Avaliação da variabilidade intra-específica das populações do T cruzi pela técnica de RAPD

Os perfis de RAPD foram determinados em 27 isolados com os iniciadores aleatórios (L15996, M13-40 e F-λgt11). Os produtos amplificados detectaram semelhanças entre os isolados pertencentes ao mesmo grupo genético do parasito e diferenças entre isolados de grupos genéticos distintos, gerando produtos de DNA de tamanho e intensidade variáveis. Devido à superposição de bandas superior a 3000 pares de base (pb), a análise foi realizada com as bandas que variaram entre 250-3000pb para todos os isolados. A Fig. 2 mostra o gel representativo usando o iniciador M13-40 com elevado compartilhamento de bandas em todos os isolados e entre aqueles representados por uma mesma cor. O compartilhamento de bandas entre todos os isolados foi de 73,7% considerando a média obtida com os três iniciadores e variou de 66% para o iniciador L15996, 75% para o M13-40 e 80% para o gt11-F.

Os perfis de RAPD dos isolados com o iniciador M13-40 foram selecionados para exemplificar os resultados. Esses dados sugerem similaridade mais elevada dentro de cada grupo genético do T. cruzi (TcI, TcII e TcIII) visualizados nos perfis de produtos amplificados abaixo de 500pb e acima de 1000pb (FIG. 2), e conforme a nomenclatura atual obtida por consenso de um grupo de especialistas (ZINGALES et al., 2009).

3000 2500 2000 1500 1000 750 253 250 500 RN 04 RN 12 RN 23 B RA NC O PM RN 01 RN 02 RN 03 RN 05 RN 06 RN 07 RN 08 RN 09 RN 10 RN 11 RN 13 RN 14 RN 15 RN 16 RN 17 RN 18 RN 19 RN 20 RN 21 RN 22 RN 25 RN 27 RN 28 RN 29 PM 3000 3000 2500 2500 2000 2000 1500 1500 1000 1000 750 750 253 253 250 250 500 500 RN 04 RN 12 RN 23 B RA NC O PM RN 01 RN 02 RN 03 RN 05 RN 06 RN 07 RN 08 RN 09 RN 10 RN 11 RN 13 RN 14 RN 15 RN 16 RN 17 RN 18 RN 19 RN 20 RN 21 RN 22 RN 25 RN 27 RN 28 RN 29 PM

FIGURA 2 - Gel poliacrilamida a 5% representativo dos perfis de RAPD do T. cruzi, obtidos de indivíduos e triatomíneos naturalmente infectados, com o iniciador M13-40. Nas canaletas das extremidades, o marcador de peso molecular (PM), e na penúltima canaleta, controle negativo da PCR (Branco). As cores representam grupos de isolados com elevado compartilhamento de bandas entre eles.

A análise da distância genética obtida com o programa Treecon correspondente aos isolados do T. cruzi utilizando o iniciador M13-40, evidenciou separação desses isolados em três braços principais (FIG. 3). Esses dados demonstraram que os isolados pertencentes ao mesmo grupo apresentam perfil genético ainda mais similar. O primeiro braço separou amostras obtidas de triatomíneos e de humanos oriundas de quatro municípios distintos (Caicó, Caraúbas, Serra Negra do Norte e Governador Dix-Sept Rosado), destacando que os isolados obtidos de hospedeiros e áreas geográficas diferentes foram geneticamente bem correlacionados. O segundo braço do fenograma reuniu amostras isoladas apenas de seres humanos procedentes dos municípios de Caraúbas, Angicos e Caicó. O terceiro braço separou os demais isolados obtidos de triatomíneos de duas espécies diferentes (T. brasiliensis e P. lutzi) capturadas em Caraúbas e Serra Negra do Norte (FIG. 3).

FIGURA 3 - Fenograma correspondente aos perfis de RAPD de isolados do T. cruzi obtidos de indivíduos e triatomíneos naturalmente infectados, construído pela UPGMA, usando matriz de distância genética obtida com o iniciador M13-40. As percentagens correspondem aos valores bootstrap (percentagens de vezes em que o agrupamento se manteve durante 1000 re-amostragens).

