Bothrops moojeni AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DO VENENO DA SERPENTE

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

INSTITUTO SUPERIOR DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS

JOSÉ PEREIRA REBOUÇAS JÚNIOR

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DO VENENO DA SERPENTE Bothrops moojeni

FORTALEZA 2010

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JOSÉ PEREIRA REBOUÇAS JÚNIOR

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DO VENENO DA SERPENTE Bothrops moojeni

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Estadual do Ceará como requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas

Orientador: Prof. Dr. Krishnamurti de Morais Carvalho

FORTALEZA 2010

JOSÉ PEREIRA REBOUÇAS JÚNIOR

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DO VENENO DA SERPENTE Bothrops moojeni

Aprovado em: 24/ 06/ 2010

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________

Prof^o.Dr. Krishnamurti de Morais Carvalho - Orientador Universidade Estadual do Ceará – UECE

_______________________________________

Prof^o. Dr. Bruno Andrade Cardi Universidade Estadual do Ceará – UECE

_______________________________________

Prof^a. Dra. Silvânia Maria Mendes Vasconcelos Universidade Federal do Ceará - UFC

Aos meus pais, familiares e amigos, que sempre apoiaram as minhas decisões, incentivaram-me nos momentos difíceis e vibraram nas minhas vitórias.

Obrigado por todo o amor ofertado.

AGRADECIMENTOS

A Deus, minha fonte de inspiração, o grande motivador de nossas vidas.

Aos meus pais, Rebouças e Socorro, que nunca mediram esforços para que eu pudesse chegar até aqui e que sempre foram para mim um exemplo de dignidade e retidão.

Á minha família, em especial minhas tias Fátima e Neuma, que sempre depositaram em mim uma confiança ímpar.

Aos meus amigos Arilson, Leane, Everton, Cátia e Oriana, que foram companheiros e incentivadores.

Ao Prof. Dr. Krishnamurti de Morais Carvalho, por ter contribuído na minha formação, desde a iniciação científica, pelo acompanhamento, sua prestimosa amizade e por ter partilhado seus valiosos conhecimentos.

Ao Prof. Dr. Bruno Andrade Cardi, por sua co-orientação, atenção e colaboração na construção da minha dissertação.

A Profa. Dra. Silvânia Maria Mendes Vasconcelos, por ter se disponibilizado a participar da minha banca, contribuindo com sua competência.

À minha grande amiga Carol, pela paciência, companheirismo e pelo extremo apoio durante todos os momentos da minha vida acadêmica.

Ás minhas amigas de laboratório Milena e Karol, que tanto colaboraram no desenvolvimento dos meus experimentos.

Á todos que fazem parte do Laboratório de Toxinologia e Farmacologia Molecular, pelo auxílio e bom convívio.

Aos meus amigos de mestrado e por toda a vida, Raquel, Jones, Leidiane, Sarah, Albertina e Graciana, pela amizade e pelos momentos de descontração durante essa difícil caminhada.

Aos Professores do Mestrado, pelos conhecimento e pela exemplar condução durante esses dois anos.

Á Rosa Germana, pela grande colaboração nos experimentos no laboratório e por sua amizade.

As secretárias Ecila e Lindalva e a todos os funcionários do mestrado, pela disponibilidade.

Aos animais que doaram suas vidas pelo progresso da ciência.

A FUNCAP, pelo apoio financeiro para realização deste trabalho.

“Um homem pode ser medido pelo tamanho dos seus sonhos.”

Fernando Pessoa

RESUMO

Avaliação da atividade antinociceptiva do veneno da serpente Bothrops moojeni. JOSÉ PEREIRA REBOUÇAS JÚNIOR. Orientador: Prof^o. Dr.

Krishnamurti de Morais Carvalho. Dissertação de Mestrado. Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas, Universidade Estadual do Ceará - UECE, 2010.

Estudos têm sido desenvolvidos visando a busca de novas substâncias analgésicas que proporcionem um tratamento eficaz no alívio das dores intensas. Assim, o objetivo desse trabalho foi estudar a atividade antinociceptiva do veneno bruto da serpente Bothrops moojeni em modelos experimentais. O efeito antinociceptivo central e periférico do veneno bruto foi avaliado em quatro ensaios farmacológicos:

teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético, teste da formalina, teste da retirada da cauda (tail-flick) e teste da placa quente. Esse efeito foi comparado com o do analgésico clássico morfina e o envolvimento do sistema opióide foi verificado através do uso da naloxona, antagonista opióide clássico. Em todos os testes realizados foram utilizados camundongos swiss (Mus musculus) (n = 6) e tanto o veneno bruto de Bothrops moojeni como a morfina foram administrados por via intraperitoneal. No teste de contorções abdominais, o veneno bruto apresentou atividade analgésica periférica nas doses de 0,025 mg/Kg (24,00 ± 2,77 ); 0,05 mg/Kg (12,38 ± 2,61); 0,1 mg/Kg (8,50 ± 1,21) e 0,2 mg/Kg (4,40 ± 0,60) em relação ao controle negativo (35,38 ± 2,37). A dose de 0,2 mg/Kg inibiu as contorções abdominais em aproximadamente 87,5% e foi significativamente diferente das doses de 0,025 mg/Kg (32,1%); 0,05 mg/Kg (65,0%) e 0,1 mg/Kg (76,0%). No teste da formalina, fase 1, o veneno bruto inibiu, de forma significativa, o tempo de lambida na pata injuriada apresentando atividade antinociceptiva de origem neurogênica nas doses de 0,1 mg/Kg (70,00 ± 6,09) e 0,2 mg/Kg (51,86 ± 5,14) em relação ao controle negativo (111,40 ± 5,08). As doses de 0,2 mg/Kg e 0,1 mg/Kg inibiram o tempo de lambida em aproximadamente 37,0% e 53,5%, respectivamente. Na fase 2 do teste da formalina, o veneno bruto apresentou atividade antinociceptiva nas doses de 0,025 mg/Kg (156,3 ± 6,22); 0,0 5mg/Kg (88,14 ± 11,96), 0,1 mg/Kg (63,71

± 7,09) e 0,2 mg/Kg (42,45 ± 5,25) em relação ao controle negativo (222,70 ± 17,75), demonstrando atividade analgésica de origem inflamatória. A dose de 0,2 mg/Kg inibiu o tempo de lambida em aproximadamente 81,0% e foi significativamente diferente das doses de 0,025 mg/Kg (30,0%); 0,05 mg/Kg (60,5%) e 0,1 mg/Kg (71,5%). No teste da placa quente e da retirada da cauda, o veneno bruto não apresentou atividade antinociceptiva central-cerebral e medular, respectivamente, em nenhuma das doses testadas. Foi verificado também que a naloxona (5,0 mg/kg), intraperitoneal, não foi capaz de bloquear o efeito antinociceptivo do veneno bruto em nenhum dos testes realizados, provavelmente indicando que seu mecanismo de ação não envolve a via opióide. Conclui-se assim que o veneno bruto da serpente Bothrops moojeni apresentou atividade antinociceptiva periférica, e possui um potencial biológico para ser utilizado como ferramenta para o estudo da nocicepção, podendo servir para o desenvolvimento de novos medicamentos para tratamento da dor.

Palavras-chave: Bothrops moojeni, veneno bruto, atividade antinociceptiva.

ABSTRACT

Evaluation of antinociceptive activity from the venom of Bothrops moojeni.

JOSÉ PEREIRA REBOUÇAS JR. Supervisor: Prof.. Dr. Krishnamurti de Morais Carvalho. Master´s Dissertation. Course of Academic Master in Physiology Science. Superior Institute of Biomedics Science, UECE, 2010.

