Estudo da participação do inflamassoma NLRP3 na resposta inflamatória induzida pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis

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Lívia Furquim de Castro

Estudo da participação do inflamassoma NLRP3 na resposta inflamatória

induzida pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis.

CAMPINAS 2015

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Ciências Médicas

Lívia Furquim de Castro

Estudo da participação do inflamassoma NLRP3 na resposta inflamatória induzida pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis.

Dissertação de Mestrado apresentada à Pós-graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências Médicas na área de concentração Ciências Biomédicas. Sob orientação do Prof. Dr. Ronei Luciano Mamoni.

ORIENTADOR: Prof. Dr. Ronei Luciano Mamoni ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA

ALUNA LÍVIA FURQUIM DE CASTRO, E ORIENTADO PELO PROF. DR. RONEI LUCIANO MAMONI

CAMPINAS 2015

vii RESUMO

Diversos estudos demonstram que a resposta inflamatória é de extrema importância para o controle da Paracoccidioidomicose (PCM). Essa resposta inflamatória é iniciada pelo reconhecimento das células fúngicas por receptores expressos por células do sistema imunológico inato. Dentre esses receptores, o NLRP3 foi associado com o reconhecimento de fungos patogênicos em modelos experimentais, atuando em conjunto com o TLR2 e a dectina-1. O NLRP3 atua na formação de um complexo multiproteico denominado inflamassoma, o qual ativa a caspase-1, que é responsável pela produção das formas ativas de duas importantes citocinas inflamatórias: a IL-1β e a IL-18. Esse estudo teve por objetivo investigar o envolvimento do NLRP3 na ativação da resposta inflamatória de macrófagos e células dendríticas humanas (DCs) derivadas de monócitos em resposta ao Paracoccidioides

brasiliensis (Pb), além de avaliar a participação do NLRP3 na indução da resposta

imunológica adaptativa. Nossos resultados demonstraram que células de lesões de pacientes com PCM (mucosa oral ou linfonodos) apresentam produção de IL-1beta, IL-18 e IL-37 e que macrófagos dessas lesões são positivos para Caspase-1 e NLRP3. Também fomos capazes de demonstrar que o reconhecimento de células leveduriformes por DCs e macrófagos humanos leva à ativação do inflamassoma NLRP3 e consequente produção de IL-1 e IL-18. Esse reconhecimento envolve a participação de receptores de superfície (TLR2 e Dectina-1), sendo que a produção dessas citocinas é dependente da sinalização via dectina-1 e fosforilação da proteína Syk. Além disso, observamos que a ativação do inflamassoma NLRP3, após o reconhecimento do fungo, envolve como principais mecanismos a produção de ROS e o efluxo de K+. Nossos dados também demonstraram que o inflamassoma NLRP3 é essencial para a diferenciação de células Th17 e Th1 e que sua inibição leva à um aumento de células Th2 e Treg. Em conjunto nossos dados indicam que a ativação do NLRP3

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desempenha um papel importante, tanto na indução de uma resposta inflamatória inicial, quanto no desenvolvimento de uma resposta adquirida que pode ser associada à resistência à infecção pelo P. brasiliensis.

ix ABSTRACT

Several studies have shown that the inflammatory response is crucial for the control of paracoccidioidomycosis (PCM). This inflammatory response is initiated by the recognition of fungal yeast cells by receptors expressed by cells of the innate immune system. Among these receptors, NLRP3 was associated with the recognition of pathogenic fungi in experimental models, working in conjunction with TLR2 and dectin-1. The NLRP3 acts forming a multiproteic complex called inflammasome, which activates caspase-1, and the production of the active forms of two important cytokines: IL-1β and IL-18. This study aimed to investigate the involvement of NLRP3 activation in the inflammatory response of macrophages and human dendritic cells (DCs) derived from monocytes, in response to

Paracoccidioides brasiliensis (Pb), and to evaluate the participation of NLRP3 in the

induction of the subsequent adaptive immune response. Our results demonstrated that cells of lesions from PCM patients (oral mucosa and lymph nodes) express IL-1beta, IL-18 and IL-37, and that macrophages in these lesions are positive for caspase-1 and NLRP3. We were also able to demonstrate that the recognition of Pb yeast cells by human macrophages and DCs leads to the NLRP3 inflammasome activation and production of IL-1 and IL-18. This recognition involves the participation of surface receptors (TLR2 and Dectin-1), and the production of these cytokines was dependent on signaling via dectin-1 and phosphorylation of Syk. In addition, we observed that the activation of the NLRP3 inflammasome, after recognition of the fungus, involves as main mechanisms the ROS production and the K+ efflux. Our data also demonstrate that the NLRP3 inflammasome are essential for the differentiation of Th1 and Th17 cells and its inhibition leads to an increased frequency of Th2 and Treg cells. Taken together our data indicated that activation of NLRP3 present an important role in both the induction of an initial inflammatory response, and in the

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development of an acquired immune response, which can be associated with the resistance to the P. brasiliensis infection.

xi

Sumário

RESUMO ... vii

ABSTRACT ... ix

LISTA DE ILUSTRAÇÕES ... xvii

LISTA DE ABREVIATURAS ... xxiii

1. INTRODUÇÃO ... 1 2. OBJETIVOS ... 13 2.1 Objetivos gerais ... 13 2.2 Objetivos específico ... 13 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 15 3.1. Casuística. ... 15 3.2. Imuno-histoquímica. ... 16

3.3. Obtenção de leveduras de P. brasiliensis. ... 17

3.4. Obtenção de monócitos (células CD14+_{) por separação imunomagnética a partir de} células mononucleares do sangue periférico (CMSPs).... 18

3.5. Diferenciação de células dendríticas (DCs) e de macrófagos a partis de monócitos (células CD14+_{). ... 18}

3.6. Condições de cultura. ... 19

3.7. Análise por western-blotting. ... 21

3.8. Avaliação da produção de IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-17, IL-4 e IL-22 em sobrenadantes de cultura por ELISA. ... 22

3.8.1. Dosagem de IL-18 no sobrenadante de cultura de DCs e macrófagos. ... 22

3.9. Análise da expressão do RNAm por qRT-PCR. ... 23

3.9.1. Extração de RNA. ... 23

3.9.2. Síntese de cDNA. ... 24

3.9.3. Protocolo de qRT-PCR. ... 24

3.10. Imunocitoquímica. ... 26

3.11. Microscopia Confocal ... 28

3.11.1 Avaliação da microscopia confocal. ... 30

3.12. Avaliação da participação do inflamassoma NLRP3 na diferenciação de linfócitos

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3.13. Imunofluorescência para análise de células por citometria de fluxo. ... 31

3.14. Análise Estatística ... 32

4. RESULTADOS ... 35

4.1 Descrição microscópica dos cortes histológicos ... 35

4.2 Análise da presença de células positivas para 1β, 18, Caspase-1, NLRP3 e IL-37 na Mucosa Oral e Linfonodos de pacientes com a Paracoccidioidomicose (PCM) em comparação com cortes histológicos de amostras de pacientes com processo inflamatório leve, sem relação com a PCM. ... 36

4.3 Análise da expressão do RNAm para IL-1β, IL-18, Caspase-1, NLRP3, ASC e TNF-α por macrófagos e células dendríticas. ... 44

4.4 Análise da produção de IL-1β, IL-18 e TNF-α no sobrenadante de cultura de Macrófagos e Células Dendríticas. ... 46

4.5 Avaliação da participação dos receptores de superfície (TLR2 e dectina-1) na produção de IL-1β e IL-18. ... 47

4.5.1 Avaliação da fosforilação das proteínas Syk e Erk por meio da técnica de Western-blotting/Imunoblot. ... 47

4.5.2 Avaliação da fosforilação da proteína Syk por microscopia confocal. ... 48

4.5.3 Avaliação da produção de IL-1, IL-18 e TNF- por DCs e macrófagos após bloqueio de dectina-1 e TLR2. ... 51

4.6 Avaliação das vias de ativação do inflamassoma NLRP3. ... 54

4.6.1. Avaliação por Western-blotting da via de ativação do inflamassoma NLRP3 em Macrófagos e DCs estimulados com leveduras de P. brasiliensis. ... 54

4.6.2. Avaliação por imunocitoquímica da via de ativação do inflamassoma NLRP3 em Macrófagos e DCs estimulados com leveduras de P. brasiliensis. ... 56

4.6.3 Avaliação por microscopia confocal da via de ativação do inflamassoma NLRP3 em Macrófagos e DCs estimulados com leveduras de P. brasiliensis. ... 68

4.6.4. Avaliação da produção de IL-1β, IL-18 e TNF-α em sobrenadantes de cultura. ... 72

4.7 Análise da produção de IFN-γ, IL-17, IL-22, IL-4 e IL-10 no sobrenadante de coculturas de linfócitos incubados com Macrófagos e com Células Dendríticas estimuladas ou não por células leveduriformes de Paracoccidioides brasiliensis. ... 75

5 DISCUSSÃO ... 83

6 CONCLUSÃO ... 93

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DEDICATÓRIA

À Deus, Aos meus pais, por todo carinho, educação e apoio. A minha irmã e amiga Flávia e ao meu querido noivo Lucas por sua compreensão.

