Baseados em PCR

A metodologia que usa a PCR é vantajosa na medida em que é de fácil execução, rápida, necessita de uma quantidade de DNA inicial reduzida obtendo-se a amplificação selectiva de fragmentos de DNA específicos (de la Torre et al., 2004) e é mais económica do que os RFLPs (Godwin et al., 2001).

Por esse motivo, foram desenvolvidos muitos marcadores de DNA baseados em PCR, devido à aparente simplicidade e elevada probabilidade de sucesso da metodologia.

O uso de “primers” aleatórios superou a necessidade do conhecimento prévio da sequência e facilitou o desenvolvimento de marcadores moleculares (Agarwal et al., 2008). Por serem sistemas práticos e eficientes (Cottrell et al., 2003), são utilizados em inúmeras aplicações.

Neste grupo incluem-se os marcadores RAPDs, AFLPs, SSRs, ISSRs e os baseados em retrotransposões LTR, entre muitos outros.

1.7.2.2.2.1. RAPDs (“Random Amplified Polymorphic DNA”)

arbitrária com cerca de 20 nucleótidos, corrida electroforética em géis de poliacrilamida e visualização das bandas por autorradiografia, a que deram o nome de “Arbitrarily Primed-PCR” (AP – PCR). Em 1991, Caetano-Anollés et al. publicaram uma técnica semelhante, denominada “DNA Amplification Fingerprinting” (DAF), que também utiliza géis de poliacrilamida, mas baseia-se no uso de “primers” menores (entre cinco a oito nucleótidos).

Os RAPDs foram desenvolvidos por Williams et al. (1990) e consistem na amplificação aleatória de polimorfismos no DNA genómico por PCR (Figura 1.3; Agarwal et al., 2008).

Das três técnicas referidas, a proposta por Williams et al. (1990) tornou-se a mais popular, embora seja de realçar que todas elas foram as primeiras a amplificar fragmentos de DNA de qualquer espécie sem conhecimento prévio da sequência (Semagn et al., 2006).

Os RAPDs detectam polimorfismos de DNA produzidos por rearranjos ou delecções nos ou entre os locais de ligação dos “primers” (Williams et al., 1990; Agarwal et al., 2008).

Usando apenas um único “primer” de sequência arbitrária curta (cerca de 10 bp) obtêm-se fragmentos de DNA com 300 a 2000 bp, eliminando-se assim a necessidade do conhecimento prévio da sequência (Williams et al., 1990).

O “primer” liga-se a locais opostos na dupla cadeia de DNA, separados por uma distância amplificável, normalmente inferior a 3000 bp, e produz um produto de PCR discreto (Matos, 2001).

Devido à rapidez do processo e à eficiência na análise dos marcadores RAPD, têm sido desenvolvidos mapas genéticos de elevada densidade em muitas espécies vegetais (Kiss et al., 1993; Torress et al., 1993; Hemmat et al., 1994) num tempo relativamente curto.

Estes marcadores também têm sido utilizados em estudos de diversidade genética (Awasthi et al., 2004; Gemas et al., 2004), no melhoramento de cereais e outras espécies, nomeadamente em “DNA fingerprinting”, caracterização do germoplasma, diversidade genética, “gene-tagging” e mapeamento do genoma e de QTL (Gupta e Roy, 2002), na identificação de marcadores ligados a genes de resistência a doenças (Martin et al., 1991; Paran et al., 1991; Adam-Boldon et al., 1994), à tolerância a sais (Pakniyat et al., 2004) e à tolerância à seca (Pakniyat e Tavakol, 2007), em estudos evolutivos de poliplóides (Brochmann et al., 1998), entre tantos outros. Podem ainda detectar populações híbridas, espécies ou subespécies (Hadrys et al., 1992).

