Não foi observada diferença entre a atrativiade dos hospedeiros testados (Kruskall- Wallis p>0,05). O que foi observado também na frequência relativa de mosquitos atraídos por hospedeiro que apresentou valor igual de 33,33% para todos os hospedeiros (figura 25).
4 DISCUSSÃO
O resultado da pesquisa nos bancos de patentes mundiais mostra a necessi- dade do desenvolvimento de um aparelho de olfatometria vertical considerando as características comportamentais dos insetos anemotáxicos. A otimização de um olfa- tômetro específico para insetos anemotáxicos auxilia a compreender o comporta- mento dos insetos principalmente de importância médica de forma mais precisa, co- mo visto por Batista (2014) ao analisar o comportamento de A darlingi entre odores de indivíduos infectados por P vivax e indivíduos não infectados, o autor cita que o olfatômetro vertical utilizado é apenas para testes comportamentais de curta distân- cia que levam em consideração os fatores temperatura e umidade para obter as res- postas olfativas. Não sendo possível realizar testes comportamentais de longa dis- tância, ou seja, que considerem a anemotaxia do inseto testado.
O olfatômetro vertical com fluxo de ar e sistema de vídeo desenvolvido se di- fere do desenvolvido do para A aegypti pela inserção do fluxo de ar que gera turbu- lência na pluma de odor formada dentro do olfatômetro gerando dispersão da pluma de odor, o que torna a dispersão ativa e não mais passiva como no olfatômetro de Feinsod & Spielman (1979). Os testes de fumaça gerados por ácido acético e hidró- xido de amônia demonstraram que os compostos geram uma fumaça fria e esbran- quiçada, porém intermitente formando uma pluma de odor pouco densa e com baixa dispersão, talvez ideal para ser utilizada em testes no olfatômetro para fêmeas de A.
aegypti que avalia respostas comportamentais a curta distância, utilizando como fon-
te de dispersão apenas a convecção (NETO& EIRAS, 2001).
A pluma formada por vapor de água apresentou fumaça densa esbranquiçada e com alta dispersão, demonstrando ser uma ótima alternativa para avaliação do comportamento de plumas de odor dentro do olfatômetro otimizado, além de se manter constante por determinado período suficiente para ser filmada e avaliada. Pois pluma de vapor de água é gerada por um aparelho de umidificador de ar e não por reações químicas entre compostos interagindo entre si, os quais muitas vezes podem não formar uma boa fumaça dependendo da concentração dos compostos ou da forma que foram manipulados (Moura et al. 1989). A pluma de vapor de água
não é uma prática utilizada na observação da arquitetura da pluma de odor em olfa- tômetros, geralmente observada através de compostos químicos como o tetracloreto de titânio (TiCl4), o qual em contato com o ar gera fumaça bastante densa ideal para observação da pluma de odor, porém extremamente tóxica ao ser inalada. (OMRANI, 2010 ; KAPIAS & GRIFFITHS , 2005).
A pluma de odor gerada pelo umidificador demonstrou ser uma opção atóxica, de baixo custo e de fácil manipulação, podendo ser utilizada sem estruturas comple- xas de renovação de ar como as fumaças geradas por compostos químicos altamen- te tóxicos utilizados, o que é o padrão para padronização de olfatômetros. (OMRANI, 2010)
O fluxo de ar inserido no olfatômetro vertical mostrou-se eficiente em dissipar e gerar turbulência na pluma de odor. A turbulência é importante, pois é responsável por mediar respostas comportamentais de longa distância, permitindo realizar ensai- os que demonstrem a ativação do mosquito e busca pelo hospedeiro. Diferente das respostas de curta distância que são ativadas apenas por umidade e temperatura geradas por convecção (NETO& EIRAS, 2001), como observamos no olfatômetro para fêmeas de A. aegypti .
