As avaliações foram iniciadas aos 84 DAP, e realizadas em três épocas, aos 0, 28 e 56 dias após o início dos tratamentos (DAT), ou seja, quando as plantas estavam com 84, 112 e
140 dias de idade. Apenas as variáveis matéria seca de raízes e matéria seca da parte aérea foram realizadas numa única data, aos 56 DAT (140 dias de idade).
Em todas as plantas foram utilizadas a primeira folha totalmente expandida e com lígula aparente (folha +1) para as avaliações, com excessão da área foliar e da densidade estomatal que utilizou-se a terceira folha totalmente expandida com lígula aparente (folha +3), iniciando-se pelas variáveis não destrutivas e em seguida pelas destrutivas.
5.4.1 Variáveis morfológicas
5.4.1.1 Número de folhas verdes
A contagem do número de folhas verdes ocorreu a cada avaliação, considerando-se as folhas totalmente expandidas e com pelo menos 20% da área foliar verde, contadas a partir da folha +1.
5.4.1.2 Área foliar
Durante as avaliações foram realizadas medições do comprimento e diâmetro do limbo foliar na porção mediana da folha +3, com auxilio de uma fita métrica e régua, respectivamente. A área foliar foi calculada segundo metodologia descrita por Hermann & Câmara (1999):
AF = C x L x 0,75 x (N+2)
em que C é o comprimento da folha +3, L é a largura da folha +3, 0,75 é o fator de correção para área foliar da cultura, e N é o número de folhas abertas com pelo menos 20% de área verde.
5.4.1.3 Densidade de estômatos
Para o estudo de densidade estomatal, o método de Mazumdar et al. (1969) foi adotado. A folha +1 de cada planta foi cortada e imediatamente acondicionada e transportada para o laboratório em uma caixa térmica com gelo para minimizar perda do teor de umidade e degradação da clorofila. Retirou-se a impressão digital em quatro regiões mediana da folha de cada cultivar, duas impressões na face abaxial e duas na face adaxial da folha (impressões
paralelas à nervura central da folha). A impressão foi retirada com esmalte incolor e auxílio de uma fita adesiva transparente, do seguinte modo: passou-se uma fina camada de esmalte incolor na folha, de tamanho aproximado de 4 cm de comprimento, esperou-se secar; colou-se um pedaço de fita adesiva transparente (totalmente limpa e sem marcas de dedos) no local onde foi passado o esmalte, retirou-se a fita. As formas dos estômatos ficaram impressas na fita.
Para realizar a leitura da densidade estomática, aplicou-se a fita adesiva com a impressão dos estômatos em uma lâmina do tipo “Câmara de Neubauer” (milimetrada), e a contagem dos estômatos foi realizada em uma área de 0,5 x 0,5 mm em microscópio óptico, utilizando-se a objetiva de 10x de ampliação (Nikon – Eclipse E200, Shanghai, China).
5.4.1.4 Massa foliar específica
Dois discos foliares (0,69 cm2 cada) por folha +1 foram amostrados por meio de um furador, entre a borda e a nervura central da folha. A relação massa do disco/área do disco foi determinada após a secagem dos discos foliares a 80oC por 48 h, para obtenção da massa constante.
5.4.2 Variáveis Fisiológicas
5.4.2.1 Estimativa do conteúdo de clorofila via unidade SPAD (CE) O CE foi determinado usando um clorofilômetro SPAD-502 (Minolta Corp., Ramsey, NJ, EUA). A média da parcela (vaso) foi considerada a de três leituras nas folhas +1. A leitura (unidade SPAD) corresponde ao teor de pigmento na folha, e seu valor é equivalente à quantidade de luz transmitida pela folha em duas regiões de comprimento de onda, nas quais a absorção de clorofila é diferente (Malavolta et al., 1997). Dessa maneira, o valor fornecido é proporcional à quantidade de clorofila existente na folha.