Studies have been developed in search of new analgesic substances that provide an effective treatment for the relief of severe pains. The objective of this study was to investigate the antinociceptive effect from the venom of Bothrops moojeni in experimental models. The central and peripheral antinociceptive effect of crude venom was evaluated in four pharmacological tests: the writhing test induced by acetic acid, the formalin test, the tail-flick test and the hot plate test. This effect was compared with the classic analgesic morphine and the involvement of the opióide system was verified through the use of naloxona, opióide antagonist classic. In all tests were used swiss mice (Mus musculus) (n = 6) and route of administration of crude venom of Bothrops moojeni and morphine was the intraperitoneal. In the writhing test, the crude venom showed peripheral analgesic activity at doses of 0,025 mg/kg (24,00 ± 2,77); 0,05 mg/kg (12,38 ± 2,61); 0,1 mg/kg (8,50 ± 1,21) and 0,2 mg/kg (4,40 ± 0,60) compared to negative control (35,38 ± 2,37). The dose of 0,2 mg/Kg inhibited the writhing in approximately 87,5% and was significantly different from doses of 0,025 mg/Kg (32,1%); 0,05 mg/Kg (65,0%) and 0,1 mg/Kg (76,0%). In the formalin test, phase 1, the crude venom inhibited significantly the time to lick the injured leg showing antinociceptive activity of neurogenic origin in doses of 0,1 mg/kg (70,00 ± 6.09) and 0,2 mg/kg (51,86 ± 5,14) compared to negative control (111,40 ± 5,08). In phase 2 of the formalin test, the crude venom showed antinociceptive activity at doses of 0,025 mg/kg (156,3 ± 6,22); 0,05 mg/kg (88,14 ± 11,96); 0,1 mg/kg (63,71 ± 7,09) and 0,2 mg/kg (42,45 ± 5,25) compared to negative control (222,70 ± 17,75), showing analgesic activity of inflammatory origin. The dose of 0,2 mg/kg inhibited the licking time in approximately 81,0% and was significantly different from doses of 0,025 mg/kg (30,0%); 0,05 mg/kg (60,5%) and 0,1 mg/kg (71,5%). In the hot plate and tail-flick, the crude venom didn´t show antinociceptive activity of central-brain and spinal cord, respectively, in any of the doses tested. It was also found that naloxone (5,0 mg/kg), intraperitoneal, was unable to block the antinociceptive effect of crude venom on any of the tests, probably indicating that its mechanism of action doesn´t involve the opioid route. It is therefore concluded that the crude venom of Bothrops moojeni showed antinociceptive activity peripherally and have a biological potential to be used as a tool for the study of nociception, which may serve to develop new drugs to treat pain.

Keywords: Bothrops moojeni, crude venom, antinociceptive activity.

LISTA DE ABREVIATURAS

 ºC - graus Célsius

 ATP – adenosina trifosfato

 beta

 CCK – colecistoquinina

 CGRP - peptídeo relacionado ao gen da calcitonina

 cm - centímetros

 δ – delta

 DL50 – Dose Letal 50%

 g - grama (s)

 i.p. - intraperitoneal

 i.v. - intravenosa

 k – kappa

 K⁺ - potássio

 Kg - quilograma (s)

 mg - miligrama (s)

 min - minuto (s)

 mL - mililitro (s)

 mu

 L – microlitro (s)

 NKA – neurocinina A

 NKB – neurocinina B

 NO - óxido nítrico

 PG – prostaglandinas

 s - segundo (s)

 SG - substância gelatinosa

 SNC - sistema nervoso central

 SNP – sistema nervoso periférico

 SP - substância P

 SVMPs - metaloproteases dos venenos das serpentes

 P.M. – peso molecular

LISTA DE FIGURAS

Figura 01: Via ascendente da nocicepção... ... 19

Figura 02: Teoria do portão de MELZACK e WALL ... ... 21

Figura 03: Estrutura química da morfina... ... 22

Figura 04: Exemplar adulto de Bothrops moojeni. ... ... 27

Figura 05: Injeção na cavidade peritoneal de camundongo ... ... 42

Figura 06: Modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético ... ... 42

Figura 07: Injeção subplantar de formalina 4% ... ... 43

Figura 08: Reação à injeção subplantar de formalina 4% ... ... 43

Figura 09: Aparelho placa quente ... ... 44

Figura 10: Teste da placa quente – animal respondendo ao estímulo (lambidas)... 44

Figura 11: Aparelho banho-maria ... ... 45

Figura 12: Atividade antinociceptiva do veneno bruto de Bothrops moojeni no teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético ... ... 50

Figura 13: Efeito da naloxona na atividade antinociceptiva do veneno bruto de Bothrops moojeni no teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético ... ... 51

Figura 14: Atividade antinociceptiva do veneno bruto de Bothrops moojeni no teste da formalina – fase 1 ... ... 52

Figura 15: Efeito da naloxona na atividade antinociceptiva do veneno bruto de Bothrops moojeni no teste da formalina – fase 1... ... 53

Figura 16: Atividade antinociceptiva do veneno bruto de Bothrops moojeni no teste da formalina – fase 2 ... ... 54

Figura 17: Efeito da naloxona na atividade antinociceptiva do veneno bruto de Bothrops moojeni no teste da formalina – fase 2... ... 55

Figura 18: Atividade antinociceptiva do veneno bruto de Bothrops moojeni no teste da placa quente ... ... 56

Figura 19: Efeito da naloxona na atividade antinociceptiva veneno bruto de Bothrops moojeni no teste da placa quente ... ... 57

Figura 20: Atividade antinociceptiva do veneno bruto de Bothrops moojeni no teste da retirada da cauda (Tail-Flick) ... ... 58

Figura 21: Efeito da naloxona na atividade antinociceptiva veneno bruto de Bothrops moojeni no teste da retirada da cauda (Tail-Flick) ... ... 59

LISTA DE TABELAS

Tabela 01: Exame físico e observação de animais em estudo de toxicidade – adaptada e traduzida de LOOMIS & HAYES, 1996 ... 40 Tabela 02: Exame físico e observação de animais em estudo de toxicidade –

Resultados do veneno bruto de Bothrops moojeni (VB) ... 48 Tabela 03: Resultado do teste da DL50 do veneno bruto de Bothrops moojeni

...49

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ... 15

1.1 DOR ... 15

1.1.1 Aspectos gerais ... 15

1.1.2 Tipos de dor ... 16

1.1.3 Vias neuronais envolvidas na percepção da dor ... 17

1.2 ANALGÉSICOS OPIÓIDES ... 22

1.3 AS SERPENTES E O VENENO BOTRÓPICO...25

1.4 ATIVIDADE ANALGÉSICA NOS VENENOS DE SERPENTES ... 33

2 JUSTIFICATIVA ... 36

3 OBJETIVOS ... 37

3.1 OBJETIVO GERAL ... 37

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 37

4 MÉTODOS ... 38

4.1 MATERIAIS ... 38

4.1.1 Reagentes ... 38

4.1.2 Aparelhos e instrumentos ... 38

4.2 MÉTODOS EXPERIMENTAIS ... 39

4.2.1 Animais ... 39

4.2.2 Obtenção do veneno da serpente Bothrops moojeni ... 39

4.3 ENSAIOS FARMACOLÓGICOS ... 40

4.3.1 Avaliação da Toxicidade ... 40

4.3.2 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético (0,8%)...41

4.3.3 Teste da formalina (4,0%) ... 43

4.3.4 Teste da placa quente ... 44

4.3.5 Teste da retirada da cauda (Tail-Flick)...45

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 46

5 RESULTADOS ... 47

5.1 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE ... 47

5.2 TESTE DAS CONTORÇÕES ABDOMINAIS INDUZIDAS POR ÁCIDO ACÉTICO (0.8%0 ... 50

5.3 TESTE DA FORMALINA (4,0%) ... 52

5.3.1 Fase 1 ... 52

5.3.2 Fase 2 ... 54

5.4 TESTE DA PLACA QUENTE ... 56

5.5 TESTE DA RETIRADA DA CAUDA (Tail-Flick)... 58

6 DISCUSSÃO ... 60

7 CONCLUSÃO ... 65

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 66

1 INTRODUÇÃO

1.1 DOR

1.1.1 Aspectos gerais

A dor é definida pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP), 1994, como sendo “uma experiência emocional e sensorial desagradável associada com uma lesão tecidual real ou potencial ou descrita em termos de tal lesão”. OLIVEIRA (1979) descreve a dor como um alerta que o Sistema Nervoso Central (SNC) utiliza para sinalizar um processo de agressão ao organismo com risco para a sua integridade física. Este alerta desencadeia um conjunto de reações de adaptação, de ordem psicológica, autonômica e motora, visando afastar o organismo da causa da agressão, preservando-o (MILLAN, 1999; WOOLF et al., 1999; VITOR et al., 2008).

Apesar das sensações dolorosas serem um aviso do qual o organismo se utiliza para sinalizar um processo de agressão, a problemática da dor acompanha a humanidade na medida em que interfere na homeostasia do indivíduo e da sua relação com o meio (PIRES, 2007). A inadequação dos tratamentos atuais disponíveis para essa condição se deve, em grande parte, à compreensão ainda incompleta dos processos dolorosos (PEREIRA, 2004).