Com toda minha admiração, ao meu orientador Dr. Ronei, pela sua confiança, experiência e conhecimento, fundamental para minha formação. Sem eles, nada seria possível.

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AGRADECIMENTOS ______________________________________________________________________

Agradeço à Deus,

Aos meus pais Milton e Fernanda, os quais me incentivaram a estudar, me apoiaram em todos os momentos e acreditaram em mim. Por todo carinho, paciência e dedicação que tiveram comigo. À minha irmã Flávia, pela sua amizade e por estar sempre ao meu lado.

Com toda minha admiração, ao meu orientador Dr. Ronei Luciano Mamoni, por toda sua amizade, pela paciência e confiança que depositou em mim. Sempre presente nessa caminhada, me auxiliou esclarecendo minhas dúvidas e alertando para os problemas que poderiam aparecer. Por ser um exemplo de dedicação e amor a pesquisa, que sempre fará parte da minha vida. Obrigada.

À Dra. Maria Heloísa de Souza Lima Blotta, por me receber em seu laboratório, pelo aprendizado e pela disponibilidade em ajudar.

Aos amigos de laboratório, por toda amizade, carinho, companheirismo e pelos momentos de descontração que tornaram a realização desse trabalho mais prazerosa.

À Larissa e a Carol, as quais me ajudaram desde quando entrei no laboratório, me auxiliaram nos experimentos e práticas de laboratório e contribuíram diretamente para a realização desse trabalho. Ao Munir, pela troca de experiência, pela amizade, pelas risadas e pela sua colaboração com esse trabalho. Tive sorte em conhecer e trabalhar com eles.

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A Profa. Dra Ângela Maria Victoriano de Campos Soares da Unesp de Botucatu, a qual cedeu gentilmente a cepa do fungo Pb18. E a Luzia e Edson (funcionários do laboratório de Microbiologia), os quais cultivaram e mantiveram a cepa do fungo.

Ao Marcelo Bispo pela ajuda com a técnica de microscopia confocal. Ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fotônica Aplicada à Biologia Celular (INFABIC) pela assistência e ceder o Microscopio confocal.

Ao Dr. Alexandre Nowill por ceder o citômetro de fluxo para a leitura de alguns experimentos.

Aos doadores de sangue, sem os quais não seria possível realizar esse projeto.

E a todos aqueles que fizeram parte direta e indiretamente deste trabalho.

Agência Financiadora: Agradeço a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (Processos números 2013/24286-0 e 2013/03673-6), pela concessão da bolsa e pelo auxílio financeiro que contribui diretamente para realização desse trabalho.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES ______________________________________________________________________

Figura Descrição Página

1 Vias de ativação do Inflamassoma NLRP3...28 2 Cortes histológicos de linfonodos e mucosa oral de pacientes com PCM corados com hematoxilina/eosina...50 3 Análise por imuno-histoquímica da expressão de IL-18 em lesões de mucosa oral e de linfonodos de pacientes com PCM...51 4 Análise por imuno-histoquímica da expressão de IL-1β em lesões de mucosa oral e de linfonodos de pacientes com PCM em comparação com pacientes com processo inflamatório leve (mucosa) e câncer de tireoide (linfonodos)...52 5 Análise por imuno-histoquímica da expressão de NLRP3 em lesões de mucosa

oral e de linfonodos de pacientes com PCM em comparação com pacientes com processo inflamatório leve (mucosa) e câncer de tireoide (linfonodos)...54 6 Análise por imuno-histoquímica da expressão de Caspase-1 em lesões de mucosa

oral e de linfonodos de pacientes com PCM em comparação com biópsias de pacientes com processo inflamatório leve (mucosa) e câncer de tireoide (linfonodos)...55 7 Análise por imuno-histoquímica da expressão de IL-37 em lesões de mucosa oral

e de linfonodos de pacientes com PCM em comparação com biópsias de pacientes com processo inflamatório leve (mucosa) e câncer de tireoide (linfonodos)...57 8 Quantificação da expressão relativa do RNAm para IL-1β, IL-18, Caspase-1,

NLRP3, ASC, e TNF-α por macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico estimulados com células leveduriformes de P. brasiliensis...58

xviii

9 Quantificação da expressão relativa do RNAm para IL-1β, IL-18, Caspase-1, NLRP3, ASC, e TNF-α por células dendríticas derivadas de monócitos do sangue periférico estimulados com células leveduriformes de P. brasiliensis...59

10 Dosagem de IL-1β, IL-18 e TNF-α no sobrenadante de cultura de DCs e macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico, estimuladas ou não com leveduras de P. brasiliensis (Pb18) ...60 11 Análise da fosforilação das proteínas ERK e Syk em DCs não estimuladas e após diferentes estímulos: Curdlan (10μg/mL), Pam3CSK4 (1μg/mL) e leveduras de

P. brasiliensis, e células estimuladas com leveduras de Pb18 após o bloqueio dos

receptores TLR-2 (anti-TLR2) e dectina-1 (laminarina)...62 12 Análise por microscopia confocal da expressão de Syk fosforilada em DCs não estimuladas ou estimuladas com agonista de dectina-1, de TLR2 e leveduras de

P. brasiliensis e células estimuladas com leveduras de Pb18 após o bloqueio dos

receptores TLR-2 e Dectina-1 com anticorpos específicos...63 13 Análise quantitativa da intensidade média de fluorescência da marcação de Syk fosforilada (p-Syk), por meio de microscopia confocal...64 14 Dosagem de IL-1β no sobrenadante de cultura de DCs e macrófagos, estimulados ou não com leveduras de P. brasiliensis (Pb18), na presença dos anticorpos: anti-dectina-1 e anti-TLR2, e do inibidor de SykII...66 15 Dosagem de IL-18 no sobrenadante de cultura de DCs e macrófagos, estimulados ou não com leveduras de P. brasiliensis (Pb18), na presença dos anticorpos: anti-dectina-1 e anti-TLR2, e do inibidor de SykII...67 16 Dosagem de TNF-α no sobrenadante de cultura de DCs e macrófagos, estimulados ou não com leveduras de P. brasiliensis (Pb18), na presença dos anticorpos: anti-dectina-1 e anti-TLR2, e do inibidor de SykII...68 17 Análise da produção de caspase-1, IL-1β e IL-1β clivada por macrófagos e DCs estimulados (ou não) com células leveduriformes de P. brasiliensis, e macrófagos e DCs estimulados com leveduras de Pb18 na presença dos inibidores de caspase-1 (VX-765, Z-WEHD-FMK), do inibidor específico para NLRP3, inibidor de ATPases de membrana (Bafilomicina), inibidor de bomba de prótons

xix

(Glibenclamida), e inibidor de ROS (N-Acetil-L-cisteína)...70 18 Análise por imunocitoquímica da expressão de NLRP3, ASC, caspase-1 (nativa), caspase-1 (clivada), IL-1β e IL-18 em macrófagos mantidos sem estímulo ou estimulados com células leveduriformes de P. brasiliensis e macrófagos estimulados com leveduras de Pb18 após tratamento com inibidor específico de caspase-1 (Z-WEHD-FMK) ...73 19 Análise por imunocitoquímica da expressão de NLRP3 em DCs não estimulados ou estimulados com leveduras de P. brasiliensis, e DCs estimuladas com leveduras de Pb18 após tratamento com os inibidores de caspase-1 (Z-WEHD-FMK, VX-765 e Z-VAD-FMK); inibidor do fator de transcrição NF-κB (Bay); inibidor de NLRP3; inibidor de ATPases de membrana (Bafilomicina); inibidor de bomba de prótons (Glibenclamida); e inibidor de ROS (N-Acetil-L-cisteina)...75 20 Análise por imunocitoquímica da expressão de Caspase-1 em DCs não estimulados ou estimulados com leveduras de P. brasiliensis, e DCs estimuladas com leveduras de Pb18 após tratamento com os inibidores de caspase-1 (Z-WEHD-FMK, VX-765 e Z-VAD-FMK); inibidor do fator de transcrição NF-κB (Bay); inibidor de NLRP3; inibidor de ATPases de membrana (Bafilomicina); inibidor de bomba de prótons (Glibenclamida); e inibidor de ROS (N-Acetil-L-cisteina)...77 21 Análise por imunocitoquímica da expressão de Caspase-1 clivada em DCs não estimulados ou estimulados com leveduras de P. brasiliensis, e DCs estimuladas com leveduras de Pb18 após tratamento com os inibidores de caspase-1 (Z-WEHD-FMK, VX-765 e Z-VAD-FMK); inibidor do fator de transcrição NF-κB (Bay); inibidor de NLRP3; inibidor de ATPases de membrana (Bafilomicina); inibidor de bomba de prótons (Glibenclamida); e inibidor de ROS (N-Acetil-L-cisteina)...79 22 Análise por imunocitoquímica da expressão de IL-1β (pró-IL-1β) em DCs não estimulados ou estimulados com leveduras de P. brasiliensis, e DCs estimuladas com leveduras de Pb18 após tratamento com os inibidores de caspase-1

