O veneno bruto da serpente Bothrops moojeni, quando administrado nas doses de 0,05 mg/Kg (4,40 ± 0,80); 0,1 mg/Kg (5,47 ± 0,34) ou 0,2 mg/Kg (5,39 ± 0,45; via i.p.), não aumentou significantemente o tempo de reação à dor em relação ao controle negativo (4,44 ± 0,29). A morfina foi administrada na dose de 5,0 mg/Kg (13,17 ± 0,65; via i.p.), como controle positivo, aumentando de forma significativa o tempo de reação à dor em relação ao controle negativo (Figura 20).
Controles VB-0,05 VB-0,1 VB-0,2 M-5,0
0 5 10
15 ***a
***d
Tratamentos (mg/Kg)
T e m p o d e r e a ç ã o ( s e g )
Figura 20 – Atividade antinociceptiva do veneno bruto de Bothrops moojeni no teste da retirada da cauda (Tail-Flick). O controle (veículo), o veneno bruto de Bothrops moojeni (VB) (0,05;
0,1; e 0,2 mg/kg) e a morfina (M) (5,0 mg/kg) foram administrados pela via intraperitoneal (i.p.) 20 min antes do teste da retirada da cauda. A atividade antinociceptiva do veneno bruto foi avaliada pelo aumento do tempo de reação do animal (permanência da cauda imersa em banho-maria) quando comparado com o controle negativo. O teste estatístico utilizado foi ANOVA e Tukey como post test.
Média ± E.P.M. (n = 6 para cada grupo). ***ap<0,001 em relação ao controle e ***dp<0,001 em relação ao VB 0,2mg/kg.
A naloxona, na dose de 5,0 mg/Kg, foi administrada por via i.p. 20 minutos antes do veneno bruto de Bothrops moojeni 0,2 mg/Kg (5,39 ± 0,45) e da morfina 5,0 mg/Kg (13,17 ± 0,65), bloqueando significativamente somente o efeito antinociceptivo da morfina (5,33 ± 0,66). A atividade antinociceptiva do veneno bruto de Bothrops moojeni não foi bloqueada (4,80 ± 0,69) (Figura 21).
Controles VB-0,2 VB-0,2+Na-5,0 M-5,0 M-5,0+Na-5,0
0 5 10
15
***a***b
***d
Tratamentos (mg/Kg)
T e m p o d e r e a ç ã o ( s e g )
Figura 21 – Efeito da Naloxona na atividade antinociceptiva veneno bruto de Bothrops moojeni no teste da retirada da cauda (Tail-Flick). A Naloxona foi administrado i.p. 20 min antes do controle (veículo), do veneno bruto de Bothrops moojeni (VB) (0,2 mg/kg) e da morfina (M) (5,0 mg/kg) que foram administrados i.p. 20 min antes do teste da placa quente. O bloqueio da atividade antinociceptiva do veneno bruto e da morfina foi avaliado pela redução do tempo de reação do animal (permanência da cauda imersa em banho-maria) quando comparado com os resultados sem o pré-tratamento com a naloxona. O teste estatístico utilizado foi ANOVA e Tukey como post test. Média ± E.P.M. (n = 6 para cada grupo). ***ap<0,001 em relação ao controle, ***bp<0,001 em relação ao veneno bruto 0,2mg/kg e ***dp<0,001 em relação a morfina 5,0mg/kg.
6 DISCUSSÃO
O tratamento de dores agudas e crônicas intensas no homem ainda apresenta importantes limitações devido aos efeitos colaterais das drogas opióides utilizadas para este fim sobre o sistema nervoso central. Dentre os principais efeitos indesejáveis estão tolerância, dependência física e psíquica, constipação e depressão respiratória (DHAWAN, 1996; CHALMERS, 2005).