A dor apresenta dois componentes importantes: o componente sensorial e o componente emocional/afetivo. O componente sensorial, que corresponde ao mecanismo neurofisiológico, que permite, por meio da ativação de receptores, a transmissão e interpretação do estímulo nocivo, que em geral, é forte o suficiente para produzir lesão tecidual. O componente emocional corresponde à percepção do estímulo doloroso pelo indivíduo, que é seguida pela tomada de consciência e pela reação à dor. É uma resposta afetiva à percepção do estímulo doloroso (RAMADABRAN & BANSINATH, 1996; JULIUS & BASBAUM, 2001; ALMEIDA et al., 2004). Assim, a quantificação da mesma, e conseqüentemente da analgesia, sofre influências de vários fatores incluindo o estado emocional, razão da principal dificuldade de mensuração da dor (CAMPBELL & LAHUERTA, 1983).

A dor se manifesta de diferentes formas e por isso não pode ser entendida ou tratada como uma entidade única (BESSON, 1999). Cada tipo possui mecanismos próprios e necessita de manejo específico, sendo, portanto, imprescindível o entendimento preciso de cada um deles. A compreensão destes mecanismos, dos mediadores envolvidos e das adaptações que sofre o organismo é importante para o desenvolvimento de novos fármacos analgésicos que atuem no controle específico deste sintoma.

1.1.2 Tipos de dor

De acordo com o tipo de lesão e/ou mediadores envolvidos, a dor pode ser denominada nociceptiva (estimulação excessiva dos nociceptores), neurogênica (associada à lesão do tecido neural), neuropática (associada à disfunção de um nervo) ou psicogênica (associada com fatores psicológicos). Além disso, podem ocorrer manifestações dolorosas decorrentes de algumas desordens como a hiperalgesia (sensibilidade exacerbada a um estímulo doloroso), alodinia (dor em resposta a um estímulo não-doloroso) e hiperstesia (sensibilidade anormal a um estímulo sensorial) (BESSON & CHAOUCH, 1987; DRAY et al., 1994; BESSON, 1999; CARR & GOUDAS, 1999).

O processo doloroso é classificado de várias formas, mas o critério temporal é o mais utilizado por levar em consideração o tempo de sua atividade.

Quanto à duração de ação, a dor pode ser aguda, transitória ou crônica. Quando o episódio doloroso é transitório, ocorre ativação dos nociceptores sem que haja dano tecidual. A dor aguda geralmente está associada com uma lesão tecidual recente, ativação de nociceptores no local da lesão, e pode desaparecer até mesmo antes da cura do dano tecidual (CARR & GOUDAS, 1999). Já a dor crônica ocorre devido a uma lesão ou patologia, podendo ser perpetuada por outros fatores além daqueles que causaram a dor propriamente dita, e pode permanecer por meses ou anos (LOESER & MELZACK, 1999). A dor crônica pode acarretar conseqüências físicas, comportamentais, mentais, psicológicas e psicossociais, além de envolver grave estresse emocional.

A dor aguda tem um valor biológico adaptativo já que se desenvolve em resposta a um estímulo potencialmente nocivo ao tecido atuando como um

sinalizador da integridade tecidual, promovendo respostas protetoras (SERRA, 1999;

AGUGGIA, 2003; CORTELLI & PIERANGELI, 2003; VITOR et al., 2008).

A dor crônica, por sua vez, não possui caráter protetor. Sua duração excede a do reconhecimento natural de um estímulo e pode estar presente na ausência de qualquer agente indutor identificável (SERRA, 1999; AGUGGIA, 2003;

CHONG & BAJWA, 2003). Geralmente não é bem localizada e tende a ser maciça, contínua ou recorrente (MERSKEY et al., 1986; SMITH et al., 1986; FÜRST, 1999;

VITOR et al., 2008). A dor crônica pode acarretar conseqüências físicas, comportamentais, mentais, psicológicas e psicossociais, além de envolver grave estresse emocional. A dor crônica difere substancialmente da dor aguda em relação à sua persistência, alterações adaptativas, tais como neuroplasticidade em vários níveis do sistema nervoso, e dificuldade de tratamento (IADAROLA & CAUDLE, 1997; BESSON, 1999; BASBAUM et al., 2000).

1.1.3 Vias neuronais envolvidas na percepção da dor

A dor é uma experiência sensorial desagradável de caráter subjetivo. A percepção sensorial, nocicepção, compreende a transmissão e o processamento da informação dolorosa. Assim, a estimulação nociva detectada pelos receptores periféricos é codificada como uma mensagem nociceptiva, a qual é progressivamente transmitida e processada em centros nervosos superiores. Já a subjetividade da sensação dolorosa ocorre porque a informação nociceptiva atinge não apenas regiões do sistema somatossensorial, mas também o sistema límbico (AGUGGIA, 2003; MILLAN, 1999).

A dor é iniciada com a detecção de um estímulo nocivo por sensores periféricos chamados nociceptores. Eles são sensibilizados quando o estímulo é potencialmente perigoso, ou seja, excede uma determinada faixa considerada fisiológica (MILLAN, 1999). Os nociceptores estão presentes na maioria dos tecidos corporais, incluindo pele, osso, músculo, maior parte dos órgãos internos, vasos sanguíneos e coração, estando ausentes no encéfalo, embora sejam encontrados nas meninges (BEAR et al., 2002). Eles são divididos em quatro subtipos principais, de acordo com os estímulos dolorosos a que respondem: mecanorreceptores (estímulos mecânicos), quimiorreceptores (estímulos químicos), receptores térmicos

(estímulos térmicos) e receptores polimodais. Os três primeiros respondem a um único tipo de estímulo, enquanto que o último pode responder aos três tipos já mencionados (JOHNSON, 2000).

Após a ativação dos nociceptores específicos, produz-se dor percebida de forma localizada, com intensidade proporcional à magnitude do estímulo e duração correspondente à vigência do estímulo doloroso. Uma estimulação mais intensa leva à ativação de nociceptores polimodais que desencadeia uma sensação de dor difusa e persistente, que perdura após o término do estímulo doloroso agudo. Nesta fase, ocorre o aparecimento dos aspectos emocionais da dor, que se tornam mais importantes nos quadros de dor crônica (AGUGGIA, 2003).

Há ainda os chamados nociceptores silenciosos (“silent” ou “sleeping”) os quais existem em pequena proporção nas fibras aferentes primárias e não respondem normalmente a estímulos. No entanto, quando são estimulados por mediadores inflamatórios ou após a administração de agentes flogísticos (pró- inflamatórios), estes nociceptores apresentam atividade espontânea ou tornam-se sensibilizados e passam a responder a estímulos sensoriais (JULIUS & BASBAUM, 2001).

Os nociceptores transmitem as informações dolorosas para a medula espinhal através das fibras sensoriais aferentes, sendo estas de dois tipos: Aδ (delta) e C. As fibras Aδ (delta) são fibras mielinizadas com diâmetro médio variando de 2 - 6 m, que possui velocidade de condução de 12 - 30 m/s e são responsáveis pela condução rápida do estímulo doloroso. As fibras C, por sua vez, são fibras amielínicas responsáveis pela condução lenta do impulso doloroso. Possui diâmetro pequeno que pode variar de 0,4 - 1,2 m e apresenta velocidade de condução de 0,5 - 2 m/s. Estas são as principais fibras responsáveis pela condução deste impulso (FURST, 1999; GRUBB, 1998; SHELLEY & CROSS, 1994). As fibras Aδ são responsáveis pela condução da “primeira dor”, a qual se caracteriza por ser rápida, aguda e pontual, e as fibras C transmitem a “segunda dor”, sendo esta atrasada, difusa e fraca (JULIUS & BASBAUM, 2001).

A transmissão aferente do estímulo nociceptivo relaciona informações vindas da periferia em direção ao SNC, sendo dependente da integração em três níveis do sistema nervoso: a medula espinhal, o tronco encefálico e o córtex

cerebral. As vias nociceptivas aferentes compreendem um sistema regulado por três neurônios que conectam a periferia ao córtex (Figura 01). A ascensão do estímulo nociceptivo inicia-se pelos neurônios de primeira ordem, constituídos por fibras Aδ e C, cujos corpos celulares estão localizados no gânglio da raiz dorsal e que recebem informações vindas da superfície corporal. Estes neurônios realizam sinapses com os corpos celulares dos neurônios de segunda ordem na região da comissura anterior, os quais estão localizados na lâmina II do corno dorsal na medula espinhal (AGUGGIA, 2003).