Os dados obtidos com o programa DNA POP para o iniciador M13-40 (ANEXO 7) corroboram com o agrupamento dos isolados obtidos com o programa Treecon, pois a similaridade genotípica foi evidenciada entre os isolados RN14 e RN15, obtidos de indivíduos procedentes do município de Caraúbas localizado na mesorregião oeste, com 100% de compartilhamento de bandas e pertencentes a um mesmo braço no fenograma. É interessante destacar que esse elevado compartilhamento de bandas também ocorre entre os isolados obtidos de diferentes hospedeiros procedentes de mesorregiões distintas, como é o caso das amostras RN01 e RN16, isoladas de T. brasiliensis e de indivíduo com sorologia reativa procedentes de Caicó (mesorregião central) e Caraúbas (mesorregião oeste) com 84% de bandas compartilhadas. No segundo braço o elevado compartilhamento de bandas pode ser destacado entre os isolados RN28 e RN29 com 95% de homogeneidade. Essas amostras foram obtidas de humanos em diferentes municípios (Angicos e Caicó) e são geneticamente bem correlacionadas. No terceiro braço, a homogeneidade das amostras foi evidenciada principalmente pelas amostras RN02 e RN05 isoladas do T. brasiliensis e procedentes de Serra Negra do Norte (mesorregião central) que compartilham 73% de bandas. O padrão elevado de compartilhamento de bandas (74%) entre os isolados RN02 e RN18 obtidos de diferentes espécies de triatomíneos (T. brasiliensis e P. lutzi) capturadas nos municípios Serra Negra do Norte e Caraúbas, localizados em mesorregiões distintas também pode ser

TcII

TcI

observado nesse braço. A comparação entre os isolados pertencentes a distintos braços do fenograma mostrou uma baixa similaridade. Como exemplo, os isolados RN14 e RN19 apenas com 58% de compartilhamento de bandas (FIG. 3). Esses dados demonstraram claramente que todos os isolados são geneticamente bem correlacionados, com similaridade genética ainda mais elevada entre isolados pertencentes ao mesmo grupo genético do T. cruzi e correspondente ao mesmo braço do fenograma.

O programa DNA POP mostra ainda que para esse iniciador o compartilhamento de bandas entre os isolados obtidos de humanos foi de 78,4% e entre os obtidos de triatomíneos foi de 79,3%, sendo 72,8% de compartilhamento entre isolados obtidos do T. brasiliensis e 85,3% entre isolados do P. lutzi.

A análise de isolados correspondente as distintas populações do T. cruzi e com similaridade genotípica tem sido relatado anteriormente por diferentes autores. Zalloum et al. (2005) verificaram elevado compartilhamento de bandas entre os isolados do T. cruzi dos grupos TcI e TcII obtidos de Didelphis marsupialis, triatomíneos e indivíduos infectados no Estado do Paraná. Esses autores sugeriram a presença de uma população do parasito TcI com perfil genético similar circulando entre vetores e reservatórios silvestres e a população do TcII entre humanos. Nesta mesma área, a análise de isolados do T. cruzi obtidos de reservatórios silvestres e de triatomíneos por eletroforese de isoenzimas demonstrou variabilidade clonal limitada sugerindo uma origem ancestral recente dessas populações do T. cruzi (SOCCOL et al., 2002). As amostras de pacientes chagásicos crônicos provenientes de diferentes áreas geográficas do Brasil e analisadas por RAPD demonstraram 71% de bandas compartilhadas entre todos os isolados, indicando claramente a presença de um grupo bastante correlacionado

(GOMES et al., 1998). No entanto, na Amazônia, cepas obtidas de indivíduos infectados por

via oral e na fase aguda, de primatas e do Rhodnius sp analisadas por RAPD e outros marcadores moleculares, demonstraram similaridade entre as amostras, possivelmente atribuída à mesma linhagem do T. cruzi. Evidenciando que essas populações são transmitidas pelo mesmo vetor na região amazônica e, circulam em ciclos de transmissão independentes determinadas pelos ecótopos específicos de seus hospedeiros vertebrados e invertebrados (MARCILI et al., 2009).

Neste trabalho, a caracterização das populações do T. cruzi por RAPD revelou três grupos distintos do parasito, geneticamente correlacionados entre si. Os resultados sugerem que nas comunidades rurais dos municípios circulam três populações do parasito, uma entre triatomíneos e humanos (braço 1 FIG.3), outra entre os humanos (braço 2 FIG. 3) e, ainda uma terceira circulando apenas entre triatomíneos (braço 3 FIG. 3). Uma mesma população do T. cruzi circulando entre triatomíneos (R. prolixus e T. dimidiata) e humanos foi relatada por

