas regiões das células. É interessante notar que o tratamento das células com todos os inibidores levou à uma diminuição da marcação, embora as células tenham mantido uma marcação fraca (figura 20). Também é interessante notar que na presença do inibidor de NLRP3 (3,4-methylenedioxy-beta-nitrostyrene) há um deslocamento da marcação para o núcleo das células (Figura 20 G), sugerindo um acúmulo da caspase-1 (inativa) no núcleo e que, talvez, essa translocação pode ser responsável por uma diminuição da síntese de IL-1β.

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Figura 20: Análise por imunocitoquímica da expressão de Caspase-1 (pró-caspase 1) em DCs mantidas sem estímulo (A), ou estimulados com células leveduriformes de P.

brasiliensis (cepa Pb18 - razão 1:2) (B). As células foram estimuladas por 6 horas na presença

ou ausência dos inibidores específico de caspase-1: Z-WEHD-FMK (C), VX-765 (D), e Z- VAD-FMK (E); com o inibidor do fator de transcrição NF-κB (Bay - F); com o inibidor específico para NLRP3 (3,4-methylenedioxy-beta-nitrostyrene - G); com o inibidor de ATPases de membrana (Bafilomicina - H); com o inibidor de bomba de prótons (Glibenclamida - I); e o antioxidante N-Acetyl-L-cysteine (J). Células contra coradas com hematoxilina. Aumento 1000X.

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Com relação à caspase-1 clivada (ativa), células não estimuladas não apresentaram marcação, enquanto que após o estimulo com leveduras de P. brasiliensis, ocorre marcação em algumas regiões das células (Figura 21). Houve uma forte diminuição da marcação nas células previamente tratadas com todos os inibidores, exceto o VX-765 (Figura 21D). É interessante notar que o inibidor de Caspase-1 Z-VAD-FMK, o inibidor de NF-κB (Bay) e o inibidor de bomba de potássio (glibenclamida) levou à quase completa inibição da expressão (Figuras 21E, 21F e 21I respectivamente).

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Figura 21 - Análise por imunocitoquímica da expressão de Caspase-1 clivada em DCs mantidas sem estímulo (A), ou estimulados com células leveduriformes de P. brasiliensis (cepa Pb18 - razão 1:2) (B). As células foram estimuladas por 6 horas na presença ou ausência dos inibidores específico de caspase-1: Z-WEHD-FMK (C), VX-765 (D), e Z-VAD-FMK (E); com o inibidor do fator de transcrição NF-κB (Bay - F); com o inibidor específico para NLRP3 (3,4-methylenedioxy-beta-nitrostyrene - G); com o inibidor de ATPases de membrana (Bafilomicina - H); com o inibidor de bomba de prótons (Glibenclamida - I); e antioxidante N-Acetyl-L-cysteine (J). Células contra coradas com hematoxilina. Aumento 1000x.

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Também observamos, que DCs estimuladas com leveduras de P. brasiliensis apresentaram intensa marcação tanto para IL-1β (pró-IL1) (Figura 22) quanto para IL-1β clivada (ativa - Figura 23). O tratamento com os inibidores levou a diminuição da marcação para a forma inativa dessa citocina (figura 22). Enquanto que esses tratamentos praticamente eliminaram a marcação para a forma biologicamente ativa (figura 23).

Figura 22 - Análise por imunocitoquímica da expressão de IL-1β (pró-IL1) em DCs mantidas sem estímulo (A), ou estimulados com células leveduriformes de P. brasiliensis (cepa Pb18 - razão 1:2) (B). As células foram estimuladas por 6 horas na presença ou ausência dos inibidores específico de caspase-1 (Z-WEHD-FMK (C), Z-VAD-FMK (D), VX-765 (E)), com o inibidor do fator de transcrição NF-κB (Bay) (F) e com o inibidor de bomba de prótons (Glibenclamida) (G). Células contra-coradas com hematoxilina. Aumento 1000x.

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Figura 23 - Análise por imunocitoquímica da expressão de IL-1β clivada em DCs mantidas sem estímulo (A), ou estimulados com células leveduriformes de P. brasiliensis (cepa Pb18 - razão 1:2) (B). As células foram estimuladas por 6 horas na presença ou ausência dos inibidores específico de caspase-1: Z-WEHD-FMK (C), VX-765 (D), e Z-VAD-FMK (E); com o inibidor do fator de transcrição NF-κB (Bay - F); com o inibidor específico para NLRP3 (3,4-methylenedioxy-beta-nitrostyrene - G); com o inibidor de ATPases de membrana (Bafilomicina - H); com o inibidor de bomba de prótons (Glibenclamida - I); e antioxidante N-Acetyl-L-cysteine (J). Células contra-coradas com hematoxilina. Aumento 1000x.

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4.6.3 Avaliação por microscopia confocal da via de ativação do inflamassoma NLRP3