Figura 01 - Via ascendente da nocicepção. Fonte: BEYZAROV, 2006.

Os axônios dos neurônios de segunda ordem, por sua vez, cruzam para o lado oposto da medula espinhal e ascendem em direção ao córtex através do trato espinotalâmico anterolateral, a principal via ascendente para informação sobre dor e temperatura (AGUGGIA, 2003; MILLAN, 1999). Estas fibras conectam-se com os neurônios talâmicos de terceira ordem, que se projetam para o córtex

somatosensorial primário e para o sistema límbico, conferindo à dor características emocionais (AGUGGIA, 2003).

O tálamo desempenha um papel fundamental na integração do impulso doloroso. A partir do tálamo, neurônios de terceira ordem transmitem impulsos para o córtex cerebral, onde ocorre o processamento que resulta em consciência da dor (FÜRST, 1999).

Neurotransmissores e neuropeptídios, como as taquicininas [substância P (SP), neurocinina A (NKA) e neurocinina B (NKB)], peptídeo geneticamente relacionado com a calcitonina (CGRP), colecistocinina (CCK), somatostatina, óxido nítrico (NO), prostaglandinas (PG) e aminoácidos excitatórios, como glutamato e aspartato, estão envolvidos na transmissão do impulso doloroso das fibras aferentes primárias para os centros superiores. Eles são liberados pelos terminais dos aferentes primários no corno dorsal da medula, onde exercem importante papel na modulação da transmissão nociceptiva (CAO et al., 1995; ERICSSON et al., 1995;

WOOLF, 1994; MILLAN, 1999). Atuam em receptores que estão distribuídos nos nervos periféricos e centrais pela associação à proteína G e formação de segundo - mensageiros, como as proteínas quinases A, C e G, adenosina monofosfato cíclico (AMPc) e a mobilização de cálcio (MILLAN, 1999).

O glutamato constitui o maior neurotransmissor que promove a comunicação dos neurônios aferentes periféricos, quando estimulados, com os neurônios do corno dorsal (NESTLER et al., 2001).

Além das vias nociceptivas ascendentes necessárias à interpretação da sensação dolorosa, o organismo humano dispõe de sistemas moduladores da dor (VÍTOR et al., 2008). Isto significa que o sistema nervoso central (SNC) não atua apenas como um centro receptor destes estímulos, mas que também modula a transmissão desta informação permitindo-nos selecionar determinadas informações sensoriais como o que ocorre, por exemplo, em circunstâncias de alto estresse para o indivíduo. A descoberta destas vias regulatórias da dor iniciou-se em 1965, quando MELZACK e WALL propuseram a existência de um sistema de controle da dor por comporta, a “Teoria do portão” (Figura 02), pelo qual a entrada dos impulsos nociceptivos no SNC seria regulada pela atividade de interneurônios inibitórios presentes no corno dorsal da medula espinhal, mais especificamente na área denominada substancia gelatinosa (SG, lâmina II de Rexed). Posteriormente,

ocorreram descobertas que demonstraram que a eficácia de comporta também poderia ser regulada por estruturas supraespinhais. Pesquisas subseqüentes comprovaram que a substancia cinzenta pareaquedutal, faz parte de um circuito central que controla a transmissão nociceptiva no corno dorsal da medula espinhal (FIELDS & BASBAUM, 1999).

FIGURA 02: Teoria do Portão de MELZACK & WALL. Fonte: BEAR et al., 2002.

Existe também a participação de vias descendentes no "mecanismo de portão", que controlam a transmissão de impulsos no corno dorsal. Uma parte essencial desse sistema descendente é a área cinzenta periaquedutal do mesencéfalo, que recebe impulsos de muitas regiões cerebrais, incluindo o hipotálamo, o córtex e o tálamo. A principal via neuronal ativada pela estimulação da área cinzenta periaquedutal dirige-se inicialmente para uma área do bulbo próxima à linha média, conhecida como núcleo da rafe magna que utiliza a serotonina como neurotransmissor, e a partir daí percorre o funículo dorsolateral da medula espinhal,

formando conexões sinápticas com os interneurônios do corno dorsal. Os interneurônios atuam ao inibir a descarga dos neurônios espinotalâmicos através do núcleo reticular paragigantocelular, de modo que esse sistema inibitório descendente possa fazer parte de uma alça de retroalimentação reguladora, através da qual a transmissão pelo corno dorsal seja controlada de acordo com a quantidade de atividade que alcança o tálamo (RANG et al., 2001).

A via inibitória descendente constitui um importante alvo para ação dos analgésicos opióides (RANG et al., 2001; BENNETT, 2005). Visto que baixas doses de morfina ou endorfinas na área cinzenta periaquedutal, no núcleo da rafe magna ou no corno dorsal podem causar analgesia, além de tal efeito ser inibido pela naloxona, que é um bloqueador específico opióide. Assim, supõe-se que os receptores opióides sejam os locais dessas drogas (BEAR et al., 2002).

1.2 ANALGÉSICOS OPIÓIDES

Opióide é um termo geral usado para identificar qualquer substância, natural ou sintética, cuja ação analgésica é semelhante aos efeitos da morfina e que possuam a naloxona como antagonista (RANG et al., 2008).

A morfina, alcalóide mais importante do ópio, pertence ao grupo fenantrênico e possui na sua fórmula estrutural dois grupos hidroxilas (CARVALHO

& VIANNA, 1994) (Figura 03).

FIGURA 03 – Estrutura química da morfina. Fonte: http://www.dq.fct.unl.pt

Os opióides foram os grupos mais estudados dentre os outros grupos de drogas, permitindo, assim, o desenvolvimento de novos agentes dotados de vantagens significativas em relação à morfina. Mesmo com esse estudo, a morfina continua sendo o agente convencional para avaliação de qualquer novo agente (DUGGAN & NORTH, 1984; PASTERNAK, 1993; YAKSH, 1997).

Snyder e colaboradores, em 1973, conseguiram provar, através de estudos de ligação, que os opióides são reconhecidos por receptores específicos.

Os tipos de receptores opióides são μ (mu), κ (kappa), δ (delta) e receptores nociceptina. Eles diferem entre si por diferentes afinidades aos ligantes opióides endógenos e também às drogas opióides exógenas (CHILDERS, 1997). Os principais ligantes opióides endógenos são: encefalina, seletiva para receptores tipo δ; dinorfina, seletiva para receptores tipo κ; e endorfina a qual possui alta afinidade para receptores tipo δ e μ e baixa afinidade para receptores tipo κ (GOLDSTEIN &

NAIDU, 1989; LORD et al., 1977).

Os receptores μ são responsáveis pela maioria dos efeitos analgésicos dos opióides. A morfina e a maioria de seus análogos exercem seus efeitos analgésicos atuando principalmente nestes receptores. Os receptores δ, são mais importantes na periferia. Já os receptores k induzem analgesia mediada principalmente nos locais espinhais (GOLDSTEIN & NAIDU, 1989). Os resultados da estimulação do receptor da nociceptina não estão ainda totalmente esclarecidos, tanto mais que em algumas situações experimentais a sua estimulação provoca analgesia e em outras hiperalgesia.

Os receptores opióides estão expressos nos nervos envolvidos na transmissão da dor (trajetória ascendente sensorial) e modulação (trajetória inibitória descendente) na periferia, na medula espinhal e no cérebro (MANSOUR et al., 1994). Eles previnem a ativação e sensibilização dessas fibras e inibem a liberação de neurotransmissores, por estarem presentes nas fibras C dos nervos aferentes primários sensitivos (STEIN et al., 1993).

Os receptores opióides são acoplados à proteína G, que inibem a adenilato ciclase, reduzindo assim o conteúdo intracelular de AMPc (DHAWAN et al., 1996). Três subtipos de receptores, μ (mu), κ (kappa), δ (delta), exercem esse efeito, além de exercerem efeitos sobre os canais iônicos através de um acoplamento direto da proteína G ao canal. Através desse mecanismo, os opióides promovem a abertura dos canais de potássio e inibem a abertura dos canais de cálcio regulados por voltagem que constituem os principais efeitos observados na membrana. Esses efeitos sobre a membrana reduzem tanto a excitabilidade neuronal (aumentando a condutância do potássio e provocando hiperpolarização da membrana) quanto à

liberação de transmissores (devido à inibição da entrada de cálcio) (NORTH, 1993;

WAY et al., 2002).

