BIBLIOTECA DE COMPOSTOS ALVO E ANÁLISE DE PERFIL METABÓLICO

Uma base de dados dentro do AMDIS deve ser eficiente na deconvolução e identificação do conjunto de compostos de preferência em várias matrizes (i.e. folhas, gemas e calos). O estudo do perfil metabólico em tecidos diferentes se faz necessário para entender, entre outros fatores, os motivos da dificuldade de propagação da erva mate por estaquia e, ou micro propagação, seja por material adulto, brotos viáveis ou calos (WENDLING, 2004).

Assim, para que o processo de identificação seja eficiente, a construção de uma biblioteca de compostos de vários tipos de matrizes é desejada, no qual certos parâmetros são padronizados (i.e. condições de corrida cromatográficas e aquisição de espectro de massas), para minimizar os erros na identificação de compostos (MASTRANGELO et al., 2015). Já que, existem espectrômetros de massa com detectores distintos, este fato pode alterar os dados dos espectros de massa obtidos (i.e. abundâncias relativas da razão massa/carga, m/z), e dificultar a detecção de compostos automaticamente (LUEDEMANN et al., 2008), por esse motivo buscou-se no presente trabalho criar uma biblioteca de compostos alvos onde EM usada foi a com detector do tipo íon trap (IT).

Inicialmente, foi confeccionada uma biblioteca de compostos alvo dentro do AMDIS com matrizes distintas de erva mate (gema, calo, folhas adultas e jovens), sendo que uma biblioteca de calibração (*.CSL, Apêndice A) foi gerada com atribuição de um IR específico para cada composto em uma solução de alcanos

(C

11

30

compostos (metabólitos) identificados nas amostras em análise.

Uma vez que o IR do composto era calculado, ele era comparado aos valores armazenados na biblioteca, onde além da correspondência de similaridade dos espectros, o AMDIS atribui uma pontuação de penalidade ao resultado de acordo com a correspondência dos IRs. Assim, quando um valor IR cai fora de uma janela de retenção especificada, o programa calcula a penalidade que afeta o fator mínimo de correspondência e, portanto, a exatidão da identificação (STAIN, 1999).

O uso do IR diminui o risco inerente a uma identificação errônea, já que os IRs têm excelente reprodutibilidade quando a temperatura do forno, o gradiente de temperatura e a coluna são mantidos constantes, fornecendo informações extras para evitar possíveis variações do IR entre valores experimentais e àqueles inseridos na biblioteca aumentando a precisão da identificação, possibilitando assim a identificação de isômeros geométricos com diferentes TR (i.e. carboidratos) (WAGNER; SEFKOW; KOPKA; 2003; KIND et al., 2009; MASTRANGELO et al., 2015).

Em resumo, o espectro de massas de fragmentação do composto alvo é combinado com os espectros de massas daqueles inseridos na biblioteca e marcado com uma probabilidade de correspondência que é então melhor resolvida pelo IR medido, possibilitando assim a identificação segura dos compostos presentes. A semi-quantificação através da integração das áreas dos picos dos compostos foram feitas no software Xcalibur (Thermo) a partir do relatório com as informações de

identificação (IR e m/z) geradas pelo AMDIS.

A dificuldade na criação da biblioteca de compostos (*MSL, Apêndice A), está nas flutuações da linha de base, inerentes a matrizes, que prejudicam a visualização de componentes com baixa intensidade, o que pode ser corrigido com aumento da relação sinal/ruído (MASTRANGELO et al., 2015). As bibliotecas de dados metabolômicos existentes são baseados em sistemas de CG-TOF/IE-EM (LUEDEMANN et al., 2008) e não em sistemas mais simples (CG-EM/IT). Dificuldades nas comparações espectrais devem existir mas são minimizadas, uma vez que os espectros de massas produzidos através eletroionização (IE), apresentam íons reprodutíveis. A inserção de compostos na biblioteca com o uso de sistema CG-EM/IT a ser criadas foi baseada nas comparações com as bibliotecas existentes utilizando o IR e m/z característicos para cada composto, e quando disponível a confirmação deste foi realizada com comparação com padrões externos (HALKET et al., 2005).