Uma das maiores buscas da farmacologia nos últimos anos tem sido por novos agentes analgésicos que tenham a capacidade de inibir a dor tanto ou mais que os opióides. Pesquisadores têm tentado desenvolver agentes que possuam apenas atividade analgésica periférica, sem atingir os grandes centros nervosos, para que possam aliviar a dor sem interferir em estados comportamentais ou centros respiratórios e cardiovasculares. (LOPES, 2005)
Os resultados do presente trabalho demonstram, de maneira pioneira, a atividade antinociceptiva do veneno bruto da serpente Bothrops moojeni em modelos de dor aguda. O principal parâmetro de comparação para este trabalho é a atividade antinociceptiva já demonstrada em venenos de serpentes de outras espécies.
BOGARÍN et al. (2000) demonstraram uma grande variação tóxica entre os venenos de Bothrops. Os venenos de Bothorps castelnaudi (1.01 mg/kg), Bothorps jararaca (1.38 mg/kg) e Bothorps neuwiedi (1.83 mg/kg) foram os mais letais em testes utilizando modelo de murinos. Bothorps atrox (6.51 mg/kg), Bothorps hyoprorus (11.6 mg/kg), Bothorps brazili (7.58 mg/kg) e Bothorps bilineatus (6.28 mg/kg) foram os venenos botrópicos com menor toxicidade estudados por eles (QUEIROZ et al. 2008). O veneno de Bothrops moojeni apresentou DL50 de 4,40 mg/Kg (BOGARÍN et al. 2000).
O pool de veneno bruto de Bothrops moojeni utilizado nesse estudo apresentou DL50 em torno de 3,0 mg/Kg o que o torna, tomando como parâmetro os resultados encontrados por BOGARÍN et al. (2000), um veneno com toxicidade intermediária. Nos ensaios farmacológicos foram utilizadas as doses de 0,025 mg/Kg; 0,05 mg/kg; 0,1 mg/Kg e 0,2 mg/Kg, doses essas bem abaixo da dose letal.
Muitos modelos de nocicepção em animais de laboratório foram criados com o intuito de se verificar a atividade analgésica de novas substâncias com potencial uso clínico. O primeiro modelo experimental utilizado no presente trabalho foi o das contorções abdominais induzidas por ácido acético. Esse teste, apesar de simples e possuir baixa especificidade, é de fácil observação e apresenta boa sensibilidade a drogas analgésicas (KOSTER et al., 1959; IKEDA et al., 2001; LE BARS et al., 2001; PIRES, 2007).
Neste modelo, a administração do veneno bruto de Bothrops moojeni, por via intraperitoneal, diminuiu, de maneira significativa, o número de contorções abdominais induzidas pela injeção de ácido acético em camundongos. As doses testadas inibiram as contorções abdominais em relação ao controle que recebeu somente salina no tratamento em até 87,5% na dose 0,2 mg/Kg. A morfina (5,0 mg/Kg), i.p., analgésico clássico utilizado para avaliar a potência do veneno bruto, inibiu em aproximadamente 80,5% o número de contorções abdominais.
De maneira semelhante, GIORGI et al. (1993) detectaram um efeito analgésico no veneno da Crotalus durissus terrificus. Usando o teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético, o veneno bruto foi administrado pela vias intraperitoneal, oral e subcutânea e observaram que o efeito era dose dependente e persistia mesmo após a utilização de antídotos específicos. Esse efeito foi antagonizado pela naloxona, indicando ter, a substância, uma ação opióide.
As pesquisas pela substância responsável pelo efeito antinociceptivo do veneno da Crotalus durissus começaram com o estudo feito por MANCIN et al.