(Z-xx

WEHD-FMK, VX-765 e Z-VAD-FMK); inibidor do fator de transcrição NF-κB (Bay); inibidor de NLRP3; inibidor de ATPases de membrana (Bafilomicina); inibidor de bomba de prótons (Glibenclamida); e inibidor de ROS (N-Acetil-L-cisteina)...80 23 Análise por imunocitoquímica da expressão de IL-1β clivada em DCs não estimulados ou estimulados com leveduras de P. brasiliensis, e DCs estimuladas com leveduras de Pb18 após tratamento com os inibidores de caspase-1 (Z-WEHD-FMK, VX-765 e Z-VAD-FMK); inibidor do fator de transcrição NF-κB (Bay); inibidor de NLRP3; inibidor de ATPases de membrana (Bafilomicina); inibidor de bomba de prótons (Glibenclamida); e inibidor de ROS (N-Acetil-L-cisteina)...81 24 Análise por microscopia confocal da expressão de NLRP3 (verde) e de IL-1β

(vermelho) em DCs mantidas sem estímulo ou estimulados com células leveduriformes de P. brasiliensis e com indutor de NLRP3 (ATP), e em DCs estimuladas com leveduras de Pb18 após o tratamento com o inibidor de caspase-1 (VX-765), inibidor de NLRP3; inibidor de Syk, inibidor de ATPases de membrana, e inibidor de bomba de prótons...84 25 Análise quantitativa da intensidade média de fluorescência da expressão de NLRP3 e IL-1β por DCs mantidas sem estímulo ou estimuladas com leveduras de

P. brasiliensis (Pb18), e com indutor de NLRP3 (ATP); e por DCs estimuladas

com leveduras de Pb18 após o tratamento com inibidor de caspase-1 (VX-765), inibidor de NLRP3; inibidor de Syk, inibidor de ATPases de membrana, e inibidor de bomba de prótons ...85 26 Dosagem de IL-1β no sobrenadante de cultura de DCs e macrófagos previamente tratadas (ou não) com os inibidores específico de caspase-1 (VX-765 e Z-VAD-FMK), inibidor específico para NLRP3; inibidor de ATPases de membrana (Bafilomicina), inibidor de bomba de prótons (Glibenclamida), e inibidor de ROS (N-Acetil-L-cisteína) ...86 27 Dosagem de IL-18 no sobrenadante de cultura de DCs e macrófagos previamente tratadas (ou não) com os inibidores específico de caspase-1 (VX-765 e Z-VAD-FMK), inibidor específico para NLRP3; inibidor de ATPases de membrana

xxi

(Bafilomicina), inibidor de bomba de prótons (Glibenclamida), e inibidor de ROS (N-Acetil-L-cisteína) ...87 28 Dosagem de TNF-α no sobrenadante de cultura de DCs e macrófagos previamente tratadas (ou não) com os inibidores específico de caspase-1 (VX-765 e Z-VAD-FMK), inibidor específico para NLRP3; inibidor de ATPases de membrana (Bafilomicina), inibidor de bomba de prótons (Glibenclamida), e inibidor de ROS (N-Acetil-L-cisteína) ...88 29 Análise por citometria de fluxo da porcentagem de células CD3+CD4+IFN-γ+, CD3+CD4+IL-4+, CD3+CD4+IL-17+ e CD3+CD4+IL-22+ em coculturas de linfócitos e células dendríticas ou macrófagos, previamente tratados com os inibidores de Caspase-1 e NLRP3 e estimulados (ou não) com leveduras de P.

brasiliensis...90

30 Análise por citometria de fluxo da porcentagem de células CD3+CD8+IFN-γ+, CD3+CD8+IL-4+, CD3+CD8+IL-17+ e CD3+CD8+IL-22+ em coculturas de linfócitos e células dendríticas ou macrófagos, previamente tratados (ou não) com os inibidores de Caspase-1 e NLRP3 e estimulados (ou não) com leveduras de P.

brasiliensis...92

31 Análise por citometria de fluxo da porcentagem de células e CD3+_CD4+_CD25+

CD3+_CD4+_CD25+_FOXP3+ _{em coculturas de linfócitos e células dendríticas ou}

macrófagos, previamente tratados (ou não) com os inibidores de Caspase-1 e NLRP3 e estimulados (ou não) com leveduras de P. brasiliensis...93 32 Dosagem de IFN-γ, IL-4, IL-17 e IL-22 no sobrenadante de linfócitos cocultivados com DCs previamente tratadas (ou não) com os inibidores de Caspase-1 e NLRP3 e estimuladas (ou não) com leveduras de P. brasiliensis ...95 33 Dosagem de IFN-γ, IL-4, IL-17 e IL-22 no sobrenadante de linfócitos cocultivados com macrófagos previamente tratadas (ou não) com os inibidores de Caspase-1 e NLRP3 e estimuladas (ou não) com leveduras de P. brasiliensis ...96

xxiii

LISTA DE ABREVIATURAS ______________________________________________________________________

 BSA: Soro albumina bovina

 CLRs: receptores C-lectina

 PBMC: Células mononucleares do sangue periférico

 DCs: Células dendríticas (“dendritic cells”)

 DAMPs: Padrões moleculares associados ao “perigo” (dano celular)

 ELISA: Ensaio Imunoenzimático

 FA: Forma Adulta da Paracoccidioidomicose

 FC: Forma Crônica da Paracoccidioidomicose

 GM-CSF: Fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos

 H2O2: Peróxido de hidrogênio

 Ig: Imunoglobulina

 IHQ: Imunohistoquímica

 IL-: Interleucina

 IFN-γ: Intereferon gamma

 NLRs: Receptores do tipo NOD (NOD-like receptors)

 PAMPs: Padrões moleculares associados à patógenos

 Pb18: cepa de alta virulência do fungo Paracoccidioides brasiliensis

 PRRs: Receptores de reconhecimento padrão

 PCM: Paracoccidioidomicose

xxiv

 RNAm: Ácido ribonucleioco mensageiro

 SBF: Soro fetal bovino

 SDS: Dodecil sulfato de sódio

 sICAM-1: Molécula de adesão intercelular-1 solúvel

 SST: Solução salina tamponada

 sTNF-RI: Receptor solúvel para o fator de necrose tumoral alfa tipo I

 sTNF-RII: Receptor solúvel para o fator de necrose tumoral alfa tipo II

 TBS: Tris Base – NaCl

 Th: Linfócitos T auxiliar (“helper”)

 T reg: T regulatórias

 TLRs: Receptores do tipo Toll (Toll-like receptors)

 TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa

 PVDF: Polyvinylidene fluoride

 Mϕ: Macrófagos

1 1. INTRODUÇÃO

Doenças causadas por fungos estão entre as mais importantes, principalmente entre indivíduos que apresentam algum tipo de comprometimento do sistema imunológico (pacientes com HIV e submetidos a tratamentos com drogas imunossupressoras como transplantados) [1]. Dentre os fungos patogênicos considerados oportunistas, as espécies dos gêneros Candida e Aspergillus e o Criptococcus neoformans são os mais importantes em nosso meio [1]. Ao contrário da candidíase e da aspergilose, a paracoccidioidomicose (PCM), é mais comum entre indivíduos imunocompetentes, sendo a micose sistêmica mais importante na América Latina, sobretudo no Brasil [2]. Alguns dados oriundos de inquéritos epidemiológicos realizados no Brasil, Venezuela, Argentina e Colômbia indicam que até 50% da população de áreas endêmicas tenham sido expostos a esse fungo, apesar de somente uma pequena parcela dos indivíduos expostos desenvolverem a doença [3].