Experimentos com A. aegypti em túnel de vento expostos a CO2 demonstram
a influência da estrutura da pluma de odor no comportamento do inseto à procura de hospedeiros. A estrutura da pluma de CO2 turbulenta ou filamentosa apresentou sig-
nificativo aumento na atração dos mosquitos quando comparadas a plumas de odor homegêneas (GEIER; BOSCH; BOECKH, 1999). O olfatômetro vertical ao gerar plumas de odor turbulentas se mostra como opção para avaliar respostas sobre pre- ferências olfativas dos mosquitos quando não há possibilidade de realizar experi- mentos sob condições controladas e com grande estrutura, como os experimentos para avaliar respostas olfativas realizados em ambientes de semi campo (LORENZ et al., 2013).
O fluxo de ar demonstrou que aumento do cone superior do olfatômetro para 40 cm a fim de avaliar respostas que não contemplam apenas convecção foi ideal pois a pluma se dissipa por todo cone superior, demonstrando que testes com com- postos voláteis chegariam de forma turbulenta até os mosquitos que estivessem no ápice do cone, porém sem o fluxo de ar a pluma de odor fica restrita apenas a 15 cm
do cone superior, evidenciando a necessidade da implementação do fluxo para gerar turbulência.
Ao avaliar o comportamento de voo de Anopheles em 3D a fim de compreen- der como o mosquito se comporta até encontrar o hospedeiro Spitzen (2013) obser- vou que calor e umidade são elementos importantes no comportamento de busca, porém ao mosquito ser inserido em um sistema com fluxo de ar contrário à direção de voo e com temperatura aquecidao comportamento é intensificado, sugerindo que os mosquitos tem a capacidade de escanear o ambiente em que se encontram du- rante o voo enquanto eles progridem na pluma de odor em busca do hospedeiro. Demonstrando a importância da inserção do fluxo de ar no olfatômetro para realiza- ção de ensaios comportamentais com insetos vetores.
A inserção da câmera proporciona a realização de bioensaios discriminantes o que não era possível no olfatômetro de Feinsod & Spielman. Os testes com siste- ma de vídeo para tornar o olfatômetro vertical apto para bioensaios discriminantes demonstrou que câmeras de baixa resolução como a Webcam Multilaser® são ca- pazes de registrar a ausência ou presença de turbulência na pluma de odor formada por vapor de água, porém com menor qualidade de imagem do que as outras duas testadas mas não foi eficiente em observar mudanças comportamentais nos insetos, o que é essencial para tornar o olfatômetro vertical apto para ensaios discriminantes, pois por ser constituído de alumínio não permite a visualização do comportamento do mosquito até a fonte de odor como no olfatômetro horizontal confeccionado em acrílico por Geier (1999) .
As outras duas câmeras testadas Sony aplha Nex-C3® e Gopro Hero 3+® demonstraram capacidade superior na qualidade das imagens, permitindo registrar com clareza o comportamento da pluma de odor e o comportamento dos mosquitos dentro da câmara superior do olfatômetro. Porém a Gopro Hero 3+® demonstrou ser a melhor candidata a ser implementada no olfatômetro, devido seu tamanho reduzi- do o qual permite a inserção de duas câmeras no cone superior, uma no ápice e ou- tra na base com a finalidade de não haver pontos cegos dentro do olfatômetro.
A Gopro Hero 3+® pode ser inserida diretamente no olfatômetro sem ajuda de suportes para segurar a câmera apenas encaixando a lente no orifício do cone supe- rior do olfatômetro, já da Sony alpha Nex-C3® por ter a lente maior do que o orifício
do cone superior ficou apenas encaixada sobre ele, necessitando de ajuste do fo- co ,o que torna a Gopro Hero 3+® uma opção mais interessante para implementa- ção de um sistema de vídeo no olfatômetro .
A implementação de câmeras ao olfatômetro vertical tem como objetivo inicial torná-lo apto para ensaios discriminantes, permitindo observar o comportamento dos mosquitos até a fonte de odor, dessa forma além de mensurar a quantidade de mos- quitos atraídos por determinado composto é possível avaliar se os mosquitos de- monstram mudanças comportamentais sem efetivamente descer para área de leitu- ra ,configurando apenas ativação e não atração pelo composto (PINTO et al., 2012). A inserção de uma câmara ao aparelho abre um leque de opções para estudos que podem ser executados no olfatômetro quando o sistema de vídeo é utilizado junto a softwares de análises comportamentais permite avaliações refinadas do comporta- mento de vetores como nos estudos realizados por Sutcliffe ( 2015) e Sptizen (2013).