Na medula, a morfina inibe a transmissão de impulsos nociceptivos através do corno dorsal e suprime os reflexos medulares nociceptivos, até mesmo em pacientes com transecção da medula espinhal. Essa ação se dá por meio da inibição da liberação de substância P dos neurônios do corno dorsal in vitro e in vivo, através de um efeito inibitório pré-sináptico sobre as terminações centrais dos neurônios aferentes nociceptivos (RANG et al., 2001).

Há também evidências de que os opióides inibem a descarga das terminações aferentes nociceptivas na periferia, particularmente em condições de inflamação, quando ocorre aumento da expressão dos receptores opióides por neurônios sensoriais (SMITH & REYNARD, 1995; WAY et al., 2002). A injeção de morfina na articulação do joelho, após cirurgia produz analgesia eficaz, abalando o antigo princípio de que a analgesia dos opióides é exclusivamente um fenômeno central (STEIN & YASSOURIDIS, 1997).

Os opióides variam não apenas na sua especificidade para receptores, mas também na sua eficácia sobre os diferentes tipos de receptores. Assim, alguns agentes atuam como agonistas em um tipo de receptor (possuem um efeito máximo para analgesia, e incluem a maioria das drogas típicas semelhantes à morfina, por exemplo, codeína, metadona e dextropropoxifeno) e como antagonistas (drogas que não possuem atividade farmacológica intrínseca, porém bloqueiam os efeitos dos agonistas, por exemplo, naloxona e naltrexona) ou agonistas parciais em outros (possuem baixa eficácia, combinam certo grau de atividade agonista e antagonista em diferentes receptores, por exemplo, nalorfina e pentazocina) (SMITH &

REYNARD, 1995; RANG et al., 2001).

Como utilização clínica, os agonistas opióides são empregados no alívio da dor aguda intensa ou crônica moderada, como as associadas às dores pós- operatórias, dores associadas às lesões agudas, cólica renal ou biliar, infarto agudo do miocárdio ou câncer. Essas substâncias podem ser utilizadas, também, na sedação pré-operatória e anestesia suplementar (CLAYTON & STOCK, 2006;

BODNAR et al., 2008).

Os efeitos colaterais adversos esperados, quando se utilizam os agonistas opióides, são: cefaléia leve, confusão, sedação, náusea, vômitos, sudorese (sintomas que aparecem, geralmente, com a dose inicial), desorientação, hipotensão ortostática (manifestada por tonteira e fraqueza, ocorrendo no início da terapia) e constipação (advinda do uso contínuo dessas drogas). A depressão respiratória, retenção urinária, também são efeitos colaterais relatados (CLAYTON &

STOCK, 2006).

Os agonistas opióides podem produzir tolerância ou dependência psicológica e física com o uso contínuo e prolongado, sendo essas as principais limitações clínicas aos seus usos (JEFFE & MARTIN, 1996; OSSIPOV et al., 2003;

MERRER et al., 2009). A tolerância ocorre na necessidade de doses cada vez maiores para se conseguir o mesmo efeito analgésico. O uso contínuo de agentes opióides pode ocasionar respostas hiperalgésicas durante uma retirada precipitada dos mesmos. Esta observação sugere que um processo pró-nociceptivo possa ser desenvolvido. Uma sensibilidade dolorosa anormal incluindo hiperalgesia e alodinia ocorre em animais que estão recebendo administração de opióides na ausência de interrupções. Esse efeito paradoxal de sensibilidade dolorosa induzida por opióides pode contribuir para a manifestação de tolerância aos mesmos (MAO, 2002;

OSSIPOV et al., 2003).

1.3 AS SERPENTES E O VENENO BOTRÓPICO

Os venenos e toxinas de origem animal têm sido utilizados nos laboratórios de fisiologia e farmacologia como ferramentas de grande importância para uma melhor compreensão de diversos processos envolvidos na regulação da homeostase. Já foram isoladas diversas classes de moléculas com atividade em diversos sistemas, algumas delas levando ao desenvolvimento de novos fármacos.

Estudos neurofarmacológicos têm demonstrado a presença de atividade analgésica, tanto periférica quanto central, em venenos de serpentes ou de substâncias isoladas destes (RAJENDRA et al., 2004; CURY & PICOLO, 2006).

As serpentes fazem parte do Filo Chordata, Classe Reptilia, Ordem Squamata e Subordem Serpentes. Cerca de 3000 espécies são conhecidas no

mundo, sendo que, apenas aproximadamente 10 a 14% das mesmas são peçonhentas (CARDOSO & BRANDO, 1982; PINHO & PEREIRA, 2001). No Brasil, as principais serpentes peçonhentas de importância médica pertencem às famílias Viperidae, com os gêneros Bothrops (jararaca ou urutu), Crotalus (cascavel ou maracambóia) e Lachesis (surucucu), Elapidae, com o gênero Micrurus e Colubridae, com os gêneros Philodryas e Clelia (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001).

As serpentes do gênero Bothrops pertencem à família Viperidae, são todas solenóglifas, ou seja, apresentam presas grandes, agudas e ocas que permanecem paralelas ao crânio em repouso e alcança 90° durante o bote, e são de grande distribuição pelo Brasil (RIBEIRO, 1990). Possuem cauda lisa, não tem chocalho e as suas cores variam muito, dependendo da espécie e da região onde vivem. Jararacas, como são conhecidas, habitam preferencialmente áreas úmidas, apresentam hábito noturno e são muito agressivas (FRANÇA & MÁLAQUE, 2003).

Este gênero apresenta mais de 30 espécies e subespécies distribuídas do sul do México até o norte da Argentina, e corresponde ao grupo de serpentes mais importante do ponto de vista médico porque representa 90% dos casos de acidentes ofídicos no Brasil (CARDOSO, 2003).

Existem no Brasil 19 espécies de serpentes que pertencem ao gênero Bothrops (REPTILE DATABASE, 2010), dentre elas, a espécie Bothrops moojeni (Figura 04), conhecida no Distrito Federal, e nos Estados de Goiás, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Piauí, Maranhão, Minas Gerais, São Paulo e Paraná (CAMPBELL & LAMAR, 1989).

FIGURA 04 – Exemplar adulto de Bothrops moojeni. Fonte: © 2005 Wolfgang Wuster

Os venenos das serpentes do gênero Bothrops (jararacas, jararacuçu, urutu, caiçaca, cotiara etc.) quando ensaiados in vitro, in vivo ou em acidentes com humanos e animais apresentam ações proteolíticas (ação citotóxica direta nos tecidos por frações proteolíticas do veneno), coagulante (transformando diretamente o fibrinogênio em fibrina) e hemorrágica (causada pelas hemorraginas), sendo os distúrbios hemostáticos e os sinais locais como edema, hemorragia e necrose as principais manifestações clínicas observadas (MARUYAMA et al., 1990; SANCHEZ et al., 1992). Na resposta inflamatória aguda as lesões locais, como edema, bolhas e necrose, têm patogênese complexa e possivelmente, decorrem da atividade de proteases, hialuronidases e fosfolipases, da liberação de mediadores da resposta inflamatória (principalmente de prostaglandinas D2 e E2), da ação das hemorraginas sobre o endotélio vascular e a da ação pró-coagulante do veneno (FRANÇA et. al., 2003). A necrose, manifestação local mais importante limita-se ao subcutâneo, mas pode comprometer estruturas mais profundas, como tendões, músculos e ossos, podendo causar distrofias e deixar seqüelas (LOMONTE et al., 1990; SELISTRE et al., 1990).

Os venenos das serpentes são misturas complexas, contendo compostos cujas proporções e características específicas variam entre as diferentes espécies conhecidas (TU, 1977; GOMES, 2007). A toxicidade do veneno deve-se à presença

de enzimas e proteínas e sua ação letal é atribuída principalmente às neurotoxinas (STOCKER, 1990). A composição de aminoácidos, a estrutura primária de numerosas neurotoxinas, inibidores enzimáticos, entre outros, vêm sendo determinados em inúmeros venenos (IWANAGA et al., 1976). Um processo específico de adaptação à dieta, durante a evolução, pode ter dado origem aos vários componentes do veneno, sendo extremamente eficazes frente aos itens específicos da dieta e apresentando menor eficácia às demais presas disponíveis (JORGE DA SILVA & AIRD, 2001).