Até 2006, acreditava-se que o gênero Paracoccidioides, era composto somente pela espécie Paracoccidioides brasiliensis. Recentemente, trabalhos filogenéticos de isolados de

P. brasiliensis relataram uma extensa variabilidade genética [4-7], indicando a existência de

várias subespécies do complexo Paracoccidioides: S1, PS2, e PS3 [8-12], tendo sido proposta a criação de uma nova espécie, o Paracoccidioides lutzii, que ocorre com alta incidência na região centro-oeste do Brasil, e no Equador [11, 13, 14].

Apesar dos estudos sobre a resposta imunológica contra doenças fúngicas serem escassos em comparação com outros tipos de patógenos (vírus, bactérias e protozoários), diversos avanços foram feitos nos últimos anos para melhor compreender como esses patógenos são reconhecidos pelo sistema imunológico e quais os tipos de resposta estão relacionados à resistência ou à suscetibilidade à infecção. De forma geral, a resistência às

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infecções fúngicas está associada à indução de uma resposta inflamatória robusta, com participação importante de citocinas como o IFN-, TNF- e da IL-17, responsáveis pela ativação de células efetoras da resposta imunológica inata como macrófagos e neutrófilos [1]. Desse modo, a resposta inflamatória é de extrema importância para a contenção dessas doenças, contudo, a sua exacerbação pode levar a danos teciduais, e desequilíbrio da resposta imunológica [1].

Após seu estabelecimento, a PCM se caracteriza por apresentar um largo espectro de manifestações clínicas, agrupadas em 2 formas principais: a forma crônica (FC), geralmente mais localizada e menos agressiva e a forma aguda (FA), mais grave e disseminada [15, 16]. Em ambos os casos a imunidade celular apresenta-se comprometida, e a ausência de intervenção por meio de terapia específica leva a altas taxas de mortalidade, principalmente em crianças [15, 17], podendo ser considerada a oitava causa de mortalidade por doença infecciosa/parasitária predominantemente crônica, superando a mortalidade causada pelas leishmanioses [15]. Indivíduos moradores da zona endêmica expostos ao fungo podem apresentar a PCM-infecção, caracterizada pelo teste cutâneo de hipersensibilidade do tipo tardio (HTT) positivo a antígenos do fungo e considerada a forma de resistência da PCM [18, 19].

No modelo experimental da PCM camundongos suscetíveis à doença (linhagem B10.A) apresentam resposta imune celular deprimida, evidenciada pela proliferação de linfócitos e reação de HTT diminuídas frente a estímulos com antígenos do fungo [20, 21]. Além disso, produzem preferencialmente citocinas do tipo Th2 como interleucina-4 (IL-4), IL-5 e IL-10 [21, 22]. Por outro lado, nos camundongos resistentes (linhagem A/Sn – A/J) a resposta imunológica celular é preservada, com linfoproliferação e testes de HTT positivos

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e produção de citocinas do tipo Th1 como o interferon-gama (IFN-e o fator de necrose tumoral-alfa (TNF- [21, 22].

Esses achados no modelo experimental encontram paralelo na doença humana. Indivíduos apresentando a FA da PCM apresentam uma resposta predominantemente Th2/Th9, com produção aumentada (in vitro) de citocinas supressoras da resposta imune celular como a IL-4, IL-5, IL-10, o fator de transformação de crescimento-beta (TGF-) e baixa produção de IFN- e TNF-[19, 23-28]. Por outro lado, os indivíduos com a FC desenvolvem uma resposta mista, que resulta em diferentes apresentações clínicas da doença. Esses indivíduos, em geral, apresentam um predomínio da produção de citocinas do tipo Th1 como IFN-γ, TNF-α e IL-2 e quantidades variáveis de IL-10 e IL-4 [19, 25-27]. Já os indivíduos apresentando a PCM-infecção não apresentam sinais clínicos de doença e tampouco produzem anticorpos específicos, mas desenvolvem resposta celular vigorosa contra antígenos do fungo e produzem quantidades elevadas de IFN-, IL-2 e TNF- e níveis basais de IL-4, IL-5 e IL-10 [19, 26, 27]. Em um trabalho publicado recentemente, nosso grupo conseguiu identificar que além das células Th1 e Th2, as formas clínicas da PCM diferem quanto à presença de outras populações de linfócitos. Assim, indivíduos com a FC da doença apresentam em sua circulação um grande número de linfócitos produtores de IL-17 e de IL-22 (ThIL-17), fato que os diferencia das outras formas clínicas da doença [25].

Embora os fatores relacionados à resposta imunológica adaptativa que levam à resistência ou suscetibilidade às infecções fúngicas estejam relativamente bem estabelecidos, ainda existem diversas questões sobre como essas respostas são induzidas [1]. Por esse motivo, nos últimos anos, a resposta imunológica inata passou a ser bastante estudada, uma vez que a forma pela qual as células da resposta inata fazem o reconhecimento inicial dos

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patógenos interfere diretamente na indução da resposta subsequente [29, 30]. Dentre as células da resposta inata capazes de influenciar na diferenciação dos linfócitos destacam-se as células dendríticas (DCs), e os macrófagos que atuam majoritariamente sobre células efetoras [30].

As DCs, são essenciais para manutenção da tolerância aos antígenos próprios [31], ativação das células T naive, e diferenciação nos subtipos de células T helper efetoras (Th) e de memória [32]. Caracterizam-se também pela heterogeneidade, se diferem na expressão de moléculas de superfície, na localização e produção de citocinas [31-33]. In vitro, podem ser diferenciadas a partir de monócitos na presença do fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e da IL-4 [34-37]. Os macrófagos, de um modo geral, apresentam um papel crucial para a imunidade inata antifúngica, contribuindo para a eliminação do fungo através da fagocitose e da morte direta do patógeno [1]. Os macrófagos, podem ser divididos em subpopulações, baseadas em sua localização anatômica e em seu fenótipo funcional [38]. De acordo com o fenótipo, os macrófagos podem ser basicamente divididos em: macrófagos ativados via clássica, esses atuam na defesa do hospedeiro contra uma variedade de bactérias, protozoários, vírus e também participam da imunidade antitumoral; ou macrófagos ativados via alternativa, esses tem sido descrito em respostas anti-inflamatórias e em processo de reparo tecidual [38].

A diferenciação de células T nas diversas subpopulações é regulada principalmente pela presença de certas citocinas produzidas no ambiente onde ocorre a apresentação do antígeno. A interação dessas citocinas com seus receptores leva a sinalização intracelular específica, e posterior ativação de fatores de transcrição que são característicos de cada uma dessas subpopulações [39, 40]. Dessa forma, células Th1 se diferenciam quando citocinas como a IL-12 e IFN- estão presentes no meio, e as células Th2 se diferenciam na presença

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de IL-4 [39, 40]. De maneira geral as células Th17 se diferenciam na presença de TGF- e IL-6, sendo que outras citocinas inflamatórias como o TNF- podem ter efeitos adicionais [40-42]. Além das condições mencionadas, atualmente sabe-se que outras citocinas produzidas por células do sistema imunológico inato podem contribuir para a diferenciação das subpopulações de linfócitos T CD4+_{, principalmente citocinas da família da IL-1 [43,}

44].

A família da Interleucina-1 (IL-1F) é uma família de proteínas descritas originalmente por apresentarem um importante papel na inicialização e ativação do sistema imunológico inato. Atualmente, são conhecidas 11 proteínas dessa família (nomeadas de 1F1 a IL-1F11), que incluem citocinas com ações pró- (IL-1/IL-1F2 e IL-18/IL-1F4) e anti-inflamatórias (IL-33/IL-1F11, IL-37/IL-1F7 e IL-1Ra/IL-1F3) que além de atuarem sobre células do sistema imunológico inato, podem contribuir para a diferenciação ou manutenção de linfócitos T efetores [43, 44].

Alguns membros dessa família, como IL-1β e a IL-18, não exibem atividade biológica até sua clivagem [43, 44]. A IL-1β é produzida principalmente por monócitos, macrófagos, e células dendríticas (DCs), embora também seja secretada, em menores quantidades, por linfócitos B e células natural killer (NK) [44]. A IL-18 apresenta papel importante na indução da produção de IFN-γ, promovendo uma resposta inflamatória do tipo Th1 e a ativação de células NK [45]. Além de atuar na indução da diferenciação de células Th1 em sinergia com a IL-12, a IL-18 pode participar da diferenciação de células Th2, na ausência da IL-12 [46-49].