A metodologia RAPD utiliza um único “primer” arbitrário de 10bp a temperaturas Amostra 1

DNA molde

Produto A Produto B

Amostra 2

Produto B

Figura 1. 8 - Representação esquemática da amplificação de RAPDs. O “primer” hibrida em locais

complementares aos da sua sequência e que estão situados em cadeias opostas do dsDNA e em direcção convergente. Quando a distância entre esses locais é razoável (não superior a 3000 bp), a região entre eles é amplificável por PCR. As setas representam cópias múltiplas do mesmo “primer” e indicam a orientação da sequência do DNA genómico. Os números representam locais de ligação dos “‘primers” ao DNA molde (adaptado de Semagn et al., 2006).

sejam arbitrárias, há dois critérios básicos a atender, segundo Williams et al. (1990): devem ter um mínimo de 40% de GC e não podem ter sequências palindrómicas. Os produtos PCR resultantes são normalmente separados em gel de agarose com resolução de 1,5 a 2% e corados com brometo de etídio. Porém, também podem ser visualizados em géis de poliacrilamida corados com nitrato de prata(Huff et al., 1993; Vejl, 1997; Hollingsworth et al., 1998, entre outros).

A maioria dos produtos RAPD resulta da amplificação de um locus, podendo ocorrer dois tipos de polimorfismo: presença ou ausência de banda, e no caso de estar presente, a sua intensidade pode ser variável. A diferença na intensidade das bandas pode resultar do número de cópias ou da abundância relativa da sequência (Devos e Gale, 1992) podendo servir para distinguir indivíduos homozigóticos dominantes de indivíduos heterozigóticos, embora alguns autores não encontrem correlação entre o número de cópias e a intensidade das bandas (Thormann et al., 1994). O facto das bandas mais ténues serem geralmente menos robustas nas experiências RAPD (Ellsworth et al., 1993; Heun e Helentjaris, 1993) sugere vários graus de “primer mismatch” que podem influenciar a intensidade das bandas (Semagn et al., 2006). Uma vez que não há certezas sobre a fonte da intensidade das bandas (número de cópias ou “primer mismatch”) a maioria dos estudos não considera este ponto, embora alguns autores tenham usado uma escala de sete estádios de intensidade (Demeke et al., 1992).

Os RAPDs têm três limitações principais: reduzida reprodutibilidade, herança dominante e homologia. Vários são os factores que contribuem para a reduzida reprodutibilidade dos RAPDs, nomeadamente, a influência da qualidade e quantidade do DNA molde, do tampão de reacção de PCR utilizado, a concentração do cloreto de magnésio, a reduzida temperatura de “annealing”, o tipo de Taq DNA polimerase e a utilização de termocicladores diferentes (Wolff et al., 1993; Semagn et al., 2006). Contudo estes inconvenientes podem ser ultrapassados através da escolha de um protocolo de extracção de DNA apropriado, que elimine os contaminantes (Micheli et

al., 1994), pela optimização dos parâmetros utilizados (Ellsworth et al., 1993), pelo

teste de vários “primers” e contabilização de apenas as bandas reprodutíveis (Kresovich

et al., 1992;Yang e Quiros, 1993).

A presença de falsos negativos e falsos positivos também pode afectar seriamente a fiabilidade dos RAPDs em vários estudos, incluindo os de diversidade genética e de mapeamento. Este facto ocorre uma vez que as bandas co-migrantes, isto é, bandas com o mesmo peso molecular, são consideradas como loci homólogos. Contudo, como em

qualquer estudo baseado em resolução electroforética, a suposição que bandas com comprimentos iguais são homólogas não é necessariamente verdade, especialmente em espécies poliplóides (Semagn et al., 2006). Uma solução passa pela utilização de géis com maior resolução como os de poliacrilamida corados com nitrato de prata (ex: Huff

et al., 1993).

A outra limitação deste sistema de marcadores é que a maioria dos alelos segrega como marcadores dominantes, não distinguindo homozigóticos dominantes de heterozigóticos. Os RAPDs produzem fragmentos a partir de alelos homozigóticos dominantes ou heterozigóticos (Semang et al., 2006).