Diferenças na composição do veneno podem ser encontradas entre indivíduos pertencentes à mesma família, gênero e espécie (MEBS, 2001). A composição do veneno das serpentes pode apresentar variações associadas com a origem geográfica, habitat, variação sazonal, dieta, idade e sexo (MACKESSY, 1988; CHIPPAUX et al., 1991; MACKESSY et al., 2003; FURTADO et al., 2006;

QUEIROZ et al., 2008). Vários componentes foram isolados de venenos de Bothrops incluindo proteases, tais como a serina e metaloproteases, fosfolipases A2, L- aminoácido oxidase, hialuronidase e lectinas tipo C (ALAM et al., 1996; KINI, 2006).

Para o gênero Bothrops, já foram identificadas variações na composição do veneno em função da distribuição geográfica nas espécies Bothrops jararaca, Bothrops neuwiedi, Bothrops asper, Bothrops atrox e Bothrops moojeni (SCHENBERG, 1961; ARAGÓN & GUBENSKEK, 1981; ASSAKURA et al., 1992;

RODRIGUES et al., 1998).

Venenos de serpentes são ricos em fosfolipases A2 (PLA2s) e estas enzimas induzem uma grande variedade de efeitos tóxicos e farmacológicos, como miotoxicidade, neurotoxicidade, cardiotoxicidade, hemólise, incoagulabilidade sanguínea, edema e efeitos sobre a agregação plaquetária (GUTIÉRREZ &

LOMONTE, 1997; HARRIS et al., 2000; SINGH et al., 2000, SOARES et al., 2004a, b; PERCHUC et al., 2010). Fosfolipases encontradas em serpentes pertencentes à família Viperidae são subdivididas em dois grupos: ASP49 PLA2s, que possuem um resíduo de ácido aspártico na posição 49, apresentando atividade catalítica sobre substratos artificiais e LYS49 PLA2s, com um resíduo de lisina na posição 49 tendo baixa ou nenhuma atividade catalítica (ARNI & WARD, 1996; OWNBY et al., 1999;

SOARES et al., 2004a). Além disso, homólogos cataliticamente inativos que

possuem serina (KRIZAJ et al. 1991) ou alanina (LIU et al. 1991) na posição 49 já foram isolados. A atividade de dano celular provocada pela ação de venenos de serpentes é devido à ação de um largo espectro de componentes bioativos presentes nesses venenos. Alguns venenos possuem substâncias com atividades específicas e direcionadas ao músculo estriado esquelético, sendo denominadas miotoxinas (MEBS & OWNBY, 1990).

Atividades inflamatórias têm sido descrita para as fosfolipases encontradas nos venenos (CHACUR et al., 2003). Elas induzem edema e promovem o recrutamento de células inflamatórias (CHAVES et al., 1995; LANDUCCI et al., 1998; LLORET & MORENO, 1993). Além disso, algumas desgranulam mastócitos (CHOI et al., 1989; LANDUCCI et al., 1998, MORENO et al., 1992), ativam neutrófilos (PRUZANSKI et al., 1991; WANG & TENG, 1992) e são quimiotáticos para células endoteliais (RIZZO et al., 2000).

A necrose muscular é uma conseqüência grave de picadas de serpentes do gênero Bothrops que pode levar à perda permanente de tecido ou função e, em casos extremos, levar à amputação. Mionecrose pode ser devido a uma ação indireta, como conseqüência 1) da degeneração do vaso e isquemia causada por metaloproteases hemorrágicas, que são enzimas que são responsáveis pela degradação de proteínas da matriz extracelular, ou 2) por um efeito direto de homólogos das PLA2s miotóxicas nas membranas plasmáticas das células musculares (GUTIÉRREZ & LOMONTE, 1997; OWNBY, 1998; OWNBY et al., 1999;

GUTIÉRREZ, 2002; SOARES et al., 2004a).

A primeira miotoxina do veneno de Bothrops foi isolada em 1984 por Gutiérrez e colaboradores, utilizando o veneno de Bothrops asper (GUTIÉRREZ, OWNBY & ODELL, 1984). Alguns anos depois, LOMONTE et al. (1990) isolaram três miotoxinas de Botrhops, duas do veneno de B. moojeni e uma de Bothrops atrox, e descreveram a composição química e atividades biológicas destes venenos.

Levando em consideração a espécie Bothrops moojeni, três miotoxinas já foram isoladas e descritas até hoje (PERCHUC et al., 2010):

MOO-1 – possui elevada atividade fosfolipase.

Miotoxina I (MjTX-I) (SOARES et al., 2000) – foi purificada por cromatografia de fase reversa C-18; apresentou atividade fosfolipásica, sendo classificada como uma LYS49 PLA2 com PM em torno de 13,4 kDA e pI 8,2. A análise dos aminoácidos mostrou um conteúdo básico e altamente hidrofóbico.

Análise da toxicidade revelou uma DL50 de 8,5 mg/Kg, bem como toxicidade sobre mioblastos e miotúbulos em cultura.

Miotoxina I possui atividade bloqueadora pré-sináptica em preparações neuromusculares in vitro. Investigações das atividades farmacológicas mostram:

rápida destruição tecidual (MEBS & OWNBY, 1990; GUTIÉRREZ &

LOMONTE,1995), hemólise (CONDREA et al., 1981), degranulação de mastócitos (LANDUCCI et al., 1998) e formação de edema (LOMONTE et al., 1993).

Miotoxina II (MjTX-II) (SOARES et al., 1998) – os autores isolaram outra LYS49 PLA2 ao qual denominaram miotoxina II. Por cromatografia em CM- Sepharose, obtiveram uma fração que, após liofilização com subseqüente análise de mobilidade eletroforética, se apresentou como banda única com peso molecular aproximado de 14 kDa na presença de DTT, agente redutor que desfaz as pontes dissulfeto das proteínas, e 27 kDa, na ausência do mesmo.

Miotoxina II induziu mionecrose e bloqueou a junção neuromuscular em testes com ratos. Possui atividade antimicrobiana, inibindo o crescimento de Escherichia coli e Candida albicans, e atividade antitumoral contra algumas células humanas e de ratos. É um efetivo agente parasiticida contra Leishmania sp. e Schistosoma mansoni. Apresenta toxicidade 10 a 15% maior que a miotoxina I devido à alta basicidade da sua região C-terminal (STÁBELI et al., 2006).

Em incubação com heparina, os efeitos bactericida, neurotóxico e citotóxico são abolidos devido ao bloqueio da região C-terminal, região esta responsável por essas atividades (STÁBELI et al., 2006).

LOMONTE et al. (1994 a, b) descreveram pela primeira vez a ligação da heparina com um sítio rico em lisina da MjTX-II de Bothrops asper, resultando na neutralização das suas atividades citolítica e miotóxica in vitro e in vivo. A heparina pode interagir de uma forma não covalente carga-dependente com a miotoxina

básica, formando um complexo ácido-base inativo, levando à inibição da atividade miotóxica (PERCHUC et al., 2010).

Os venenos das serpentes viperídeas pertencentes ao gênero Bothrops são especialmente ricos em ácido L-amino oxidases (PESSATTI et al., 1995; TAN &

PONNDURAI, 1991), que são enzimas glicoprotéicas que catalisam a desaminação oxidativa de L-aminoácidos, produzindo α-cetoácidos, peróxido de hidrogênio e amônia. Estas enzimas participam do envenenamento atuando sobre plaquetas, induzindo citotoxicidade e apoptose celular. Na espécie Bothrops moojeni, uma dessas enzimas foi isolada em alto grau de pureza através de duas etapas cromatográficas e apresentou atividade bactericida e anti-Leishmania (TEMPONE et al., 2001).

