PERFIL METABÓTILO EM DIFERENTES TECIDOS DE ERVA MATE E EFEITO

Atualmente as pesquisas envolvendo a erva-mate (Ilex paraguariensis) têm enfatizado a importância da composição química da erva-mate, para apelo comercial do produto tanto com relação ao sabor (e.g. produção de bebidas) quanto com

relação à presença de compostos bioativos (e.g. compostos alcaloides

metilxantínicos, saponinas e compostos fenólicos) (FILIP et al., 2000). Uma diversidade de produtos tem sido comercializados, incluindo medicamentos (e.g. vazodilatadores, para fadiga e cefaleia (HECK; MEJIA, 2007) e cosméticos (BARROS et al., 2011).

Dentre os metabólitos produzidos pela I. paraguariensis se destacam os compostos fenólicos que estão envolvidos em uma grande variedade de funções incluindo proteção contra insetos invasores, ações antibacteriana e antifúngica, atrativos para os polinizadores, pigmentação e proteção contra raios ultravioleta (NACZH; SHAHIDI, 2006; FRIEDMAN, 2007). Estes compostos podem ser produzidos como resposta após estresse, tal como um corte ao tecido vegetal, podendo ocasionar a produção de novos metabólitos secundários e também aumento na biossíntese de compostos pré-existentes (metabólitos primários), sendo o período para início dessa resposta podendo variar de minutos a horas após ocorrência do estresse, e depender ainda da idade cronológica do tecido (e.g. broto ou folhas) (WAR et al., 2012).

O perfil de metabólitos é usado comumente como ferramenta de diagnóstico para verificar a resposta da planta a um herbicida, a classificação de genótipos, estresses bióticos ou abióticos e principalmente no auxílio para decifrar a função de um gene (WAGNER; SEFKOW; KOPKA, 2003; GULLBERG et al., 2004; SCHAUER; FERNIE, 2006). A possibilidade de predizer a concentração de bioativos e sua dinâmica de produção e consumo com base na assinatura metabólica de uma planta apresenta a capacidade da utilização de perfis de metabolitos como biomarcadores com alto poder preditivo na seleção de material genético em tenra idade (MEYER et al., 2007). A análise do perfil metabólico para espécies de erva-mate ainda não foi explorada, o que ocasiona dificuldades na identificação da expressão gênica de fenótipos de interesse comerciais, bem como a estabilidade nos teores dos compostos bioativos (biomarcadores) frente a alterações ambientais estressantes, tais como as que ocorrem durante a coleta de tecido foliar ou períodos diferentes de luminosidade. Dessa maneira, o metaboloma tem potencial para prover o conhecimento da dinâmica e distribuição dos compostos biativos em extratos de folhas, assim como seus metabólitos precursores.

Nesse contexto, metodologias capazes de fornecer dados em conjunto dos processos que envolvem o metabolismo primário e secundário devem ser utilizadas, para fornecer uma visão geral das condições bioquímicas que envolvem os processos de produção e consumo de compostos bioativos.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Criar uma base de dados para posterior uso na identificação de metabólitos e suas vias metabólicas envolvidas na formação de compostos bioativos da erva- mate.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Confecção de base de dados na plataforma AMDIS utilizando diferentes tecidos vegetais (folha jovem e adulta, calo embriogênico e gema mersitemática) de erva mate;

• Testar a base de dados criada na identificação de metabólitos nos diferentes

tecidos de erva-mate;

• Averiguação do protocolo tradicional para identificação dos metabólitos de

interesse presentes nos tecidos de erva-mate;

• Verificar se os flavonoides e ácidos cafeiolquinicos estão presentes na mesma fase após a extração líquido/líquido dos metabólitos primários;

• Otimizar as condições cromatográficas para a geração do perfil metabólico

incluindo os flavonoides;

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 REAGENTES

Os reagentes N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida (MSTFA) (CAS 24589­ 78-4), hidrocloreto de metoxiamina (CAS 593-56-6) e solução de padrão de alcanos

(C

7

16

30

62

1), metanol e clorofórmio de grau CLAE foram obtidos da Merck (BR).

Os padrões com grau de pureza de 97-99% (Sigma-Aldrich, USA) utilizados nas análises foram preparados na concentração de 10 mg mL-1, com exceção dos aminoácidos que foram adquiridos em uma mistura comercial na concentração de 2,5 ^mol mL-1 (Tabela 2).