Luna-Marin et al. (2009) em 16 isolados do parasito no ciclo doméstico de transmissão na Colômbia. Os isolados foram separados em um grupo de amostras obtidas de triatomíneos e de humanos, e também em um segundo grupo de isolados apenas de triatomíneos, havendo heterogeneidade entre as amostras de grupos diferentes, sugerindo a presença de um determinado clone do T. cruzi circulando entre triatomíneos e humanos (LUNA-MARIN et al., 2009). A população do parasito que circula apenas entre triatomíneos poder ser caracterizada como mais heterogênea, devido à necessidade desses triatomíneos se alimentarem em hospedeiros de diferentes espécies, muitas vezes já infectados pelo T. cruzi, propiciando a formação de populações heterogêneas do parasito no hospedeiro invertebrado. Os ciclos naturais de transmissão do T. cruzi são abundantes e complexos, onde uma grande diversidade de mamíferos silvestres e vetores invertebrados são infectados por populações distintas do parasito (COURA et al., 2002). A população que se apresenta circulando entre humanos pode estar correlacionada com a teoria do filtro biológico (MACEDO & PENA, 1998). Essa teoria relata que o organismo humano age como um filtro biológico selecionando populações específicas do parasito, principalmente pela ação do sistema imune. Evidências experimentais têm demonstrado que cepas isoladas de pacientes chagásicos crônicos mostram baixa variabilidade genética do que aquelas obtidas de vetores e hospedeiros silvestres (GOMES et al., 1998; OLIVEIRA et al., 1998).

Os dados do presente trabalho, não demonstraram haver correlação entre a distância geográfica e a variabilidade intraespecífica das amostras do parasito. Esses achados também foram descritos em populações silvestres do T. cruzi obtidas de áreas geográficas distintas da América Central e do Sul com perfis genéticos homogêneos (CARRASCO et al., 1996). As cepas do T. cruzi obtidas de gambás, triatomíneos e indivíduos infectados no Estado do Paraná correspondentes a dois grupos diferentes T. cruzi I e T. cruzi II mostraram homologia entre os isolados, mas não houve correlação com a localização geográfica (ZALLOUM et al., 2005). Utilizando o RAPD, 56 cepas obtidas de triatomíneos, humanos e mamíferos silvestres provenientes de oito Estados do México mostraram homogeneidade em 97,6% do isolados correspondentes ao grupo T. cruzi I independente da localização geográfica (BOSSENO et al., 2002). Com o mesmo marcador molecular e iniciadores, 61 isolados do T. cruzi procedentes de pacientes chagásicos crônicos de diferentes áreas endêmicas do Estado de Minas Gerais, mostraram elevada homogeneidade, mas não foi possível agrupar as amostras de acordo com a origem geográfica. Além disso, foi relatada a presença de isolados geneticamente relacionados ou até mesmo idênticos, distanciados geograficamente e, ainda isolados geneticamente relacionados ou não, procedentes de uma mesma área endêmica ou próxima geograficamente (D’ ÁVILA et al., 2006).

No fenograma obtido com o iniciador L15996 também foi observado à separação dos isolados do T. cruzi em três braços principais do fenograma. O programa DNA POP (ANEXO 8) também demonstrou elevado compartilhamento de bandas entre isolados pertencentes ao mesmo braço, independentes da origem geográfica e dos hospedeiros que o isolado foi obtido. Como exemplo, pode-se destacar o RN02 obtido de T. brasiliensis e o RN04 obtido de P. lutzi que apresentaram 88% de homologia. A única diferença com relação ao iniciador já descrito foi em relação às amostras RN22, RN28 e RN29 que ficaram agrupadas em braços diferentes do fenograma. Esses dados reforçam a idéia de que existe uma população do T. cruzi circulando entre triatomíneos e humanos, indicando uma elevada adaptabilidade desse genótipo em infectar diferentes hospedeiros. Isolados obtidos de humanos, RN08 e RN16, procedentes dos municípios de Caraúbas e Serra Negra do Norte, de mesorregiões distintas, apresentaram 90% de compartilhamento de bandas demonstrando a presença dessa população do parasito em humanos (FIG. 4) que residem em mesorregiões diferentes. Dezoito cepas do T. cruzi obtidas de triatomíneos naturalmente infectados, capturados no domicilio e peridomicílio do Nordeste do Brasil foram analisadas por RAPD e MLEE. Os resultados demonstraram a presença de cinco populações diferentes do T. cruzi, no entanto, uma única população do parasito (TcI) se encontrava entre todos os vetores (PACHECO et al., 2005).

FIGURA 4 - Fenograma correspondente aos perfis de RAPD de isolados do T. cruzi obtidos de indivíduos e triatomíneos naturalmente infectados, construído pela UPGMA usando matriz de distância genética obtida com o iniciador L15996. As percentagens correspondem aos valores bootstrap (percentagens de vezes em que o agrupamento se manteve durante 1000 re- amostragens).