(1998) no qual isolou-se a crotamina e testaram-se seus efeitos. Foi observado que a mesma possuía atividade tanto central quanto periférica, sendo cerca de 30 vezes mais potente que a morfina e foi considerada a substância de baixo peso molecular relatada por GIORGI et al. (1993) anteriormente. Já MOREIRA (2003), realizando testes clássicos de antinocicepção com o veneno da Crotalus durissus collilineatus, demonstrou que tanto o veneno crotamina positivo quanto o crotamina negativo, possuíam atividade antinociceptiva, sugerindo que a antinocepção do veneno crotamina positivo envolve tanto mecanismos periféricos quanto centrais espinhal e supra-espinhal, enquanto o veneno crotamina negativo apresentaria apenas antinocicepção periférica. Esse estudo não excluiu o papel da crotamina, mas
indicou a existência de outras substâncias, além da mesma, envolvidas na analgesia periférica.
Outro modelo empregado neste trabalho foi o teste da formalina, que se constitui em duas fases, uma inicial que se credita à estimulação direta dos nociceptores, predominantemente das fibras do tipo C, e em parte das do tipo Aδ (DUBUISON & DENNIS, 1977; HUNSKAAR & HOLE, 1987) e outra tardia, representada pela dor inflamatória que é desencadeada por uma combinação de estímulos que incluem inflamação nos tecidos periféricos e mecanismos de sensibilização espinhal e central (TJÆLSEN et al., 1992; TJÆLSEN & HOLE, 1997).
Neste teste, a atividade antinociceptiva do veneno bruto de Bothrops moojeni foi confirmada pela reversão da nocicepção induzida pela formalina em ambas as fases. Na fase inicial, o veneno bruto diminuiu o tempo de lambida ou sacudida da pata somente nas doses de 0,1 mg/Kg e 0,2 mg/Kg, por via i.p., com inibição da nocicepção de 37,0% e 53,5%, respectivamente. Na fase tardia, o veneno bruto em todas as doses testadas reduziu a resposta nociceptiva da formalina, apresentando uma redução de até 81,0% na dose de 0,2 mg/Kg. A morfina (5,0 mg/Kg), i.p., inibiu em aproximadamente 39,0% na primeira fase e 90,0% na segunda fase o tempo de reação do animal em relação ao controle.
Resultados semelhantes foram obtidos por NUNES et al. (2007, 2010), que demonstraram que o veneno da subespécie Crotalus durissus terrificus possui potente e duradoura atividade antiinflamatória no modelo de inflamação induzido por carragenina em camundongo, e que a crotoxina é a responsável por esta atividade.
Dos resultados obtidos até agora, pode-se inferir que o veneno da serpente Bothrops moojeni age principalmente de maneira periférica, interferindo na mediação de fibras nociceptivas primárias e na liberação e/ou no efeito de mediadores da dor inflamatória.
O teste da placa quente relata uma dor associada à neurotransmissão central. Experimentos utilizando este teste revelam substâncias antinociceptivas de ação primariamente na medula espinhal e/ou em níveis mais altos do sistema nervoso central ou ainda por mecanismo indireto (HUNSKAAR et al., 1985;
HUNSKAAR & HOLE, 1987).
O veneno bruto de Bothrops moojeni não aumentou o tempo de permanência do animal sobre a placa aquecida em nenhuma das doses testadas (0,05 mg/Kg; 0,1 mg/Kg e 0,2 mg/Kg) indicando não ter ação no sistema nervoso central.
Em trabalhos anteriores podemos observar que o veneno crotamina positivo possui ação analgésica central-cerebral, que foi evidenciada através do teste da placa quente (MOREIRA, 2003). Diferentemente, o veneno crotamina negativo, não possui ação central-cerebral (LOPES, 2005; GOMES, 2007), levando-nos a atribuir a ação central deste veneno a crotamina. A crotamina extraída do veneno de outra subespécie, a Crotalus durissus terrificus, apresentou ação analgésica central-cerebral, sendo esta tempo-dose-dependente (MANCIN et al., 1998). Diferente dos nossos resultados, GIORGI et al. (1993), mostraram que o veneno bruto da Crotalus durissus terrificus apresentou atividade analgésica central-cerebral, que foi evidenciada através do teste da placa quente e esta ação foi confirmada, anos mais tarde, por PICOLO et al. (1998).