Além da IL-1 e da IL-18, estudos indicam que tanto DCs quanto macrófagos também sintetizam a citocina IL-37 (ou IL-1F7) [50, 51]. A IL-37 (ou IL-1F7), apresenta

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cinco variantes, sendo a isoforma IL-1F7b biologicamente relevante [52]. Semelhante a outros membros da família da IL-1, assim como a IL-1α e IL-33, essa citocina se transloca para o núcleo onde exerce sua função, reduzindo a produção de citocinas e fosforilação de várias quinases, apresentando assim um papel anti-inflamatório [53, 54]

Como mencionado, algumas das citocinas da família da IL-1 (IL-1, IL-18, IL-33 e IL-37) são produzidas em uma forma inativa (pró-interleucina), após a ativação das células pelo reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) ou por substâncias produzidas pelo organismo em situações de estresse ou dano tecidual (DAMPs - Padrões Moleculares Associados a Dano Celular) por meio de receptores de reconhecimento de padrão (PRRs) [55, 56].

Dentre os receptores expressos na membrana plasmática das células do sistema inato, os receptores do tipo Toll (TLRs, principalmente o TLR-2 e TLR-4) e algumas proteínas da família das lectinas do tipo C (CLRs, como a dectina-1, dectina-2 e Mincle) foram descritas como as mais importantes para o reconhecimento e posterior ativação de células contra fungos patogênicos [1, 57], sendo que as respostas adaptativas desencadeadas após o reconhecimento variam de acordo com o conjunto de receptores envolvidos inicialmente [58].

Já foi demonstrado que leveduras de P. brasiliensis são capazes de estimular monócitos e neutrófilos por meio desses receptores (TLRs e Dectina-1) induzindo a produção de citocinas pró-inflamatórias, e que diferentes cepas de P. brasiliensis (Pb18 – virulenta e Pb265 – avirulenta), são reconhecidas por um conjunto de receptores distintos [59]. No modelo experimental da PCM, foi demonstrado que os TLRs podem ter importante papel na

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resposta inicial ao fungo, sendo que o TLR2 e o TLR4 são os mais importantes [60-62], embora apresentem atividades diferenciadas.

A sinalização via TLRs é dependente da molécula adaptadora MyD88, que induz a ativação dos fatores de transcrição NF-κB e AP-1, por meio da regulação da ubiquitinização dependente da quinase TAK-1 [63]. Na PCM experimental, a sinalização via MyD88 é essencial para ativação de mecanismos fungicidas e indução das respostas imunes inatas e adaptativas contra a infecção [64]. Também há evidências do aumento da expressão dos receptores TLR2, TLR4 e do receptor de manose em monócitos humanos em resposta ao estimulo com gp43, o que induz a produção de citocinas pró e anti-inflamatórias [65].

Além dos TLRs, receptores como a dectina-1 (CLEC7A) reconhecem moléculas de 1,3--glucanas, um dos principais componentes da parede celular de fungos patogênicos como P. brasiliensis, C. albicans, A. fumigatus e Pneumocystis jirovecii [66], sendo, dessa forma, um receptor crucial na resposta antifúngica [67, 68]. Camundongos deficientes em dectina-1 são mais suscetíveis à infecção por C. albicans e P. jirovecii [68]. A interação da dectina-1 com seu ligante induz a fagocitose, produção de citocinas (TNF-, IL-2, IL-10 e IL-12), produção de reativos intermediários do oxigênio (ROS) e recrutamento de leucócitos para o sítio inflamatório [68, 69]. Uma vez ativa, a dectina-1 modula a resposta adaptativa, induzindo a diferenciação de células Th17 [70]. Loures e col. demonstraram que na PCM experimental, camundongos deficientes de dectina-1 apresentam uma resposta imune inata deficiente, com presença predominante de macrófagos M2, não efetivos na atividade fungicida. A deficiência desse receptor também se caracteriza pela diminuição de citocinas Th1, Th2 e Th17 e aumento de células T regulatórias (Treg) [71].

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Mais recentemente, foram descritos alguns PRRs presentes no citoplasma das células (principalmente DCs e macrófagos), e que também estão envolvidos na indução de respostas inflamatórias [57]. Dentre esses receptores, alguns pertencentes à família dos receptores do tipo NOD (NLRs) foram associados ao reconhecimento de fungos patogênicos como a C.

albicans e o A. fumigatus [57, 72-75]. Os NLRs constituem uma grande família de PRRs

intracelulares que apresentam estrutura semelhante: um domínio C-terminal LRR (rico em repetições de leucina), uma porção central de oligomerização e ligação a nucleotídeo (NATCH) e um domínio N-terminal de interação proteína-proteína variável, que pode estar ligado a diversas proteínas moduladoras (CARD, PYD ou BIR) [76, 77].

Entre os NLRs, o NLRP3 (também denominado NALP3, criopirina, CIAS1 e PYPAF1) é conhecido por responder a diversos estímulos, e como alguns outros NLRs (NLRP1, NLRC4), são responsáveis pela ativação do inflamassoma (inflamassoma NLRP3), responsável pelo recrutamento e ativação de caspase-1 (pró-caspase 1) em associação com a proteína adaptadora ASC [78]. Como mencionado, a caspase-1 ativa é essencial para a quebra da pró-IL-1e pró-IL-18 nas suas formas maturas e biologicamente ativas [56].

A ativação do inflamassoma NLRP3 é bastante complexa e devido ao grande número de estímulos capazes de ativar o NLRP3, acredita-se que o mesmo seja ativado de forma indireta, ou seja, não há o reconhecimento direto de PAMPs por essa molécula [78].

Said-Sadier e col. sugerem dois processos de ativação do inflamassoma NLRP3 na infecção experimental por Aspergillus fumigatus, um primeiro sinal gerado pelo reconhecimento via TLR e dectina-1, induzindo a síntese da pro IL-1beta, e um segundo sinal que envolve ativação do NLRP3 e consequente clivagem da caspase-1, via Syk [79]. Na infecção por Trypanosoma cruzi, Dey, Sinha e col. demonstraram o papel crucial da produção

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de espécies reativas de oxigênio (ROS) e sinalização via NF-κB para ativação do inflamassoma NLRP3 e da caspase-1 na secreção de IL-1β, tanto em macrófagos humanos quanto em macrófagos murinos [80]. Também foi relatado que em infecções bacterianas, o efluxo de potássio é fundamental para ativação do NLRP3 em neutrófilos [81]. Mais recentemente, Tavares et al. (2013) demonstraram a ativação do NLRP3 em células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos em resposta ao Paracoccidioides

brasiliensis [82].

Outros estímulos também já foram descritos como capazes de induzir a ativação do inflamassoma NLRP3, como alguns PAMPs (DNA e RNA), o ATP, algumas moléculas produzidas pela própria célula como o urato monossódico e o -amilóide, cristais (sílica e asbestos); adjuvantes (hidróxido de alumínio) [78]. Mais recentemente foi descrito o seu papel no reconhecimento de -glucanas [83], que envolveria o reconhecimento via dectina-1 e posterior fosforilação da proteína Syk [84, 85]. Assim como a dectina-dectina-1, o NLRP3, está envolvido no reconhecimento de 1,3-β glucanos, e induz a transcrição e secreção de IL-1β em macrófagos humanos, respectivamente [86]. Segundo Lin H. e col., a Syk pode associar-se diretamente à proteína ASC, induzindo a formação do inflamassoma NLRP3, associar-sendo necessária para ativação da caspase-1 em células HEK293T e em macrófagos derivados de camundongos [87].

Assim, dentre os mecanismos propostos para a ativação do inflamassoma NLPR3 estão: o aumento do efluxo de íons potássio (K+_{); a ativação do receptor P2X7R pelo ATP;}

a desestabilização da membrana do fagossoma após fagocitose de material particulado, com a consequente liberação de proteases como a catepsina B; ou a geração de reativos intermediários de oxigênio (ROS) [88]. Na figura abaixo (Figura 1) estão sumarizadas as

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principais vias de ativação do inflamassoma NLRP3 em resposta a PAMPs fúngicos. Dessa forma, para a produção de IL-1(assim como da IL-18) são necessários dois sinais.

Figura 1: Vias de ativação do inflamassoma NLRP3. O reconhecimento do patógeno (PAMPs fúngicos) por receptores expressos na superfície do fagócito – TLR (TLR2, TLR6) e CLRs (Dectina-1) induz a produção da pró-IL-1 e pró-IL-18 (1º sinal). Para a produção das formas biologicamente ativas é necessário a ativação do inflamassoma NLRP3 que ocorre indiretamente por meio de vários estímulos como pela fosforilação da proteína Syk (via dectina-1) que leva à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS); pelo efluxo de íons potássio (K+) e ativação do receptor P2X7R com influxo de ATP; ou pela desestabilização da membrana do fagossoma e liberação de catepsina B no citoplasma da célula.

Apesar de estar envolvido na resistência às infecções fúngicas por estimularem uma resposta inflamatória por meio da produção de IL-1 e de IL-18, os inflamassomas também já foram associados às respostas prejudiciais, principalmente pela indução de uma resposta

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inflamatória muito intensa [89]. Além disso, foi observado que a ativação do NLRP3 pode levar ao acúmulo e ativação aberrante de linfócitos em tecido adiposo contribuindo para a resistência à insulina e a um quadro de diabetes [90, 91].

