Avaliações hormonais

3.5.4.1 Coletas de sangue e preparação de amostras

As amostras de sangue foram coletadas de 78 novilhas, pertencentes ao grupo total de 120 animais. Essas novilhas foram previamente escolhidas, da forma mais equilibrada possível, dentro do ganho de peso e do grau de sangue. Esses animais constituíram a amostra para coleta de sangue até o final do experimento.

Foi coletada uma amostra de 10 ml de sangue, de cada novilha selecionada, por punção da veia jugular com o emprego de tubos à vácuo, sem anticoagulante, deixando-se em repouso numa temperatura inferior a 5 o_{C. Num período máximo de 6}

horas, foi separado o soro, por decantação natural ou por centrifugação a 1800 rotações por minuto. O soro foi estocado a –20 o_{C em amostras duplas para posterior}

análise hormonal de progesterona, IGF-I, Hormônio do Crescimento e Insulina.

As coletas foram realizadas, por ocasião das pesagens e aos 10, 11 e 12 meses de idade. Através de uma análise retrospectiva também foi possível analisar as concentrações hormonais aos 30 e 60 dias antes do aparecimento da puberdade.

3.5.4.2 Determinação de progesterona

A progesterona foi o único hormônio determinado em todas as novilhas, pois serviu de indicador da ocorrência da puberdade.

A concentração de progesterona no soro (P4), em ng/ml, foi determinada através de radioimunoensaio (RIA), com o emprego do kit DSL-3400 (Diagnostic Systems Laboratories, Inc. – Texas – USA), no Laboratório de Bioquímica do Instituto de Ciência e Tecnologia dos Alimentos da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, usando um contador gama modelo COBRA-auto gama (Packard Instrument Company),

o qual usa o Expert QC-software RIA-Smart, no processamento e ajuste dos resultados da análise.

O método empregado na determinação da progesterona está baseado no princípio de radioimunoensaio (IAEA, 1984), onde existe uma competição entre um antígeno radioativo e um não-radioativo, para um número fixo de anticorpos ligados ao tubo. A quantidade de [I125 _{]-marcado ligado à progesterona com o anticorpo específico}

é inversamente proporcional à concentração presente de progesterona livre. A separação do antígeno livre e ligado é obtida pelo uso de um sistema de duplo anticorpo seguido de centrifugação. O complexo do anticorpo marcado permanece no tubo e após a decantação do supernadante medido por RIA.

A sensibilidade do teste (limite mínimo de detecção) é de 0,1 ng/ml e o coeficiente de variação observado neste experimento foi de 9,3%.

3.5.4.3 Determinação de IGF-I

A concentração de IGF-I (Insuline-like growth factor), no soro, em ng/ml, foi determinada através do método Ensaio Imunorradiométrico (IRMA), com o emprego do kit DSL-5600 – Active, com extração, (Diagnostic Systems Laboratories, Inc. – Texas – USA), no Laboratório de Bioquímica do Instituto de Ciência e Tecnologia dos Alimentos da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, usando um contador gama modelo COBRA-auto gama (Packard Instrument Company), que usa o Expert QC- software RIA-Smart, no processamento e ajuste dos resultados da análise.

O procedimento emprega um ensaio imunorradiométrico (IRMA) de dois sítios descrito por Milles et al. (1974). O DSL-5600 IGF-I IRMA inclui uma etapa de

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extração simples na qual o IGF-I é separado das suas proteínas de ligação no soro. Esta etapa é considerada essencial para uma determinação exata de IGF-I.

O IRMA é um ensaio não competitivo no qual a substância sendo determinada é “presa” entre dois anticorpos. O primeiro anticorpo está imobilizado nas paredes internas dos tubos. O outro anticorpo é radiomarcado para a sua detecção. A substância sendo determinada presente nas amostras, padrões e controles é ligada por ambos os anticorpos para formar um complexo. Os materiais não ligados são removidos por decantação e lavagem dos tubos.

A precisão na determinação de IGF-I é dificultada pela presença de proteínas de ligação ao IGF, as quais podem seqüestrar IGF-I na mistura de reação (Funston et al., 1995). Portanto, o método utilizado neste experimento, está baseado numa versão modificada no processo de acidificação seguida de precipitação por etanol das proteínas de ligação (IGFBP), de modo a permitir uma extração relativamente alta do IGF-I.

O kit está baseado no uso de antisoro contra IGF-I humano, o qual apresenta baixa reação cruzada com o IGF-I bovino. Esse procedimento foi adotado devido as dificuldades técnicas de produção do antisoro específico e também porque o desejado era obter diferenças entre os tratamentos e não um diagnóstico sobre níveis de IGF-I em bovinos (Hossner et al., 1997).

A sensibilidade do teste (limite mínimo de detecção) é de 0,8 ng/ml e o coeficiente de variação observado neste experimento foi de 14,6%.

3.5.4.4 Determinação do hormônio do crescimento

A concentração do hormônio do crescimento (GH), no soro, em ng/ml, foi determinada pelo método de Imunoensaio quimioluminescência, pelo emprego do programa Access Immunoassay System (Sanofi Diagnostics Pasteurs Inc., MN, USA), no Laboratório de Bioquímica Hormonal Faillace, de Medicina Humana em Porto Alegre, Rio Grande do Sul.

O método é baseado na adição de uma amostra de soro em tubos cobertos com partículas paramagnéticas de soro anti-GH de camudongo. O soro com GH ligado é imobilizado pelo anti-GH de camundongo e constitui uma fase sólida. O material não ligado à fase sólida é removido por separação num campo magnético e lavado. Após, é adicionado um substrato quimioluminescente e a luz gerada pela reação é medida com um luminômetro. A produção de fótons é proporcional à quantidade de GH na amostra.

A sensibilidade do teste (limite mínimo de detecção) é de 0,7 ng/ml e o coeficiente de variação observado neste experimento foi de 16,8%.

3.5.4.5 Determinação de insulina

A determinação da insulina (IN), no soro, em U/ml, foi realizada pelo método de Imunoensaio quimioluminescência, pelo emprego do programa Access Immunoassay System (Sanofi Diagnostics Pasteurs Inc., MN, USA), no Laboratório de Bioquímica Hormonal Faillace, de Medicina Humana em Porto Alegre, Rio Grande do Sul.

O método é baseado na adição de uma amostra de soro em tubos cobertos com partículas paramagnéticas de soro anti-insulina de cabra. O soro com insulina ligado é imobilizado pelo anti-IN de cabra e constitui uma fase sólida. O material não

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ligado à fase sólida é removido por separação num campo magnético e lavado. Após, é adicionado um substrato quimioluminescente e a luz gerada pela reação é medida com um luminômetro. A produção de fótons é proporcional à quantidade de insulina na amostra.

A sensibilidade do teste (limite mínimo de detecção) é de 1,2 U/ml e o coeficiente de variação observado neste experimento foi de 10,7%.