As amostras do T. cruzi analisadas com o iniciador λgt11-F mostraram que a topologia da árvore resultante dessa análise, também separou os isolados em três grupos principais, porém, com diferenças no posicionamento dos isolados RN22, RN28 e RN29 no fenograma. Os isolados RN28 e RN29 apresentaram 94% de bandas compartilhadas, destacando que apesar da mudança no posicionamento no fenograma essas amostras continuam bem correlacionadas, e o isolado RN22 ficou separado em um braço a parte do fenograma (FIG. 5). Em todas as análises, as amostras foram agrupadas evidenciando similaridade genotípica e, mais elevada entre os isolados pertencentes ao mesmo grupo, mesmo aqueles obtidos de hospedeiros e mesorregiões distintas (FIG. 5). Os dados obtidos usando o programa DNA POP com o iniciador λgt11-F (ANEXO 9) demonstraram que o compartilhamento de bandas entre todos os isolados foi de 80%, evidenciando maior similaridade genotípica entre as amostras, quando comparado aos iniciadores descritos anteriormente.

Tc I Tc III Tc II

FIGURA 5 - Fenograma correspondente aos perfis de RAPD de isolados do T. cruzi obtidos de indivíduos e triatomíneos naturalmente infectados, construído pela UPGMA usando matriz de distância genética obtida com o iniciador λgt11-F. As percentagens correspondem aos valores bootstrap (percentagens de vezes em que o agrupamento se manteve durante 1000 re- amostragens).

A análise da distância genética observada na FIG. 6 foi obtida a partir do consenso com os três iniciadores (M13-40, L15996 e λgt11-F) e observamos que os isolados também foram agrupados em três braços principais no fenograma, semelhante à obtida com o iniciador M13- 40. Por esta razão acredita-se que esse iniciador apresentou um elevado poder discriminatório de padrões de DNA polimórfico entre os isolados separando em três grupos genéticos do T. cruzi. Os perfis obtidos por consenso do RAPD permitiram o agrupamento do parasito em TcI, TcII e TcIII corroborando com os dados da caracterização molecular desses isolados usando outros marcadores que os classificou em três grupos genéticos TcI, TcII e TcIII (CÂMARA et al., 2010). Na área estudada, o RAPD permitiu agrupar os isolados do TcII no primeiro braço do fenograma, do TcIII no segundo e do TcI no terceiro. Vale a pena ressaltar que os isolados RN22, RN28 e RN29 foram agrupados em um mesmo braço do fenograma com o iniciador M13-40, e de fato, eles formaram o grupo do T. cruzi correspondente ao TcI. Este achado reforça que o iniciador M13-40, se mostrou melhor para o agrupamento dos isolados (FIG. 6).

TcI TcIII TcII

FIGURA 6 - Fenograma correspondente aos perfis de RAPD de isolados do T. cruzi obtidos de indivíduos e triatomíneos naturalmente infectados, construído pela UPGMA, usando matriz de distância genética obtida segundo a média dos três iniciadores. As percentagens correspondem aos valores bootstrap (percentagens de vezes em que o agrupamento se manteve durante 1000 re-amostragens).

O elevado compartilhamento de bandas entre todos os isolados, 73,7% de bandas compartilhadas, pode ser explicado pelo fato de que a maioria das amostras foi agrupada como TcII, com elevado grau de similaridade entre os isolados. Esse grupo genético TcII representa a maior parte dos isolados obtidos de seres humanos, no entanto, no RN, alguns indivíduos também foram infectados por populações do T. cruzi pertencentes ao grupo genético TcI.

Em 23 isolados obtidos de pacientes na fase aguda da doença, na Venezuela, demonstraram a infecção chagásica em humanos por TcI e TcII (AÑEZ et al., 2004). A possibilidade de que a infecção chagásica é devida, principalmente ao TcII tem sido confirmada por diferentes autores. Di Noia et al. (2002) usando marcadores imunológicos capazes de diferenciar o T. cruzi I do T. cruzi II demonstraram que mais de 87% dos soros de pacientes chagásicos da Argentina, Chile e Brasil foram reativos para o antígeno especifico para o T. cruzi II, enquanto apenas 5% exibiam um reconhecimento concomitante para os antígenos T. cruzi I e T. cruzi II. Nenhum dos pacientes analisados nesse estudo mostrou infecção exclusiva pelo T. cruzi I. O T. cruzi II foi detectado em todos os pacientes infectados, incluindo aqueles sem alterações clínicas e também em indivíduos com diferentes