É interessante notar que na PCM a resposta inflamatória exacerbada já foi associada a suscetibilidade e às formas clínicas mais graves. Camundongos suscetíveis à infecção pelo

P. brasiliensis apresentam uma resposta imunológica inicial caracterizada pela grande

produção de mediadores inflamatórios e pelo infiltrado de grande número de neutrófilos, por outro lado, camundongos resistentes produzem quantidades moderadas desses mediadores e menor infiltrado inflamatório [92]. Diversos estudos demonstram que pacientes com a PCM apresentam níveis elevados de IL-18 e IL-1 na circulação periférica quando comparados a indivíduos controle [93, 94], e que monócitos estimulados com leveduras de P. brasiliensis produzem grandes quantidades de IL-1[95]Pacientes com PCM ativa também apresentam produção aumentada de citocinas (IL-18, IL-12p40, IL-6, IL1-), quimiocinas (CXCL9 e CXCL10) e outros marcadores inflamatórios (sICAM-1, sTNF-RI e sTNF-RII), quando comparados a indivíduos controle ou com PCM infecção, sendo que níveis mais elevados de alguns deles (IL-6, IL-8, IL-18 e TNFRII) foram encontrados nas formas mais graves da doença [28, 94]. No modelo experimental a produção de IL-18 foi associada à suscetibilidade à doença [96].

Como mencionado, o papel dos NLRs, em especial do NLRP3, no reconhecimento de patógenos fúngicos ainda não foi totalmente determinado. Particularmente na PCM poucos estudos foram publicados, apesar de algumas evidências indicarem uma possível participação dessas moléculas, principalmente na indução da produção de IL-1 e de IL-18.

13 2. OBJETIVOS

2.1 Objetivos gerais

Avaliar o papel desempenhado pelo inflamassoma NLRP3 na ativação de macrófagos e células dendríticas humanas em resposta ao P. brasiliensis, e sua participação na produção das citocinas inflamatórias IL-1 e IL-18 e na ativação e diferenciação de linfócitos T.

2.2 Objetivos específico

- Avaliar por meio de reações de imuno-histoquímica a presença de IL-1, IL-18, NLRP3,

caspase-1 e IL-37 em lesões de linfonodos e de mucosa-oral provenientes de pacientes apresentando as formas aguda ou crônica da paracoccidioidomicose.

- Avaliar se o estímulo de macrófagos e células dendríticas (DCs) (diferenciadas a partir de monócitos humanos) com células leveduriformes de P. brasiliensis leva à ativação do inflamassoma NLRP3 e à produção de IL-1β e IL-18.

- Avaliar a participação dos receptores de superfície (TLR2 e dectina-1), e a consequente fosforilação da proteína Syk e Erk na indução da ativação do NLRP3 e na produção de IL-1β e IL-18 por macrófagos e DCs estimuladas com células leveduriformes de P. brasiliensis. - Determinar o mecanismo envolvido na ativação do inflamassoma NLRP3 (produção de ROS, efluxo de K+ ou fagocitose e acidificação do fagossomo) em macrófagos e DCs estimulados com células leveduriformes de P. brasiliensis.

- Determinar o efeito da ativação do inflamassoma NLRP3 na diferenciação de linfócitos T por DCs e macrófagos estimulados com células leveduriformes de P. brasiliensis.

15 3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Casuística.

Para as reações de imuno-histoquímica foram analisadas 6 biópsias de lesões de mucosa oral de pacientes com a FC multifocal e 6 biópsias de lesões de linfonodo de pacientes apresentando a FA da PCM, obtidas para fins diagnóstico. As lesões incluídas no estudo foram aquelas que apresentavam leveduras de P. brasiliensis. Como controle, também foram utilizadas 2 biópsias de diferentes pacientes com diagnóstico de processo inflamatório leve sem relação com a PCM (mucosa oral) e 2 biópsias de linfonodos de pacientes com câncer de tireoide, que foram removidos para avaliação, tendo sido selecionados linfonodos livres de quaisquer indícios de neoplasia ou qualquer outra patologia.

Para os experimentos in vitro realizados a fim de avaliar a ativação do inflamassoma NLRP3 em macrófagos e células dendríticas (DCs), foram utilizadas células obtidas do sangue periférico de indivíduos saudáveis (controles), uma vez que se trata de um estudo com células do sistema inato, e que, portanto, não necessitam de exposição prévia ao agente etiológico. Para cada conjunto de experimento foram realizados um númeor variável de experimentos indicados no gráfico. Cada indivíduo foi informado sobre sua participação na pesquisa, assinando um termo de consentimento pós-informação, de acordo com as normas estabelecidas pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Instituição (Plataforma Brasil, N°. do parecer 140.788, aprovado em 07/11/2012).

16 3.2. Imuno-histoquímica.

Para as reações de imuno-histoquímica, foram utilizadas biópsias de lesões incluídas em parafina. Para a realização dos cortes histológicos os blocos foram mantidos a -20ºC durante 30 minutos quando então foram cortados (espessura de 4µm) em micrótomo Histocut 820 II (Leica, Mussioch, Alemanha). Cortes seriados foram colocados no banho histológico com água destilada a 50°C e coletados em lâminas Start Frost (Kinttel Galser, Alemanha) identificadas com o número de cada caso. As lâminas foram mantidas em estufa a 80°C por 1 hora, em seguida foram guardadas em caixas porta-lâmina até a realização da reação de imuno-histoquímica.

As lâminas foram desparafinizadas e hidratadas com várias passagens em xilol e alcoóis graduados até a lavagem em água destilada; em seguida foi realizada a recuperação antigênica com tampão específico para cada anticorpo (citrato pH 6.0, Tris-EDTA pH 9.0 ou EDTA- pH8.0) ou utilizando Trilogy (Cell Marque) em panela a vapor, durante 45 minutos. Procedeu-se então ao bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio (H2O2)

10v (Dinâmica) durante 15 minutos, seguido de lavagem com água destilada e incubação com bloqueio de proteína (Dako, Carpinteria, EUA) por 10 minutos. A incubação com os seguintes anticorpos primários os anticorpos primários: anti-IL-18, anti-IL-1β, Anti-NLRP3, anti-Caspase-1 (Santa Cruz Biotechnology) e IL-37 (Sigma); foi feita overnight em câmara úmida. Os anticorpos primários foram diluídos em solução de salina tamponada com fosfato e soro albumina bovina a 2% (SST-BSA) e dispensados sobre os cortes.

Após a incubação, as lâminas foram lavadas com SST e incubadas com anticorpo secundário conjugado a um polímero contendo peroxidase (Envision, Dako, Carpinteria, EUA). Para alguns marcadores, após o anticorpo secundário, foi adicionado um anticorpo

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terciário contendo peroxidase conjugado a um polímero (MACH4, Biomedical, EUA). As reações foram reveladas pela adição do substrato cromógeno 3,3 diaminobenzidina (DAB, Sigma-Aldrich Chemical, St. Louis, EUA) a 0,6%, seguida da ativação com peróxido de hidrogênio 30v durante 5 minutos e coloração nuclear com hematoxilina de Harris (Sigma-Aldrich Chemical) por 1 minuto. Após o término da reação, as lâminas foram desidratadas, diafanizadas e montadas com Entelan (Sigma-Aldrich Chemical, St. Louis, EUA). O controle negativo consistiu em uma lâmina do mesmo tecido analisado, na qual o anticorpo primário foi substituído por SST-BSA.

As lâminas de IHQ foram analisadas por microscopia ótica (Olympus, modelo CX31RTSF, Japão) para a avaliação da composição celular do infiltrado inflamatório e da presença de citocinas. Foram analisados três campos diferentes e aleatórios em cada lâmina (aumento 400X), levando-se em consideração a presença do fungo.

3.3. Obtenção de leveduras de P. brasiliensis.

Culturas da fase leveduriforme de P. brasiliensis da cepa virulenta Pb18 foram mantidas a 36°C em meio Fava-Netto por 5 dias. Após esse período o crescimento do tubo foi lavado em SST estéril e para a obtenção de células individuais, a suspensão de leveduras foi submetida à agitação em vórtex em tubos contendo esferas de vidro de 4mm por 30 segundos (processo repetido 3 vezes). Após a dissolução dos grumos, os tubos foram deixados em repouso a 37ºC por 15 minutos e o sobrenadante foi transferido para outro tubo, então realizou-se a contagem em câmara de Neubauer na presença de Azul de Tripan. Foram utilizadas suspensões contendo mais que 85% de fungos viáveis. O número de leveduras utilizado em cada experimento foi acertado conforme a necessidade.