5.4.2.2 Máxima eficiência fotoquímica do fotossistema II (Fv/Fm)
Determinada nas folhas +1 com um fluorômetro portátil (Opti-Sciences, Inc., Hudson, NH, EUA). As folhas foram pré-escurecidas por 30 minutos, com auxílio de clipes
específicos, antes das medidas de fluorescência. A variável Fv/Fm foi determinada seguindo os
procedimentos de Maxwell & Johnson (2000), onde Fm é a máxima intensidade da
fluorescência em que todos as reações do fotossistema II (FSII) se fecham; F0 é a mínima
intensidade de fluorescência, quando os centros de reações do FSII estão abertos, e Fv é a fluorescência variável (Fv = Fm – F0). As leituras foram realizadas entre às 7 e 9 horas da
manhã.
5.4.2.3 Condutância estomática
A condutância estomática (mmol.m-2s-1) foi determinada por intermédio de um porômetro (Decagon Devices, Inc., Pullman, WA, EUA), acompanhado da leitura do fluxo de radiação (µmol.m-2.s-1) realizada por meio de um medidor de radiação (Apogee Instruments, Inc., Roseville, CA, EUA). As leituras foram tomadas na região mediana da folha +1, e determinadas pela manhã, entre às 7 e 9 horas da manhã.
5.4.2.4 Conteúdo de clorofila via espectrofotômetro
Para conteúdo de clorofila (CC), dois discos foliares (0,69 cm2 cada) foram amostrados da lâmina foliar por meio de um furador, entre a borda e a nervura central da folha. O CC foi determinado segundo a metodologia de Porra et al. (1989), o método se baseia na utilização de 1 ml do extrato de clorofila obtido à partir da extração por ácido dimetil-formamida (DMF). A solução foi mantida protegida da luz durante 24 h para a completa extração. Logo após realizou-se a leitura de absorbância em espectrofotômetro nos comprimentos de onda de 480, 647 e 664 nm; a leitura foi realizada em 1ml de extrato de clorofila diluído em 1ml de água deionizada
5.4.2.5 Teor relativo de água na folha (TRA)
No laboratório, da mesma folha +1 foram extraídos dois discos (0,69 cm2 cada) e determinou-se a massa do tecido fresco (Wf) dos discos em balança analítica (Tecnal Equip. Lab., Piracicaba, SP, Brasil). A massa do tecido túrgido (Wt) foi obtida depois da reidratação dos discos em água deionizada por 24 h. Para tanto, retirou-se o excesso de água com lenço de papel dos discos turgidos para determinar a massa do tecido túrgido. A massa do tecido seco (Wd) foi obtida depois que os discos foram secos por 48 h a 80ºC em estufa de circulação de
ar forçada. TRA foi calculado por intermédio de fórmula, conforme a metodologia apresentada por Jamaux et al. (1997):
TRA = [(Wf – Wd) . ( Wt – Wd)-1] x 100
5.4.2.6 Potencial hídrico foliar (Ψw)
Nas mesmas folhas +1 coletadas e acondicionadas em saquinhos plásticos identificados, e imediatamente transportadas em caixa térmica com gelo, para minimizar a perda de umidade, da casa de vegetação até o laboratório. O Ψw foi determinado no período mais quente do dia, entre as 10 e 14 h. As leituras foram feitas na extremidade (ponta) da folha +1 do perfilho primário utilizando-se a câmara de pressão Scholander (SoilMoisture Equipment, Santa Bárbara CA, EUA).
5.4.3 Massa de matéria seca da parte aérea e das raízes
Na última data de avaliação as massas das matérias secas da parte aérea e das raízes foram obtidas. Para tanto, as plantas foram retiradas dos vasos e as raízes separadas da parte aérea. As raízes foram peneiradas e lavadas em água corrente. Em seguida, ambas as partes foram levadas para estufa de circulação forçada de ar para serem secas a 70ºC durante 72 horas. Em seguida, as massas da matéria seca foram tomadas por meio de balança de precisã