Ao todo 237 compostos foram incluídos na biblioteca de compostos alvos analisando esses diferentes tecidos. Como exemplo, após a inserção dos dados no AMDIS a análise de um extrato de folha adulta do clone F1 possibilitou a detecção de 50 compostos e a identificação de 38 (relação s/r acima de 75, Tabela 4) (Figura 13), o passo a passo da criação da biblioteca pode ser visualizado no Apêndice A deste trabalho.

TABELA 4: PORCENTAGEM RELATIVA MÉDIA DOS METABÓLITOS POLARES IDENTIFICADOS NO EXTRATO DOS DISTINTOS TECIDOS DE ERVA-MATE (CLONE F1).

IR C o m p o s to P e r c e n t a g e s re la tiv a s (%)

F olh a J o v e m F olh a A dulta G em a C alo

1137 Alanina 0,70 0,14 0,22 0,03 1205 Valina - - 0,02 0,10 1283 Isoleucina - 0,01 0,02 0,04 1306 Ácido Succínico 0,04 0,02 0,01 - 1313 Ácido Glicérico 0,05 0,02 0,02 0,02 1345 Ácido Fumárico - - 0,01 - 1348 Serina 0,11 0,03 0,08 0,68 1372 Treonina - 0,03 0,02 0,12 1484 Ácido málico 0,26 0,03 1,62 1,87 1506 Prolina 0,04 - 0,04 0,30 1516 Ácido Aspártico 0,09 - 0,17 0,19 1519 Glutamina 0,13 0,02 5,80 4,72 1540 Ácido treônico 0,08 0,10 - - 1606 Ácido glutâmico 0,22 0,01 0,35 0,15 1624 Xilose-Z-metoxima - - 0,02 0,02 1633 Xilose-E-metoxima 0,08 0,02 0,02 - 1748 Xilofuranose 0,08 0,14 0,02 - 1788 Ácido Chiquímico 0,06 - - - 1792 ÁcidoGalacturônico - 0,01 0,03 0,03 1797 Ácido Isocítrico 0,15 0,04 0,23 0,28 1811 Arginina - 0,02 0,01 - 1849 Ácido Quínico 17,49 3,41 2,00 3,59 1842 F rutose-Z-metoxima 2,21 1,08 10,25 11,54 1852 Frutose-E-metoxima 1,85 0,79 9,55 11,29 1906 Manitol 0,19 0,07 0,06 0,07 1863 Galactose-Z-metoxima 24,18 9,61 16,12 18,29 1843 Cafeína 0,12 0,05 - - 1864 Galactose- E-metoxima 2,84 1,17 1,56 1,80 1843 Lisina - 0,01 0,02 0,03 1906 Ácido galacturônico - - 0,05 0,08 2061 Mio-Inositol 11,51 14,54 4,04 4,95 2129 Ácido cafeíco 0,26 0,05 0,03 0,03 2270 Glicose-6-fosfatase - - 0,05 0,06 2636 Sacarose 24,19 66,22 45,36 37,26 2652 Celobiose 0,57 0,03 0,04 0,06 2933 Galactinol 0,66 0,58 0,01 - 3092 Ácido Clorogênico 6,85 0,72 0,47 0,50

A Figura 13 mostra a corrente total de íons de extrato dos quatro tipos de tecido de erva-mate, gema, calo embriogênico, folha jovem e folha adulta. É possível verificar que a complexidade da matriz é acompanhada por um maior número de componentes (▼) no cromatograma (Figura 13 A). Tecidos vegetais analisados em cultura in vivo (Figura 13 A, C e D) tendem a apresentar uma maior complexidade que os cultivados in vitro (Figura 13 B).

FIGURA 13: CORRENTE TOTAL DE ÍONS (CTI) DOS EXTRATOS DE DIFERENTES TECIDOS DE

I. paraguariensis: (A) GEMA; (B) CALO EMBRIOGÊNICO; (C) FOLHA JOVEM E (D) FOLHA ADULTA. NO DETALHE NÚMERO DE (^C O M PO N E N TE S E (T) TARGETS