1.7.2.2.2.2. AFLPs (“Amplified Fragment Lenght Polymorphism”)

Para ultrapassar as limitações dos RAPDs, Vos et al. (1995) desenvolveram os AFLPs, uma técnica que combina a fiabilidade dos RFLPs com a flexibilidade da tecnologia PCR (Figura 1.4; Agarwal et al., 2008).

A técnica AFLP origina “fingerprints” de qualquer DNA, independentemente da sua fonte (procariotas ou eucariotas), sem conhecimento prévio da sequência (Vos et al., 1995).

Os AFLPs baseiam-se na amplificação de fragmentos de restrição de DNA, por PCR. Os fragmentos de restrição obtêm-se por digestão do DNA genómico com duas enzimas de restrição, uma de corte pouco frequente e outra com elevada frequência de corte (Vos et al., 1995). Os adaptadores de cadeia dupla ligam-se às extremidades dos fragmentos de restrição, para limitar o número de fragmentos amplificados e facilitar a análise dos resultados (Althoff et al., 2007).

A maioria dos fragmentos AFLP obtidos corresponde a posições únicas no genoma, podendo ser explorados no mapeamento físico e genético (Agarwal et al., 2008) e “gene-tagging” (Martins-Lopes et al., 1999).

Figura 1. 4 - Representação esquemática da técnica de AFLP. O DNA genómico foi cortado

simultaneamente por duas enzimas de restrição, uma de corte raro e outra com corte frequente. Os fragmentos de restrição ligam-se a adaptadores com extremidades específicas e usam-se “primers” selectivos com extremidades “random” (2-3 nucleótidos). O conjunto de fragmentos obtido pode ser observado por electroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida (adaptado de Agarwal et al., 2008).

Esta técnica tem sido extensivamente utilizada em estudos de genética de populações, de filogeografia e de filogenética (Mueller e Wolfenbarger, 1999; Bensch e Akesson, 2005).

Os AFLPs podem ser usados para distinguir indivíduos ao nível da sub-espécie (Althoff et al., 2007), para determinar as distâncias genéticas entre genótipos (Gerber et

al., 2000), e para analisar a variabilidade intra-específica (Gaudeul et al., 2000; Weeks et al., 2000), intra-populacional (Pornon et al., 2000) e entre indivíduos (Drummond et al., 2000).

Esta técnica permite ainda a obtenção de um grande número de fragmentos, apresentam elevada especificidade e reprodutibilidade, exploram a presença/ausência de

Digestão do DNA com EcoRI e MseI DNA genómico

Fragmentos de restrição

Ligação com adaptadores EcoRI e MseI

Amplificação pré-selectiva

Amplificação selectiva, com primers selectivos (+2)

Electroforese em gel de poliacrilamida dos produtos amplificados Adaptadores

EcoRI + MseI

polimorfismos nos locais de restrição, como nos RFLPs, e avaliam a ocorrência ou não de amplificação, como nos RAPDs (Ferreira e Grattapaglia, 1996).

As desvantagens destes marcadores são: a reduzida informação por locus (marcador dominante); maior número de etapas do que os RAPDs e a necessidade de DNA molde muito puro.

1.7.2.2.2.3. SSRs (“Simple Sequence Repeat”) ou microssatélites

Os microssatélites são repetições de 2-6 nucleótidos, com sequências flanqueadoras muito conservadas, que ocorrem dispersos por todo o genoma, nos organismos eucarióticos (Tautz e Renz, 1984).

A variação no número das unidades repetitivas é devida principalmente a erros que ocorrem durante a replicação do DNA (Schlotterer e Tautz, 1992).

Os SSRs são marcadores que identificam um único locus, normalmente multi- alélico (Godwin et al., 2001), devido à variação no número de nucleótidos das repetições, o que se reflecte num elevado polimorfismo (Figura 1.5; Rallo et al., 2000).