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3.4. Obtenção de monócitos (células CD14+_{) por separação imunomagnética a partir de}

células mononucleares do sangue periférico (CMSPs).

O sangue periférico dos doadores saudáveis foi coletado (80 mL) em tubos contendo heparina sódica. Após a coleta, o sangue foi transferido para tubos contendo uma solução de Ficoll-hypaque (densidade 1,077) e centrifugado a 800g durante 30 minutos a temperatura ambiente. A fração contendo as CMSP foi coletada e submetida a duas lavagens com SST (300g, por 10 minutos a 4ºC). Após as lavagens, as células foram ressuspendidas em meio de cultura RPMI 1640 (Gibco – Life Technologies) suplementado com soro bovino fetal (SBF-10%), L-glutamina, Piruvato de Sódio e gentamicina (todos Gibco), contadas em câmara de Neubauer, e utilizadas para a realização de diferentes experimentos, descritos a seguir.

O isolamento de monócitos (células CD14+_{) foi feito por meio de separação}

imunomagnética. As CMSP foram submetidas à separação positiva por meio da incubação com anticorpos acoplados a esferas magnéticas (anti-CD14 - MACS, Miltenyi Biotec) seguindo as instruções do fabricante. Para alguns experimentos, foram separadas as células T CD3+ através da incubação com anticorpos anti-CD3 acoplados a esferas magnéticas (CD3MicroBeads - MACS - Miltenyi Biotec), conforme as instruções do fabricante. A pureza das células foi novamente avaliada por meio de citometria de fluxo, sendo >95%.

3.5. Diferenciação de células dendríticas (DCs) e de macrófagos a partis de monócitos (células CD14+_).

DCs foram diferenciadas a partir das células CD14+, para isso, monócitos foram incubados em meio RPMI (suplementado com SBF (10%), L-glutamina, piruvato de sódio e gentamicina) por 5 dias com citocinas recombinantes (IL-4 – 50 ng/mL e GM-CSF – 50ng/mL – R&D Systems). Macrófagos foram gerados por meio da incubação dos monócitos

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com GM-CSF (5 dias - 50ng/mL). As citocinas recombinantes foram adicionadas no início e após 48 horas de cultura. Após 5 dias, as células foram avaliadas por microscopia e citometria de fluxo para confirmar a diferenciação.

3.6. Condições de cultura.

Macrófagos e DCs foram submetidos a diferentes condições de cultura para a avaliação de diversos parâmetros descritos nos itens abaixo. Como foram realizados diferentes experimentos para a análise de diferentes parâmetros, e devido ao número limitado de células disponíveis, cada grupo de experimentos foi realizado separadamente, o número de experimentos independentes em cada grupo está demonstrado em cada gráfico nos resultados.

Em um primeiro momento foi investigado se células estimuladas com leveduras de

P. brasiliensis levam à ativação do inflamassoma NLRP3. Para isso as células (DCs e

macrófagos - 1x106 células/mL) foram mantidas sem estímulo adicional ou incubadas com células leveduriformes de P. brasiliensis (razão de 2 células para cada levedura) por um período de 6 horas. Após esse período, os sobrenadantes foram analisados para a presença das citocinas IL-1β, IL-18 e TNF-α (citocina que não necessita de ativação dor inflamassomas – controle de ativação celular) por ELISA (ver abaixo).

Em uma segunda etapa foi avaliado a participação do TLR2, da dectina-1 e da fosforilação da proteína Syk no reconhecimento das células leveduriformes de P. brasiliensis. Para isso, as DCs (2x106 células/mL) foram previamente incubadas (ou não) por 30 minutos com laminarina (bloqueador de dectina-1 a 1,25mg/mL) ou com anticorpo bloqueador anti-TLR2 (Biolegend a 10μg/mL). Após o bloqueio, as células foram estimuladas, ou não, com

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leveduras de P.brasiliensis (razão de 10 células:1 célula fúngica). Como controles positivos as células foram estimuladas com agonistas específicos de TLR2 (Pam3CSK4 - 1μg/mL - Invivogen) ou de dectina-1 (Curdlan - 10 μg/mL - Sigma). As células foram incubadas por 30 minutos e utilizadas para o preparo do lisado submetido à separação em géis de poliacrilamida e imunoblot (ver abaixo).

Para a avaliação da indução da transcrição do RNAm para NLRP3, ASC, Caspase-1, IL-1β, IL-18, TNF-α, macrófagos e células dendríticas foram incubadas ou não com células leveduriformes de P. brasiliensis (razão de 2 células para cada fungo), por um período de 3 horas, após o qual foram utilizadas para a extração do RNA e realização de qRT-PCR (ver abaixo).

A fim de determinar qual o(s) mecanismo(s) envolvidos na ativação do inflamassoma NLRP3 em resposta a leveduras de P. brasiliensis, macrófagos e DCs (1 x 106células/mL) foram previamente tratadas com os inibidores de caspase-1 (VX-765 - 10μM e z-VAD-FMK - 20μM - InvivoGen), o inibidor de bomba de potássio (Glibenclamida - 150μM - InvivoGen), inibidor de ATPases de membrana (Bafilomicina – 3,211mM – Sigma-Aldrich), inibidor especifico de NLRP3 (3,4-methylenedioxy-beta-nitrostyrene – 10μM – Sigma-Aldrich), antioxidante N-Acetil-L-cisteina (20mM- Sigma-Adrich ), por um período de 30 minutos. As células foram então mantidas sem estímulo adicional ou incubadas com células leveduriformes de P. brasiliensis (razão de 2 células para cada levedura) por 6 horas. Após esse período, as células foram coletadas e utilizadas para o preparo de lisado celular para identificar a produção de caspase-1 e de IL-1β clivada (através das técnicas de imunoblot, imunocitoquímica e microscopia confocal – ver abaixo), e os sobrenadantes foram analisados para a presença de citocinas IL-1β, IL-18 e TNF-α por ELISA (ver abaixo).

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A fim de determinar o envolvimento da dectina-1, do TLR2, da proteína Syk e da molécula adaptadora Myd88, DCs e macrófagos (1 x 106células/mL), foram previamente tratadas com anticorpos TLR2 (Anti-hTLR2 - 10μg/mL - Biolegend), anticorpos anti-dectina-1 (Anti-hDectin-1-IgG - 3μ/106cel - InvivoGen), inibidor de SykII (1μM – Calbiochem) e inibidor da molécula adaptadora Myd88 (Pepinh-MYD – 10mM - InvivoGen). Então, macrófagos e DCs foram incubadas ou não com células leveduriformes de P. brasiliensis (razão de 2 células para cada fungo), por um período de 6 horas, após esse período de incubação os sobrenadantes foram analisados para a presença de citocinas IL-1β, IL-18 e TNF-α por ELISA.

3.7. Análise por western-blotting.

Após as culturas descritas acima, as células submetidas aos diferentes estímulos foram coletadas, centrifugadas 300 g por 10 minutos, sendo o "pellet" de células ressuspendidos em tampão RIPA, suplementado no momento do uso com aprotinina (Santa Cruz Biotechnology), ortovanadato de sódio (200mM), Phenilmethilsulfonilflúor (PMSF) (200 mM), coquetel de inibidores de protease (Sigma - P8340) e coquetel de inibidores de fosfatase (Sigma - P5726). Após a homogeneização, as amostras foram mantidas em gelo por 30 minutos. Após a incubação as amostras foram centrifugadas (10.000 g por 10 minutos) e o sobrenadante foi transferido para outros tubos, a concentração de proteínas foi estimada pelo método de Lowry (BCA - BioAgency), armazenando-se a -80ºC até o momento do uso.

Para a eletroforese, os lisados de células foram diluídos para uma concentração apropriada em tampão de amostra e aquecidos a 99ºC por 5 minutos. As amostras foram então submetidas à eletroforese (SDS-PAGE) em géis a 12% (30μg de proteína/linha), seguido por transferência para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas com

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TBS (pH 8,0) contendo 5% de leite desnatado por 1 hora. Após lavagens, incubou-se as membranas com anticorpos específicos anti-IL-1β (Santa Cruz Biotechnology), anti-caspase-1 (Santa Cruz Biotechnology), anti-Erk fosforilada ou anti-Syk-fosforilada (pY-348 - BD Pharmingen - monoclonal mouse anti-human-pSyk) por 18 horas a 4ºC. Após lavagens, as membranas foram incubadas por 1 hora com anticorpos secundários apropriados (anti-coelho ou anti-camundongo) conjugados à peroxidase. Após incubação e lavagens as membranas foram incubadas com substrato (ChemiLucent WB Detection System - Chemicon/Millipore) por 2 minutos. A seguir as membranas foram analisadas em equipamento específico para análise de quimioluminescência (ImageQuant 350 GE Life Science).