100 75 $0 25 --- 1 „ , — l i ... ' A 1 I, , 1 . . [| . M l --- ^ 1 3 7t a r g e t s ( t ) , 8 1 » T 1 495 c t > m p o n e n t s ( ^ r ) r t a c 1 0 4 » 2 1 4 1 2 4 4 4 2 8 4 8 ^ 2 4 1 1 4 4 4 1 * 4 7 4 1 4 0 46.ÍA 4 * 4 4 5 1 4 # 9 4 4 1 50 .9 4 4 2 4 8 4 4 4 1 « 9 4 4 7 1 4 8 7 4 4 1 7 1 5 1 «2 A b H ^ B c e l34S-r01 64 tu e e ts © - 8 1 c o H » e i b ___ • 7 8 4 4 1 8 0 4 « 0 2 4 4 t , r ™ 7! 75 50 2S B _________ . . . . , 1 . . . . . 1 i l I . . 6 4t a r g e t s ( j ) ^ 1 81 c o m p o n e n t s ( ▼ ) _ J — _ i . T iB M ! 19.58 21.01 26.24 2 9 4 7 42 .9 0 4 4 4 4 49 .9 7 42.90 4 6 4 4 49.56 52.89 56.23 50 94 * 2 4 8 6 6 ! 1 60.55 7 2 4 8 76.21 79.54 82 4 7 86.20 89.54 92.86 A l H f a c c [1165461 4 7 ta rg e ts í t), 221 w B t « w b W ___ T IC | 75 50 C . . 1 1 II I - 47 targets ( t ) , 2 k .. 21 components f»-) . • _ " - - . •. . . . i T im e : 1 9 .5 8 21.91 2 6 .2 4 2 9 .5 8 3 3 ,9 1 3 6 .2 « 3 9 3 ? 4 2 ,9 0 * 0 .1 3 4 9 .5 7 5 2 .9 0 * 5 6 ,2 2 5 9 ,5 6 6 2 .8 9 6 6 .1 2 0 9 ,5 5 •’ 2 .8 9 " 6 ,2 2 7 9 .5 4 8 2 ,8 7 8440 8 9 ,5 4 9 2 .8 ' [nc I

Em sistemas in vitro o crescimento é controlado com quantidades conhecidas de nutrientes e reguladores de crescimento em ambiente estéril. O menor número de componentes detectados no AMDIS indica uma menor complexidade da matriz, o que pode estar associada a uma menor ativação das vias metabólicas nesse tipo de sistema (Figura 13 B). Diferentemente do que ocorre em sistemas abertos em que fatores exógenos ao meio não podem ser controlados o que possibilita a ativação de distintas vias metabólicas, e, portanto, uma matriz mais complexa.

Nos cultivos in vivo, o domo meristemático (gema) (Figura 13 A), existe um número reduzido de primórdios foliares, ou seja, são tecidos drenos relacionados ao processo produtor-consumidor (“sink-to-source"), semelhante a folhas jovens (Figura 13 C) em que todos os tecidos foliares de uma planta sofrem transição de um consumidor (importador de carbono) a uma fonte (exportador de carbono) durante o seu desenvolvimento. O crescimento de uma folha é suportado pelos carboidratos importados de outras fontes na planta (e.g. folha adulta, caule, raiz), que serão biotransformados em outros metabólitos. Quando a folha é completamente expandida os níveis de fotossíntese aumentam até o ponto em que no tecido foliar a

I X m I I X

D 7 9 targets (t), +117 com ponents (’*■}

19. » ’ ’ .91 1’ : 4 39.58 33.90 311.34 39,57 43.90 66.33 49.56 5 3 5 0 54-33 59,54 6359 64-33 69.55 ’3.58 ’ 6 31 79.55 83.57 56.31 89.54 93.8

quantidade de carbono acumulado na fotossíntese é maior do que o requisitado de respiração e crescimento, nesta fase a folha torna-se um exportador de carbono (TURGEON, 1989; JEONG et al., 2004). Assim, tecidos jovens (Figura 13 A, C), com maior número de vias metabólicas ativas (e.g. crescimento e proteção), em relação a tecidos adultos (Figura 13D), apresentam maior complexidade da matriz e, por conseguinte maior número de componentes gerados durante a análise.

A eficácia da biblioteca na identificação de compostos em diferentes tecidos de erva-mate foi satisfatória, já que possibilitou a identificação de compostos em distintos tecidos, mesmo com a complexidade da matriz, sendo que os compostos presentes foram deconvoluídos, e identificados pelo software (target, T), o que permitiu que a biblioteca criada fosse usada na análise dos extratos de erva-mate.

4.2 INCLUSÃO DE ANÁLISES DE FLAVONOIDES EM PERFIL METABÓLICO