Inflamação e dor estão freqüentemente associadas com o envenenamento botrópico tanto em humanos como em animais experimentais (ROSENFELD, 1971;

GUTIÉRREZ et al., 1980, 1981, 1984; GUTIÉRREZ & LOMONTE, 1989, 1995;

TREBIEN & CALIXTO, 1989; CURY et al. 1994, 1997; TEIXEIRA et al., 1994;

CHAVES et al., 1995; ARROYO et al., 1999; ROCHA et al., 2000; CHACUR et al., 2001). O mecanismo envolvido na gênese e desenvolvimento da inflamação induzida pela picada das serpentes do gênero Bothrops tem sido investigada nas últimas décadas (TREBIEN & CALIXTO, 1989; FLORES et al., 1993; CURY et al., 1994; CURY et al., 1997; BURIGO et al., 1996; FARSKY et al., 1997; GONÇALVES

& MARIANO, 2000). TEIXEIRA et al., (1994) demonstraram primeiramente que a hiperalgesia causada pelo veneno botrópico é independente de respostas edematogênicas induzidas pelo veneno e é mediada por mediadores lipídicos como as prostaglandinas e leucotrienos. ROCHA et al. (2000) mostraram a participação de aminas biogênicas e metaloproteases na hiperalgesia induzida pelo veneno de Bothrops jararaca. CHACUR et al. (2002) sugeriram que receptores de bradicinina

B2 estariam envolvidos na hiperalgesia induzida pelo veneno de Bothrops jararaca.

A hiperalgesia inflamatória depende da ativação de nociceptores quimiossensíveis a mediadores inflamatórios (DRAY, 1995, 1997). No teste da pressão de pata, carragenina e lipopolissacarídeos evocaram a hiperalgesia resultante da liberação de uma cascata de vários mediadores. Bradicinina, que inicia a cascata, estimula a liberação de fator de necrose tumoral (TNF-α) que, por sua

vez, induz a liberação interleucina-1-β (IL-1-β), a interleucina-6 (IL-6) e interleucina-8 (IL -8). Posteriormente, a IL-1 e IL-6 estimulam a produção de eicosanóides, enquanto que a IL-8 estimula a produção de aminas simpatomiméticas (NAKAMURA

& FERREIRA, 1987; CUNHA et al. 1991 e 1992; FERREIRA et al. 1993; POOLE et al. 1999). Eicosanóides e aminas simpatomiméticas são considerados os mediadores finais desta cascata da hiperalgesia (CHACUR et al. 1992).

As substâncias responsáveis pela hemorragia local são as metaloproteases dos venenos das serpentes (SVMPs). Elas podem ser divididas em quatro classes, dependendo da estrutura de domínio (FOX & SERRANO, 2005): PI (SVMPs com apenas um domínio metaloproteinase); PII (SVMPs sintetizados com o domínio metaloproteinase e com o domínio desintegrina); PIII (SVMPs sintetizados com domínio metaloproteinase, domínio desintegrina e rica em domínios cisteína) e PIV (SVMPs assim como a estrutura do PIII mais domínios lectina ligadas por pontes dissulfeto) (BJARNASON & FOX, 1995). Pelo menos nove SVMPs foram isoladas de Bothorps jararaca (MANDELBAUM et al., 1976; MANDELBAUM et al., 1982;

MARUYAMA et al., 1992; MARUYAMA et al., 1993; PAINE et al. 1992), mas a jararagina tem sido a melhor estudada. Além do pró-domínio e domínio metaloprotease, este componente contém um domínio desintegrina e é rica em domínios cisteína (PAINE et al., 1992), que são características de PIII SVMPs (FOX

& SERRANO, 2005). Além de sua potente atividade hemorrágica, jararagina também pode processar o precursor do fator de necrose tumoral (TNF-α), uma citocina que tem sido correlacionada com o desenvolvimento de dermonecrose induzida pelo veneno de Bothrops jararaca (MOURA-DA-SILVA et al., 1996; CLISSA et al., 2001;

ZYCHAR et al. 2010).

A resposta inflamatória local causada pelo veneno de Bothrops não é induzida por um único constituinte do veneno, mas parece ser o resultado da ação de vários, agindo rapidamente nos tecidos conjuntivo e muscular e induzindo a liberação de vários mediadores inflamatórios endógenos (TREBIEN & CALIXTO, 1989; PERALES et al., 1992; TEIXEIRA et al.,1994; MOURA-DA-SILVA et al., 1996;

GONÇALVES & MARIANO, 2000; CHACUR et al., 2002). Componentes isolados de venenos de Bothrops e classificados como metaloproteases, fosfolipases A2 e proteases de serina podem induzir reações inflamatórias (TEIXEIRA et al., 2003;

SERRANO & MAROUN, 2005; MOURA-DA-SILVA et al. 2007), mas sua

contribuição relativa para a resposta inflamatória causada pelo veneno bruto é pouco entendido.

O fato do veneno de Bothrops moojeni ter uma ação hiperalgésica conhecida não exclui uma possível atividade antinociceptiva. Na literatura existem estudos utilizando venenos de animais, como é o caso da abelha Apis mellifera, em que a injeção do veneno da abelha pode produzir tanto um primeiro efeito nociceptivo e em seguida um prolongado efeito analgésico. O veneno apresenta potencias produtores de dor, incluindo histamina e fosfolipase A2 e, portanto, não é surpreendente que diversos relatos descrevam um efeito nociceptivo após uma injeção intraplantar (CHEN et al. 1998; KWON et al. 2001; LARIVIERE et al. 2000).

Em contraste, a injeção subcutânea do veneno diluído da abelha em um ponto de acupuntura tem sido utilizada clinicamente na medicina oriental para a produção de um potente efeito analgésico. Em apoio a essa abordagem, ROH et al. (2006) demonstraram que a injeção subcutânea do veneno produz ação antinociceptiva em modelos animais de dor aguda e persistente.

A busca pela ação antinociceptiva nas toxinas animais foi intensa nas últimas décadas. Resultados satisfatórios foram encontrados principalmente em toxinas de serpentes do gênero Crotalus. Entretanto, na literatura inexiste esse estudo sobre o veneno de outras serpentes como aquelas do gênero Bothrops.

1.4 ATIVIDADE ANALGÉSICA NOS VENENOS DE SERPENTES

Para o controle da dor e de certas doenças já foi relatado o uso de venenos de serpentes (BRAZIL, 1934; HABERMEHIL, 1981). Alguns pesquisadores já usaram, no início do século passado, o veneno da cobra Naja tripudians, em substituição à morfina nos casos inoperáveis de câncer, demonstrando que o veneno possui uma ação mais potente e duradoura que a morfina e, também, foi demonstrada uma atividade sobre os tumores, promovendo diminuição ou estacionamento da lesão (BRAZIL, 1934).

Foi observada atividade antinociceptiva em uma fração de baixo peso molecular do veneno de Crotalus durissus terrificus, tendo esta uma ação semelhante à endorfina (GIORGI, BERNARDI & CURY, 1993). O efeito foi

antagonizado pela naloxona, mostrando assim o envolvimento de receptores opióides na atividade antinociceptiva desta fração. O efeito analgésico central foi devido, principalmente, a uma resposta supra-espinhal integrada evidenciada pelo teste da placa-quente, mas não no teste da retirada da cauda (PICOLO et al., 1998).

A crotoxina, uma neurotoxina isolada do veneno da Crotalus durissus terrificus, possui atividade analgésica em modelos de dor aguda (ZHANG et al., 2006), bem como em modelos de dor neuropática (NOGUEIRA-NETO et al., 2008), mas esta parece não envolver a via opióide, pois seu efeito não foi antagonizado pela naloxona. Também foi observado que a crotoxina é a fração responsável pela potente e duradoura atividade antiinflamatória do veneno bruto da Crotalus durissus terrificus em camundongos (NUNES et al., 2007, 2010).

Em 2008 verificou-se que um novo peptídeo, a crotalfina, presente em veneno de Crotalus durissus terrificus, possui um potente efeito antinociceptivo na dor neuropática, induzida por constrição do nervo ciático em ratos (GUTIERREZ et al., 2008), bem como na hiperalgesia induzida pela administração de carragenina ou prostaglandina (KONNO et al., 2008). O efeito antinociceptivo da crotalfina também foi avaliado em modelos de nocicepção térmica através do teste da placa quente, que avalia a atividade no sistema nervoso central, e o teste da retirada da causa, que avalia a atividade central medular. A crotalfina aumentou o tempo de permanência do animal na placa quente, mas não aumentou o tempo de reação do animal no teste da retirada da cauda, demonstrando uma atividade cerebral, mas não medular (KONNO et al., 2008).

Foi evidenciado, através da administração da naloxona, que a atividade antinociceptiva da crotalfina é mediada pela ativação de receptores opióides (GUTIERREZ et al., 2008; KONNO et al., 2008). KONNO et al. (2008) mostrou que os receptores opióides κ e  estão envolvidos no efeito antinociceptivo da crotalfina no modelo de hiperalgesia induzida por prostaglandina e carragenina.