O último teste realizado no presente trabalho foi o teste da retirada da cauda, com a finalidade de se esclarecer a presença ou não de ação analgésica medular no veneno bruto da serpente Bothrops moojeni (BARS, 2001). Este teste é largamente utilizado para testar drogas analgésicas que interferem na nocicepção espinhal, envolvendo o movimento reflexo de origem espinhal rápido e vigoroso de retirada da cauda (D'AMOUR & SMITH, 1941; SMITH et al., 1943; JACOB &
RAMABADRAN, 1978; RAFFA et al., 1992).
O veneno bruto de Bothrops moojeni não aumentou o tempo de permanência do terço apical da cauda imersa em banho-maria em nenhuma das doses testadas (0,05 mg/Kg; 0,1 mg/Kg e 0,2 mg/Kg) indicando não possuir ação analgésica medular.
PICOLO et al. (1998) obtiveram resultado semelhante. O veneno de Crotalus durissus terrificus não modificou os níveis basais do tempo de latência ao estímulo doloroso através do teste da retirada da cauda.
GIORGI et al. (1993) mostraram que o efeito antinociceptivo do veneno da Crotalus durissus terrificus foi antagonizado pela naloxona, indicando ter uma ação opióide. No veneno da Crotalus durissus, LOPES (2005) isolou uma fração com
ação analgésica periférica e demonstrou que a ação era mediada pelo sistema opióide. Continuando os estudos, GOMES (2007) mostrou que a fração isolada do veneno da Crotalus durissus collilineatus crotamina negativa apresenta ação predominantemente em receptores opióides periféricos do tipo k.
Em nenhum dos testes desse estudo o grupo de animais que recebeu o pré-tratamento com a naloxona (5,0 mg/Kg), i.p., teve a atividade antinociceptiva do veneno bruto de Bothrops moojeni bloqueada sugerindo o não envolvimento do sistema opióide no mecanismo de ação do veneno.
Embora a naloxona não tenha demonstrado o envolvimento do sistema opióide no mecanismo de ação do veneno bruto de Bothrops moojeni, estudos posteriores serão necessários para determinar quais receptores estão envolvidos, assim como a descoberta do mecanismo pelo qual ocorre a ação analgésica do veneno.
Importante salientar que após 24 horas do término dos experimentos antinociceptivos, os limiares de dor nos animais em que foram administradas todas as doses do veneno retornaram aos valores semelhantes aos controles, mostrando que o veneno não causou nenhum dano irreversível importante na fisiologia da dor.
A descoberta de substâncias analgésicas periféricas, que não atingem os grandes centros nervosos, está sendo o alvo de muitas pesquisas. Logo, a atividade antinociceptiva periférica do veneno da serpente Bothrops moojeni encontrada abre grandes perspectivas para um futuro uso deste como ferramenta para o desenvolvimento de novos medicamentos eficazes e com menos efeitos colaterais, o que difere dos atuais opióides que são comumente utilizados nos tratamentos das dores agudas.
7 CONCLUSÕES
Dos resultados obtidos, pode-se inferir que o veneno bruto da serpente Bothrops moojeni tem atividade antinociceptiva e age de maneira periférica demonstrado pela ação no teste de contorções e ausência de efeitos no teste da placa quente e retirada da cauda (Tail-Flick);
O veneno apresentou atividades antinociceptivas neurogênica e inflamatória, demonstradas pelos resultados obtidos nas fases 1 e 2 do teste da formalina, respectivamente;
Os efeitos antinociceptivos do veneno bruto da serpente Bothrops moojeni não foram revertidos pela naloxona, mostrando que o sistema opióide não está envolvido no mecanismo de ação deste veneno;
O veneno em estudo pode conter compostos que servirão como modelo para o desenvolvimento de novos analgésicos com potencial terapêutico no controle das dores agudas.
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