TABELA 2: PADRÕES ANALÍTICOS UTILIZADOS DURANTE AS ANÁLISES POR CG-EM

C o m p o s to C o n c e n tr a ç ã o S o lv e n te (m g/m L) C o m p o s to C o n c e n tr a ç ã o (m g/m L) S o lv e n te Aminoácidos Fosfatados A la n in a 0 ,2 2 H C l F ru to s e -6 -fo s fa ta s e 1 0 ,0 0 H2O A r g in in a 0 ,4 4 H C l G lic o s e -6 - fo s fa ta s e 1 0 ,0 0 H2O Á c id o A s p á r ic o 0 ,3 3 H C l C is te in a 0 ,3 0 H C l Açúcares Alcoóis Á c id o G lu tâ m ic o 0 ,3 7 H C l G lic e ro l 1 0 ,0 0 M e O H G lic in a 0 ,1 9 H C l X ilito l 1 0 ,0 0 M e O H H is tid in a 0 ,3 9 H C l S o rb ito l 1 0 ,0 0 M e O H Is o le u c in a 0 ,3 3 H C l M io -In o s ito l 1 0 ,0 0 H2O L e u c in a 0 ,3 3 H C l M a n ito l 1 0 ,0 0 H2O L is in a 0 ,3 7 H C l M e tio n in a 0 ,3 7 H C l Açúcares F e n ila la n in a 0,41 H C l G lic o s e 1 0 ,0 0 H2O P ro lin a 0 ,2 9 H C l S a c a ro s e 1 0 ,0 0 M e O H S e rin a 0 ,2 6 H C l F ru to s e 1 0 ,0 0 M e O H / H2O (1 :1 ) T e o n in a 0 ,3 0 H C l G a la c to s e 1 0 ,0 0 M e O H Ti ro s in a 0 ,4 5 H C l A ra b in o s e 1 0 ,0 0 M e O H V a lin a 0 ,2 9 H C l M a lto s e 1 0 ,0 0 M e O H T rip to fa n o 1 0 ,0 0 M e O H / C e lo b io s e 1 0 ,0 0 M e O H / H2O (1 :1 ) N H4O H (5 :1 ) Ácidos

Compostos nitrogenados Á c id o F u m á ric o 1 0 ,0 0 M e O H

E s p e rm id in a 1 0 ,0 0 M e O H Á c id o G lic é ric o 1 0 ,0 0 H2O E s p e rm in a 1 0 ,0 0 M e O H Á c id o Is o c itric o 1 0 ,0 0 M e O H / H2O (1 :1 ) P u tre s c in a 1 0 ,0 0 H2O Á c id o M á lic o 1 0 ,0 0 M e O H Á c id o C h iq u ím ic o 1 0 ,0 0 M e O H Específicos da Erva-mate Á c id o S u c c ín ic o 1 0 ,0 0 H2O Á c id o n ic o tín ic o 1 0 ,0 0 M e O H / H2O (1 :1 ) Á c id o C ítric o 1 0 ,0 0 H2O C a fe ín a 1 0 ,0 0 M e O H / H2O (1 :1 ) Á c id o C lo ro g ê n ic o 1 0 ,0 0 M e O H Á c id o Q u ín ic o 1 0 ,0 0 M e O H Á c id o C a fe ic o 1 0 ,0 0 M e O H C a m p fe ro l 1 0 ,0 0 M e O H Q u e rc e tin a 1 0 ,0 0 M e O H

3.2 SENSIBILIDADE

O procedimento para verificação da resposta analítica dos metabólitos na CG- EM foi realizado partindo-se de uma solução base contendo 400 nmol mL-1 (100 %) de cada padrão (Tabela 2). A partir dessa solução padrão foram preparadas, por diluição, em metanol, novas soluções contendo 80%, 60%, 40%, 20% e 5% da solução base. Em seguida essas foram injetadas e os valores de áreas da razão massa/carga do fragmento característico para cada composto foi observado. A sensilidade e a quantidade de extrato vegetal usado nas análises posteriores foram verificados a partir da presença ou ausência do composto alvo no cromatograma dos metabólitos nas diferentes soluções.

3.3 ANÁLISES DE FLAVONOIDES POR CG-EM E OTIMIZAÇÃO DAS ANÁLISES