Tc I Tc III Tc II

sintomas e vários processos patológicos em todas as formas clínicas da doença de Chagas (LAGES-SILVA et al., 2006). A análise por RAPD de 18 isolados do T. cruzi obtidos de recém-nascidos na Argentina identificou que todos correspondiam ao grupo do T. cruzi II (CORRALES et al., 2009). Esses dados sugerem que, pelo menos nos países do Cone Sul da América Latina, a infecção humana por T. cruzi é relacionada principalmente ao T. cruzi II (DI NOIA et al., 2002; _{TIBAYRENC, 2003; MACEDO et al., 2004). A presença do T. cruzi} I em indivíduos do RN é um dado que chama a atenção pelo fato dessas populações do parasito ter uma vasta distribuição geográfica em outros países como, Colômbia, Venezuela, México e, no Brasil, tem sido descrito especialmente no Estado do Amazonas, sendo nessa área o principal responsável pela manutenção da transmissão do parasito (COURA et al., 2002). Vários estudos demonstraram que essa população do T. cruzi foi descrita em diversas espécies de mamíferos arborícolas, com menos frequência em mamíferos terrestres e, esporadicamente, em mamíferos peridomiciliar e seres humanos (MILES et al., 1981, COURA et al., 2002).

Nossos resultados demonstraram que apenas três isolados obtidos de humanos, procedentes de três localidades distintas foram caracterizados como, TcI, corroborando com os dados que relatam a baixa frequência dessa população em humanos no Brasil. Estudos moleculares com o T. cruzi são realizados principalmente com amostras coletadas do sangue periférico do indivíduo e consequentemente, a presença de outras populações do parasito localizadas em outros órgãos não podem ser descartada. Dados recentes têm mostrado diferentes populações do parasito no sangue e no tecido cerebral de paciente soro positivo para HIV com reativação da doença de Chagas. Curiosamente, o T. cruzi I foi encontrado apenas no líquido cefalorraquidiano desse paciente e não no sangue periférico, sugerindo um tropismo dessa população por determinado orgão-alvo (BURGOS et al., 2008). Esses autores sugerem que o T. cruzi I circula em frequências mais elevadas nos países do Sul da América e que a baixa taxa de detecção desse genótipo é devido a baixa carga parasitaria presente na corrente sanguínea, como consequência do maior tropismo por orgãos-alvos.

O marcador genético RAPD demonstrou semelhanças genotípicas entre populações do T. cruzi pertencentes ao mesmo grupo e a classificação dos isolados em três grupos genéticos do parasito. Essas populações foram isoladas de cinco municípios localizados em mesorregiões distintas do Estado do RN e circulam entre os ciclos de transmissão silvestre, peridoméstico e doméstico.

Os dados obtidos pelo marcador genético RAPD mostraram semelhanças genotípicas entre populações pertencentes ao mesmo grupo do T. cruzi e, evidenciaram ainda que, esses isolados puderam ser classificados em três grupos genéticos do T. cruzi distintas usando

apenas a técnica de RAPD. Essas populações foram identificadas em cinco municípios localizados em mesorregiões distintas do estado do RN circulam entre triatomíneos e humanos.

5 CONCLUSÕES

► A soroprevalência da infecção pelo T. cruzi na zona rural do município de Caicó, RN, mostrou percentual mais baixo quando comparada ao inquérito sorológico nacional.

► Na área em estudo não foi detectada reatividade sorológica em crianças e adolescentes sugerindo que não houve novos casos da infecção pelo T. cruzi.

► O grupo de indivíduos com sorologia reativa ou indeterminada apresentou diferença significativa apenas quanto à idade. As demais variantes epidemiológicas analisadas não apresentaram diferenças significativas sugerindo que os grupos são homogêneos e estão expostos ao mesmo risco de adquirir a infecção.

► Os três iniciadores (L15996, M13-40 e F-λgt11) foram eficientes na descrição de padrões de DNA polimórfico entre os isolados do T. cruzi e o M13-40 se mostrou com elevado potencial discriminatório desses padrões.

► A análise da proporção de bandas compartilhadas obtidas com os perfis de RAPD utilizando os três iniciadores mostrou que os isolados do T. cruzi obtidos de indivíduos e de triatomíneos formaram um grupo geneticamente bem correlacionado.

► O marcador genético RAPD permitiu separar os isolados do T. cruzi em três grupos genéticos, TcI, TcII e TcIII circulando em hospedeiros vertebrados e invertebrados de diferentes municípios de mesorregiões distintas do Estado do RN.

► Os perfis genéticos dos isolados do T. cruzi determinados por RAPD não puderam ser correlacionados com a origem geográfica e os hospedeiros que o parasito foi isolado.

6 REFERÊNCIAS

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