Levando em consideração o fato de que a atividade analgésica envolve mecanismos centrais e periféricos mediados por receptores opióides e sendo a fração testada de baixo peso molecular, os autores sugeriram que a mesma poderia conter peptídeos que seriam responsáveis por esta ação (GIORGI et al.; 1993;

PICOLO et al., 2003). Entretanto, MANCIN et al. (1998) sugeriram que a crotamina

seria a fração do veneno da Crotalus durissus terrificus responsável pela maior ação antinociceptiva tanto central como periférico, já que a mesma constitui cerca de 20%

do veneno total.

MOREIRA (2003) demonstrou através de testes clássicos de antinocicepção com o veneno de Crotalus durissus collilineatus, que, tanto o veneno crotamina positivo quanto o crotamina negativo, possuem atividade antinociceptiva, sugerindo que a antinocicepção do veneno crotamina positivo envolve tanto mecanismos periféricos quanto centrais espinhal e supra-espinhal, enquanto o veneno crotamina negativo apresentaria apenas antinocicepção periférica. Esse estudo indicou a existência de outras substâncias, além da crotamina, envolvidas na analgesia periférica, mas não excluiu o papel da crotamina.

LOPES (2005) fracionou o veneno da Crotalus durissus collilineatus por cromatografia líquida de alta eficiência isolando uma fração com atividade analgésica periférica. A autora observou que ação era mediada pelo sistema opióide, visto que foi bloqueada pela naloxona. Essa fração apresentou uma ação (dose a dose) 500% maior que a morfina no teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético.

GOMES (2007) aprofundou o estudo sobre o mecanismo de ação da fração isolada do veneno da Crotalus durissus collilineatus crotamina negativa e demonstrou que ela atua em receptores opióides periféricos do tipo kappa, sem ação no sistema nervoso central.

OLINDA (2010) demonstrou a atividade antinociceptiva periférica e central de um novo fator extraído do veneno da Crotalus durissus collilineatus. A autora comparou a ação analgésica do fator com a morfina e o mesmo se mostrou mais potente que o analgésico opióide clássico quando comparado mol a mol. Os efeitos antinociceptivos do fator foram bloqueados pela naloxona sugerindo um envolvimento do sistema opióide em seu mecanismo de ação.

Observando as diversas atividades biológicas das moléculas presentes no veneno das serpentes, bem como a necessidade de encontrar fármacos mais eficazes no tratamento das dores agudas, seria também importante a realização desse estudo no veneno bruto de outras serpentes, tais como o da Bothrops moojeni.

2 JUSTIFICATIVA

Os atuais analgésicos, embora potentes, apresentam efeitos colaterais, tais como dependência física e psicológica, sedação e depressão respiratória, limitando os seus usos. Atualmente os venenos de animais, vêm sendo alvos de inúmeras pesquisas com finalidade de obter substâncias para uso terapêutico, inclusive no alívio das dores agudas e crônicas. Sendo assim, a relevância do presente estudo reside na busca de atividade antinociceptiva no veneno bruto da serpente Bothrops moojeni, que é pouco estudado neste aspecto, e que possa vir a ser utilizado como ferramenta para o desenvolvimento de fármacos analgésicos eficazes e com menos efeitos adversos.

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Pesquisar a existência da atividade antinociceptiva no veneno da serpente Bothrops moojeni.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Estudar, através de ensaios farmacológicos, a atividade antinociceptiva do veneno bruto da serpente Bothrops moojeni em dores agudas, comparando com a morfina, analgésico opióide clássico;

2. Verificar se a atividade antinociceptiva decorre de ação central e/ou periférica;

3. Avaliar o envolvimento do sistema opióide no efeito antinociceptivo do veneno bruto da serpente Bothrops moojeni através do uso da naloxona, antagonista opióide clássico.

4 MÉTODOS

4.1 MATERIAIS

4.1.1 REAGENTES

 Ácido acético glacial, Merck, Brasil;

 Formaldeído 37%, Merck, Brasil;

 Cloreto de Sódio, Reagen, Brasil;

 Água bidestilada, Universidade Estadual do Ceará, Brasil;

 Morfina, Sigma, USA;

 Naloxona, Sigma, USA;

 Solução de cloreto de Sódio 0,9%, Farmace, Brasil.

4.1.2 APARELHOS E INSTRUMENTOS

 Agitador de tubos, Phoenix AP56, Brasil;

 Agulha Hipodérmica, Méd Needle, Brasil;

 Balança Analítica, Marte - AM550, Brasil;

 Balança de precisão, Mettler - Balance, USA;

 Cronômetro, Leônidas Trackmater, Alemanha;

 pHmetro, Micronal, Brasil;

 Pipetas automáticas, Gilson, França;

 Placa Quente, Socrel DS37;

 Refrigerador;

 Seringa descartável 1 ml, Plastipak, Brasil;

 Tail Flick, Insigth;

 Termômetro, ASPIN 09654.10, Brasil.

4.2 MÉTODOS EXPERIMENTAIS

4.2.1 ANIMAIS

Foram utilizados camundongos Swiss (Mus musculus), machos, adultos, de 2 a 4 meses, , com peso variando entre 25 e 30 g, provenientes do Biotério do Instituto Superior de Ciências Biomédicas (UECE). Os animais foram mantidos em gaiolas próprias, recebendo ração padrão e água ad libitum. Nas 24 horas antes dos ensaios, os animais foram mantidos na sala onde vai ser desenvolvido o estudo, a fim de adaptá-los ao ambiente experimental. A manipulação dos animais, antes, durante e depois dos experimentos, foi conduzida de acordo com as regras de manipulação de animais de laboratório, preconizadas pela Sociedade Brasileira de Ciências em Animais de Laboratório (SBCAL). O projeto foi submetido à aprovação junto ao Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Estadual do Ceará - CEUA/UECE - sob número de protocolo 58/2009(09233135-1).

4.2.2 OBTENÇÃO DO VENENO DA SERPENTE Bothrops moojeni

O pool de venenos de Bothrops moojeni foi gentilmente cedido pelo Prof.

Dr. Nelson Jorge da Silva Jr., do Centro de Toxinologia da Pontifícia Universidade Católica (PUC) de Goiás. Os venenos foram coletados por massagem das glândulas de serpentes adultas de ambos os sexos, em banho de gelo e depois submetido à desidratação em dessecador a vácuo contendo substância higroscópica. Após isso, o pool de venenos foi mantido a 4 °C até o momento do uso.

4.3 ENSAIOS FARMACOLÓGICOS 4.3.1 Avaliação da Toxicidade

Para avaliar a toxicidade do veneno da serpente Bothrops moojeni, foi determinada a DL50 (unidade tóxica de veneno definida como a quantidade capaz de em até 72 horas provocar a morte de 50% dos animais inoculados).

Grupos de camundongos (n = 6) foram administrados com doses crescentes (1,0; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 5,0; 6,0 ou 10,0 mg/Kg) de veneno bruto da serpente Bothrops moojeni (i.p.) e foram observados, inicialmente, durante as primeiras seis horas. Em seguida, os animais foram observados de doze em doze horas e após 24, 48 e 72 horas da inoculação do veneno bruto, o número de animais mortos foi contabilizado e a DL50 foi determinada. Durante o ensaio de toxicidade também observou-se outras alterações induzidas pelo veneno, levando-se em consideração a toxicidade aguda, baseada em parâmetros preconizados por Loomis (LOOMIS & HAYES, 1996) (Tabela 01, modificada).

TABELA 01 – Exame físico e observação de animais em estudo de toxicidade – adaptada e traduzida de LOOMIS & HAYES, 1996.

REAÇÕES ANALISADAS

Atividade Resposta somática

Redução ou aumento da atividade Locomotora

Aumento ou redução do comportamento de alisar-se

Saltos Aumento ou redução do comportamento

de coçar-se

Reações bizarras Esfregando o nariz

Movimentos de circo Prostração

Vaguear Prostração

Movimentos para trás Perda da consciência

Rodopiando Tremores

Lambendo as paredes do compartimento Exoftalmia

Movimentos de pá com o nariz Irritação nos olhos

Olhos vidrados Opacidade dos olhos

Movimentos circulares Piscando excessivamente

Fonação Reflexo da córnea

Aumento ou redução Ausente ou diminuído