Figura 1. 5 - Representação esquemática da técnica de SSR. Os

microssatélites compreendem repetições em tandem de 2-6 nucleótidos. O número de repetições é altamente variável entre indivíduos. São desenhados “primers” complementares às regiões flanqueantes de cada SSR, para

As sequências flanqueantes dos microssatélites, por serem muito conservadas, são utilizadas para desenhar “primers” específicos (Morgante e Oliveiri, 1993). A amplificação resultará em padrões de bandas com diferentes tamanhos moleculares, representando cada uma delas, um alelo do mesmo locus SSR (Godwin et al., 1997).

Os SSRs são ubíquos, co-dominantes, informativos e bastante reprodutíveis (Tautz, 1989; Díaz et al., 2006), altamente polimórficos e transferíveis, sendo a sua análise automatizada (Rallo et al., 2000; Díaz et al., 2006).

As principais limitações destes marcadores são o tempo necessário à sua obtenção e caracterização e os custos envolvidos, devido à necessidade de construir bibliotecas genómicas, exigindo pessoal qualificado e equipamento sofisticado, especialmente na sequenciação automática (Rakoczy-Trojanowska e Bolibok, 2004).

Apesar das desvantagens que restringem o uso dos SSRs, estes são considerados os marcadores mais eficientes da actualidade (Rakoczy-Trojanowska e Bolibok, 2004).

Estes marcadores têm sido utilizados em cereais no que respeita a mapeamento genético (Gupta e Varshney, 2000), “DNA fingerprinting” (Karp et al., 1996; Rossiter

et al., 2000), estudos de variabilidade genética entre cultivares (Pinto- Carnide et al.,

1999) e detecção de cromossomas “alien” em linhas de adição de trigo (Hernandez et

al., 1996).

1.7.2.2.2.4. ISSRs (“Inter Simple Sequence Repeats”) ou inter- microssatélites

Em 1994, Zietkiewicz e colegas descobriram um novo sistema de marcadores derivados dos microssatélites, os inter-microssatélites ou ISSRs, baseados na técnica PCR (Zietkiewicz et al., 1994).

Os ISSRs exploram a ubiquidade dos microssatélites nos genomas e consistem na amplificação de regiões entre dois microssatélites adjacentes, inversamente orientados (Bornet e Branchard, 2001), tornando-os marcadores multilocus (Zietkiewicz et al., 1994).

O polimorfismo ISSR resulta da variação no comprimento e/ou sequência das regiões inter-microssatélites amplificadas e das sequências dos oligonucleótidos utilizados (Abbot, 2001). Os locais que diferem no comprimento do DNA são considerados como loci polimórficos (Smith e Bateman, 2002).

Nesta metodologia utiliza-se apenas um “primer”, semiarbitrário, de sequência repetida própria de um microssatélite que pode ser di-, tri-, tetra- ou pentanucleotídica. Pode ainda ter ancorados dois a quatro nucleótidos degenerados, nas extremidades 3’ ou 5’ (Figura 1.6; Zietkiewicz et al., 1994).

Os ISSRs resolvem os problemas de reprodutibilidade e baixo nível de polimorfismo dos RAPDs (Zietkiewicz et al., 1994; Godwin et al., 1997; Fernández et

al., 2002), dos custos elevados e morosidade dos AFLPs e dos SSRs e da necessidade

de conhecimento prévio da sequência dos SSRs. Estes marcadores são simples, económicos, altamente polimórficos, reprodutíveis e fiáveis, ideais para “fingerprinting” de todas as espécies, mesmo as que não têm relevância económica (Bornet e Branchard, 2001) e apresentam elevada resolução entre populações e indivíduos (Tsumura et al., 1996; Yang et al., 1996; Wolfe et al., 1998; Smith e Bateman, 2002).

Representam uma excelente alternativa a métodos que detectam um único locus e a métodos baseados em hibridação (Zietkiewicz et al., 1994; Godwin et al., 1997).