A utilização do cairomônio octenol sozinho como atrativo para Anopheles não são descritos na literatura, geralmente o composto é utilizado combinado com outros cairomônios agindo de forma sinérgica (LIMA et al., 2014). Porém estudos realizados na Guiana Francesa comparando aramadilhas iscadas apenas com octenol, arama- dilhas iscadas com LurexTM (mistura de compostos sintéticos vendidas comercial- mente) e atração humana demonstraram que a armadilha iscada apenas com octe- nol foi capaz de capturar Anopheles em maior riqueza e abundância do que a arma- dilha iscada com LurexTM, apresentando uma eficiente alternativa para ser utilizada na vigilância entomológica de Anopheles (VEZENEGHO et al., 2014).
A realização de ensaios comportamentais em laboratório com olfatometria an- tecedem trabalho em campo economizando tempo e dinheiro dos pesquisadores, podendo avaliar previamente qual taxa de volatilização do composto é mais indicada para ser implementada a armadilha iscada. Dessa forma podemos considerar que o volume de 100µl se comportou como um bom liberador, pois permite a taxa de libe- ração constante do composto enquanto ele durar, podendo permanecer em campo por um longo período sem mudar suas características (ANDRADE, 2006).
A atratividade da taxa 15 mg/h para mosquitos do gênero Anopheles foi ob- servada também em campo por Gama et. al. (2007) em um trabalho realizado em em Brejo do Mutambal, Município de Varzelândia (MG) avaliando armadilhas lumino-
sas do tipo HP iscadas com diferentes taxas de liberação do octenol, com taxas de volatilização previamente obtidas em laboratório, a taxa de 15mg/h mostrou-se mais eficiente na coleta de Anopheles na área da mata do que as taxas de 0,5 mg/h, 5 mg/h e 30 mg/h, Demonstrando ser uma boa taxa para ser utilizada em campo em armadilhas iscadas para coleta de Anopheles e para realização de bioensaios dis- criminantes no olfatômetro.
O estudo em olfatômetros com insetos hematófagos pode também realizar o caminho inverso ,capturando animais de campo com armadilhas já padronizadas, para realizar experimentos afim de elucidar questões sobre o comportamento de in- setos vetores de difícil colonização. Como o estudo realizado por Pinto et. al. (2012) que utilizou armadilhas luminosas do tipo CDC para capturar Nyssomyia neivai em campo e após a captura realizar testes comportamentais em túnel de vento aferindo as preferências olfativas do vetor da leishmaniose cutânea.
Nos bioensaios indiscriminantes com hospedeiros distintos observamos as mesmas médias de atratividade para os hospedeiros o que evidencia seu hábito ali- mentar variável, dependente do ambiente e população como já visto por Flores- Mendoza (1996). O valor de atratividade abaixo de 50% não é considerado atrativo para testes comportamentais de olfatometria (EIRA & NETO, 2001), é necessário a realização de bioensaios indiscriminantes como outros hospedeiros distintos, para realização de bioensaios discriminantes com hospedeiros com valores de atrativida- de acima de 50% para que possamos analisar de forma detalhada o comportamento de A. aquasalis em busca pelo hospedeiro.
Porém pressupõe-se que mosquitos do gênero Anopheles apresentem baixa resposta a atrratividade em olfatômetros como já visto por BATISTA (2014) e SAN- TOS (informação pessoal)1 realizando experimentos testando a atratividade de fê- meas de A. darlingi em diferentes voluntários humanos, utilizando o olfatômetro para fêmeas de A. Aegypti., obteve taxas de atração de aproximadamente 30%. O que
1
SANTOS , T. C. D. - Dados não publicados da sua dissertação de mestrado. Mestrado em Biologia experimental – Universidade de Rondônia , 2015.
corrobora com a ideia de que talvez seja necessária uma nova medida para avalia- ção do comportamento de insetos desse gênero.