3.8. Avaliação da produção de IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-17, IL-4 e IL-22 em sobrenadantes de cultura por ELISA.

Para quantificar a produção de 1β e TNF-α por DCs e macrófagos e IFN-γ, IL-17, IL-4 e IL-22 por linfócitos, os sobrenadantes das culturas de células submetidas aos diferentes estímulos descritos foram avaliados por meio de ELISA (R&DSystems) de acordo com as instruções do fabricante. A dosagem de IL-18 (MBL International) foi realizada por meio de um ELISA desenvolvido em nosso laboratório (ver abaixo).

3.8.1. Dosagem de IL-18 no sobrenadante de cultura de DCs e macrófagos.

Placas de ELISA de 96 wells de alta afinidade (Nunc) foram recobertas com anticorpo monoclonal anti-IL18 (clone 125-2H (D044-3) - MBL International) diluído em uma concentração de 1μg/ml em solução salina tamponada com fosfato (SST - pH 7,2) e incubadas por uma noite à temperatura ambiente. Após a incubação as placas foram lavadas 3 vezes com SST contendo 0,05% de Tween20 (SST-T) e bloqueadas com SST contendo 1% de Soro Albumina Bovina(BSA) e 0,05% de Tween20 por 1 a 2 horas a temperatura

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ambiente. Repetiu-se o procedimento de lavagem (3 vezes com SST-T), sendo então incubadas por 2 horas a temperatura ambiente com as amostras e com uma curva padrão feita com IL-18 recombinante (MBL) com concentrações variando de 1000pg/mL a 31pg/mL. As placas foram lavadas (3 vezes) e incubadas por 2 horas com anticorpo monoclonal anti-IL-18 biotinilado (clone 159-12B (D045-6) - MBL) diluído a 0,5μg/mL em SST-BSA (0,1%). Após incubação, realizou-se novamente a lavagem (3 vezes) e, em seguida, as placas foram incubadas com solução contendo um polímero (Streptavidin Poly-HRP Conjugate - Thermo Scientific Pierce) diluído (1/10000) em SST-BSA por 1 hora a temperatura ambiente no abrigo da luz. Novamente, as placas foram lavadas (4 vezes) e, por fim, incubadas (15 minutos) com solução cromógeno/substrato (Tetrametilbenzidina/H2O2 em tampão acetato

pH 5,5). Após incubação, a reação foi interrompida pela adição de solução de H2SO4 (2N) e

realizada a leitura em Leitora de ELISA (absorbância a 450nm). Os resultados foram calculados à partir da comparação das absorbâncias obtidas da curva padrão e das amostras.

3.9. Análise da expressão do RNAm por qRT-PCR.

A análise da expressão gênica de citocinas (IL-1β, IL-18, TNF-α), e de NLRP3, ASC e Caspase-1 obtidas a partir de macrófagos e células dendríticas foram realizadas por meio de PCR em tempo real (qRT-PCR).

3.9.1. Extração de RNA.

A extração do RNA total dos macrófagos e das DCs foi realizada por meio da técnica utilizando Trizol (Invitrogen), conforme as instruções do fabricante. Após a extração as amostras foram quantificadas em espectrofotômetro (NanoDrop - Thermo Scientific) a 260 nm. As amostras foram armazenadas a –80°C até o momento do uso.

24 3.9.2. Síntese de cDNA.

Antes da síntese do cDNA, as amostras de RNA obtidas foram submetidas ao tratamento com DNAse para a remoção de possíveis cadeias de DNA genômico contaminante. Para a síntese do cDNA, foi utilizado 1μg de RNA total com o uso da enzima superscript R/T III (200U/μL - (Invitrogen), na presença de oligo dT16 e de “primers” randômicos (ambos Applied Biosystems). Após a síntese as amostras foram quantificadas em espectrofotômetro (NanoDrop - Thermo Scientific) a 260 nm, sendo armazenadas a – 80°C até o momento do uso.

3.9.3. Protocolo de qRT-PCR.

O qRT-PCR foi realizado em equipamento de análise em tempo real StepOne (Applied Biosystems, Califórnia, USA) utilizando metodologia com corante intercalante SybrGreen, a partir de 300ng de cDNA/reação. Em cavidades de placas de 100 μL foram adicionados 3μL de cDNA (contendo 300 ng de cDNA) (ou de água no caso do controle negativo), 1μL do primer sense e 1 μL do primer anti-sense previamente diluídos na concentração de 80 pM/reação (tabela I - previamente titulados) e 5 μL do “master mix”, contendo dNTP, Taq polimerase, MgCl2, SybrGreen, e tampão (Absolute SYBRGreen RT-PCR mix, Applied Biosystems).

As amostras foram colocadas no aparelho de PCR em tempo real e submetidas a 40 ciclos de amplificação: 95ºC por segundo, seguido de um período de anelamento/extensão a 60ºC por minuto. Para avaliar a especificidade dos primers utilizados, em cada reação foi elaborada uma curva de “melting” (aquecimento gradual da amostra amplificada de 60ºC a 95ºC, com incremento de 0,3ºC) na qual foi possível observar a dissociação dos produtos de amplificação. Os resultados foram analisados quanto à expressão do gene de interesse de

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cada amostra, utilizando como gene normalizador GAPDH e como amostra de referência o cDNA obtido a partir do RNA de CMSP (ex vivo) de um pool de células não estimuladas. Os resultados foram analisados e expressos como concentração relativa calculada conforme descritos por Pfaffl (2001) [97]. utilizando as eficiências de amplificação de cada “primer” (obtidas durante padronização), conforme a fórmula descrita abaixo:

𝐸𝑥𝑝𝑟𝑒𝑠𝑠ã𝑜 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 = (𝐸𝑔𝑒𝑛𝑒 𝑎𝑙𝑣𝑜) 𝛥 𝐶𝑡𝑔𝑒𝑛𝑒 𝑎𝑙𝑣𝑜

(𝐸_{𝑔𝑒𝑛𝑒 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟ê𝑛𝑐𝑖𝑎}) 𝛥 𝐶𝑡_{𝑔𝑒𝑛𝑒 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟ê𝑛𝑐𝑖𝑎}

Onde E gene alvo é a eficiência de amplificação da reação com o primer de interesse;

E gene referência é a eficiência de amplificação da reação com o primer do gene normalizador

(GAPDH); Δ Ct gene alvo é igual ao valor de Ct de uma amostra controle amplificada com o

primer do gene de interesse menos o Ct de amostra para o mesmo gene; ΔCt gene referência é

igual ao valor de Ct de uma amostra controle amplificada com o primer do gene normalizador menos o Ct de amostra para o mesmo gene. Na tabela I abaixo, estão relacionados os "primers" utilizados e as eficiências de amplificação obtidas.

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Tabela I: Sequência dos primers utilizados e eficiências das reações de qRT-PCR.

Primer Sequência (5’ → 3’) GAPDH F-CCACATCGCTCAGACACCAT R-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT IL-1β F-CACGATGCACCTGTACGATCA' R-AGACATCACCAAGCTTTTTTGCT NLRP3 F-TGCCCGTCTGGGTGAGA R-CCGGTGCTCCTTGATGAGA ASC F-CCACCAACCCAAGCAAGATG R-GCCTGGAGGAGCAAGTCCTT Caspase-1 F-TGCCTGTTCCTGTGA TGTG F-CAGTTTCCTTATTTTAAT GTCCTGGG IL-18 F-CAGACCTTCCAGATC GCTTC R-GGGTGCATTATCTCT ACAGTCAGAA TNF-α F-TGGCCCAGGCAGTCA GA R-GGTTTGCTACAACAT GGGCTACA 3.10. Imunocitoquímica.

A fim de comprovar que o reconhecimento das leveduras de P. brasiliensis induz a ativação do inflamassoma NLRP3 e consequente produção das citocinas IL-1β e IL-18, macrófagos e células dendríticas foram cultivadas em lamínulas tratadas com poli-L-lysina (Sigma). Macrófagos foram previamente tratados com inibidor específico de ativação da caspase-1 (Z-WEHD-FMK - a 25 ng/mL - R&D Systems), por 30 minutos e então foram mantidas sem estímulo adicional ou incubadas com células leveduriformes de P. brasiliensis (razão de uma célula para cada levedura) por um período de 6 horas. As DCs foram previamente tratadas por 30 minutos com os seguintes inibidores: inibidores de ativação de caspase-1 (Z-WEHD-FMK - 25 ng/mL - R&D Systems; Z-VAD-FMK - 20μM e VX-765 -