Os ISSRs são principalmente transmitidos como marcadores genéticos dominantes e raramente como co-dominantes, sendo estes últimos casuais (Rakoczy-Trojanowska e Bolibok, 2004; Semagn et al., 2006).

Estes marcadores têm sido extensivamente utilizados em cereais para estimativa de diversidade genética (Quian et al., 2001; Fernández et al., 2002; Quiu et al., 2006; Carvalho et al., 2008; Sofalian et al., 2008, Carvalho et al., 2009a), identificação de genótipos e cultivares (Kantety et al., 1995; Nagoaka and Ogihara, 1997; Pejic et al., 1998; Blair et al., 1999; Joshi et al., 2000; Matos et al., 2001; Brantestam et al., 2004), para “fingerprinting” de híbridos interespecíficos (Carvalho et al., 2005), para detecção de genes QTL (Ammiraju et al., 2001; 2002) e para selecção assistida por marcadores (Dayteg et al., 2008).

Produtos amplificados (a) (b) (c) Produto amplificado Primer DNA alvo

Figura 1. 6 - Representação esquemática da técnica ISSR-PCR, com um “primer” não-ancorado (AG)8

(a) com um “primer” contendo dois nucleótidos degenerados (N) na extremidade 3’ (b), e com um ‘primer’ contendo dois nucleótidos degenerados (N) na extremidade 5’ (c). A repetição alvo no genoma é do tipo (TC)n e está inversamente orientada no dsDNA. Os produtos de amplificação ISSR obtidos em a),

1.7.2.2.2.5 – Retrotransposões (RTNs) como marcadores moleculares

O surgimento dos métodos baseados em retrotransposões (RTNs) deveu-se à demonstração da sua ubiquidade e actividade nas plantas (Grandbastien et al., 1989; Flavel et al., 1992; Voytas et al., 1992; Suoniemi et al., 1998). No caso dos retrotransposões os polimorfismos são gerados por um único processo biológico de retrotransposição, que resulta na inserção dos retrotransposões em novos locais, sem perda das cópias parentais. A maioria das inserções é irreversível e podem variar de algumas centenas de pares de bases até alguns kb. Outras vantagens do uso das sequências de RTNs são o elevado número de cópias e a sua elevada heterogeneidade a nível populacional, estarem dispersos nas regiões eucromáticas dos cromossomas e mostrarem polimorfismo insercional intra- e interespecífico (Kumar e Bennetzen, 1999).

Os sistemas de marcadores moleculares baseados em RTNs de repetições terminais longas (LTRs) exploram o polimorfismo do DNA genómico resultante de fenómenos de inserção entre dois RTNs muito próximos ou entre um RTN e um SSR, no caso dos marcadores IRAP e REMAP, respectivamente (Figura 1.7; Kalendar et al., 1999; Provan et al., 1999; Schulman et al., 2004).

A

B

“Primers” 5’ e 3’ LTR

Microssatélite

“Primers” 5’ e 3’ LTR

“Primer” que liga ao microssatélite

Os “primers” utilizados são geralmente desenhados para domínios conservados nas LTRs e/ou regiões SSR conservadas. Contudo, as regiões LTR conservadas podem diferir dentro da mesma família e entre famílias (Schulman, 2007).

Os métodos IRAP e REMAP originam, em cada amplificação, dezenas a centenas de produtos, dependendo da prevalência da família de RTNs e da organização do genoma da planta em estudo (Schulman, 2007).

Resumindo, muitas características dos RTNs, como o facto de serem ubíquos do genoma, abundantes e dispersos, tornam-nos apelativos para a sua utilização como sistemas de marcadores moleculares. Simultaneamente, a sua actividade leva à diversificação do genoma e fornece meios para a sua detecção. Os RTNs produzem grandes alterações genéticas no local de inserção, providenciando assim sequências conservadas que podem ser utilizadas na detecção da sua própria inserção (Schulman, 2007).