É importante frisar que cada inseto anemotáxico hematófago que for testado no olfatômetro possui preferências alimentares de hospedeiros e atratividade frente a taxas de cairomônios diferentes das testadas no presente estudo para A aquasalis, o qual utilizou taxas e hospedeiros previamente conhecidos com a finalidade de pa- dronização do olfatômetro desenvolvido. Dessa forma podemos concluir que para realizar bioensaios discriminantes no olfatômetro analisando o seu comportamento descriminadamente até a fonte de odor podemos utilizar a taxa de 15mg/h e quanto ao hospedeiro devemos realizar mais testes com hospedeiros distintos.
A obtenção de repostas comportamentais no olfatômetro com A aquasalis frente a diferentes taxas de octenol e a hospedeiros distintos demonstraram grande semelhança com dados obtidos em campo, dessa forma podemos inferir que o apa- relho pode nos fornecer dados comportamentais de condições semelhantes as de campo para o gênero Anopheles, estando apto para a realização de ensaios com- portamentais com outros insetos anemotáxicos hematófagos.
O olfatômetro vertical com fluxo de ar e sistema de vídeo foi desenvolvido e testado com A aquasalis, porém permite a realização de ensaios comportamentais com diversos insetos anemotáxicos hematófagos tendo como pré-requisito apenas a mudança da trama do cone superior, por exemplo, para ensaios com flebotomíneos seria necessário confeccionar um cone superior com a trama mais fina para o inseto não ultrapassar o cone.
A área de leitura do olfatômetro vertical com fluxo de ar é constituída por uma janela de acrílico para mensurar os mosquitos atraídos pela fonte de odor de forma visual, porém o desenvolvimento de um software que funciona como contator eletrô- nico ligado ao computador vem sido desenvolvido por nosso grupo de pesquisa e está em fase experimental dessa forma o olfatômetro teria como contato do manipu- lador apenas a inserção dos mosquitos e da fonte de odor, auxiliando a eliminar o viés de contaminação do manipulador como observado por Geier (1999).
O olfatômetro vertical apresenta como vantagem ser um aparelho que de- manda de pouco espaço físico comparado ao vertical, porém não possui sistema de filtro de ar por carvão ativado e não apresenta controle de temperatura e umidade
como geralmente observado em olfatômetro horizontais, precisando manter o ambi- ente que o ensaio for realizado sob controle. Como limitação do olfatômetro vertical poderíamos citar o tamanho da câmara superior não ser tão comprida como os tubos que levam até a fonte de odor nos olfatômetros de dupla escolha, o que poderia afe- tar a avaliação do comportamento de vôo de forma detalhada em longas distâncias. A inserção de duas câmeras Gopro Hero 3+® pode também ser um fator limitante para construção do aparelho em larga escala devido o alto valor da câmera, porém é de extrema importância para tornar o olfatômetro apto para realizar bioensaios dis- criminantes, o contador eletrônico também aumenta o valor final do olfatômetro por necessitar de um computador e uma webcam conectados ao olfatômetro, o qual re- sulta um valor final de aproximadamente R$6.000,00 (seis mil reais) (figura 24).
Após a construção e padronização do olfatômetro vertical para insetos ane- motáxicos hematófagos pretendemos realizar bioensaios discriminantes com cai- romônios, feromônios e testes com A aquasalis infectados e não infectados anali- sando de forma detalhada seu comportamento até a fonte de odor e realizar bioen- saios dicriminates com outros insetos de importância epidemiológica elevada como no RN, como A aegypti.
5 CONCLUSÕES
Podemos concluir que a olfatômetria é uma forte ferramenta que poupa esfor- ços de logística e recursos financeiros podendo simular de forma confiável respostas comportamentais dos insetos vetores quando utilizada respeitando as características fisiológicas e comportamentais do insetos testado. Auxiliando o desenvolvimento de compostos atrativos que podem ser utilizados implementando armadilhas para mo- nitoramente e controle entomológico, afim de torná-las mais eficientes podendo até substituir a atração humana a qual é a principal técnica de captura de insetos hema- tófagos antropofílicos para avaliação de parâmetros entomológicos chave utilizada atualmente.
O olfatômetro vertical com fluxo de ar para insetos anemotáxicos hematóga- fagos está pronto para realização de bioensaios discriminantes , podendo a auxiliar na compreensão do estudo de insetos vetores de doenças que oferecem risco a sa- úde humana como A aquasalis.
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