UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
Paula Blandy Tissot Brambilla
APERFEIÇOAMENTO DO OLFATÔMETRO VERTICAL: UMA FERRAMENTA PARA ESTUDOS COMPORTAMENTAIS DE INSETOS
ANEMOTÁXICOS HEMATÓFAGOS UTILIZANDO COMO MODELO EXPERIMENTAL Anopheles aquasalis (Diptera: Culicidae)
Natal 2016
PAULA BLANDY TISSOT BRAMBILLA
APERFEIÇOAMENTO DO OLFATÔMETRO VERTICAL: UMA NOVA FERRAMENTA PARA ESTUDOS COMPORTAMENTAIS DE INSETOS
ANEMOTÁXICOS HEMATÓFAGOS UTILIZANDO COMO MODELO EXPERIMENTAL Anopheles aquasalis (Diptera: Culicidae)
Dissertação de Mestrado do Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, para obtenção do Título de Mestre em Biologia Parasitária na área de Entomologia Médica.
Orientador: Professora Dra. Renata Antonaci Gama
Natal 2016
Brambilla, Paula Blandy Tissot.
Aperfeiçoamento do olfatômetro vertical: uma ferramenta para estudos comportamentais de insetos anemotáxicos hematófagos utilizando como modelo experimental Anopheles aquasalis
(Diptera: Culicidae) / Paula Blandy Tissot Brambilla. - Natal, 2016.
64 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária.
Orientadora: Profa. Dra. Renata Antonaci Gama.
1. Malária - Dissertação. 2. Vetores - Dissertação. 3. Ecologia química - Dissertação. 4. Olfatometria - Dissertação. I. Gama, Renata Antonaci. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 616.936
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde
que citada a fonte.
Título: APERFEIÇOAMENTO DO OLFATÔMETRO VERTICAL: UMA NOVA FERRAMENTA PARA ESTUDOS COMPORTAMENTAIS DE INSETOS
ANEMOTÁXICOS HEMATÓFAGOS UTILIZANDO COMO MODELO
EXPERIMENTAL Anopheles aquasalis (Diptera: Culicidae)
Dissertação apresentada a Universidade Federal do Rio Grande do Norte para obtenção do título de mestre em Biologia Parasitária na área de Entomologia Médica Aprovado em: Banca Examinadora Prof. Dr. _____________Instituição: ______________ Julgamento: ___________Assinatura: ______________ Prof. Dr. _____________Instituição: ______________ Julgamento: ___________ Assinatura: ______________ Prof. Dr. _____________Instituição: ______________ Julgamento: ___________ Assinatura: _____________
AGRADECIMENTOS
Espero que quem leia estes agradecimentos tenha a felicidade de convier com pes-soas tão especiais quanto as citadas abaixo, que me ensinaram conteúdos que vão muito além do que qualquer conhecimento científico pode descrever.
À minha mãe que é responsável por tudo que sou até hoje independente de títulos acadêmicos , ensinando não só a mim mas a todos em sua volta que é amor que move o mundo. Obrigada por tudo.
Aos meus irmãos, primeiramente a minha irmã gemêa Laura por ser tão diferente de mim em todos os sentidos me ensinando muito sobre mim mesma e sobre como o mundo pode ser visto de várias maneiras. A Renèe por ter tanta sintonia de pensa-mento me ajudando a dar mais sentido aos meus e por ter me dado a felicidade de ser tia. Ao meu irmão João por despertar minha criança interior e lembrar que nunca podemos deixá-la morrer, e a sua mãe Josy por ser uma pessoa tão maravilhosa sempre.
Ao meu pai que me ensinou que a paciência e serenidade é o bem mais precioso de um homem, mente serena coração tanquilo. Obrigada mestre Pa-Kua.
À minha vó Duca por ser a verdadeira “culpada” da sermos uma família tão linda e sempre ter cuidado tão bem de todos nós.
Ao Renato, Nato, Natinho, César meu “soul brother” companheiro de vida que me dá lições diárias de gentileza,humildade e amor apenas sendo quem ele é . O mundo precisa de mais pessoas como você cara.
À Maristela e Ricardo por me tratarem como uma filha ,permitindo eu fazer de sua casa um refúgio para noites em claro e por serem tão compreensivos.
Aos piratas e agregados que nem tenho a coragem de citar nomes por medo de es-quecer alguém, que enchem minha vida de alegria há muitos anos são a família que eu escolhi e está crescendo a cada dia mais. Amo vocês boys.
À minha turma de pós graduação onde fiz amigos que certamente levarei para vida. À todos os amigos do Laboratório de Insetos e Vetores que proporcionam um ambi-ente de pesquisa e aprendizado maravilhoso sem competições de ego ou conflitos muitas vezes pertinentes à ambientes de pesquisa.
À Renata por ser essa professora e pessoa incrível que inspira todos a sua volta com amor pelo que faz , por todos os anos de convivência e aprendizado que levarei para toda minha vida, por me ensinar conhecimentos que transpassam os muros da universidade sempre com muita humildade e paciência característica dos grandes sábios. Obrigada por tudo.
Ao professor Paulo Guedes por tanto engajamento na criação e coordenação da Pós Graduação em Biologia parasitária, sempre disposto a facilitar nossa vida. Obrigada cara.
Aos professores Hebert e Ricardo por aceitarem o convite para participar da banca de qualificação, que foram meus primeiros professores de entomologia ainda na graduação grandes responsáveis pelo início do amor a entomologia.
À Kelly por ter aceitado meu convite de participar da banca de defesa , conseguindo um espacinho no seu tempo tão corrido de mãe com bebê pequeno para me auxiliar com sua avaliação.
Ao professor José Bento que me aceitou em seu laboratório na Fiocruz permitindo aprender sobre a beleza do delicado equilíbrio da manutenção das colônias de
A-nopheles e doação dos exemplares para iniciarmos a nossa própria colônia.
À todos que me ajudaram a cuidar da colônia Rena-to,Fellipe,Alê,Marcel,Laura,Renèe,Caio e minha mãe pelas caronas ao laboratório em todos os horários,sábados,domingos e feriados e pela presença para alimentá-los quando não pude estar presente , sem essa ajuda nada seria possível.
Aos fundos de fomento FAPERN pela verba para desenvolvimento do olfatômetro e CAPES pela bolsa concedida durante a pós graduação.
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte e Centro de Biociências onde tive a oportunidade de realizar o sonho de me tornar biológa ,mestre e fazer os melhores amigos que alguém pode ter.
RESUMO
Os mosquitos do gênero Anopheles são vetores dos Plasmodium causadores da malária humana. O desenvolvimento de novas ferramentas, métodos e técnicas para combater a transmissão da malária são prioritárias. A fim de desenvolver novas formas de combate ao mosquito, temos que compreender o seu comportamento de busca pelo hospedeiro, que é o principal elo na transmissão da doença. Os olfatô-metros são uma maneira simples e confiável de obter respostas comportamentais de insetos, quando utilizados de maneira específica para o inseto testado. Visando isso, o estudo teve como objetivo realizar importantes adaptações no olfatômetro vertical, tornando-o um olfatômetro vertical com fluxo de ar para insetos anemotáxicos hema-tófagos utilizando a espécie Anopheles aquasalis como modelo para estudos com-portamentais. Verificou-se em bases de patentes públicas mundiais a existência do aparelho, posteriormente foi desenvolvido o olfatômetro, baseado em olfatômetros já existentes, implementado com fluxo de ar e sistema de vídeo, para que se tornasse adequado a insetos anemotáxicos, como descrito na literatura. Foram realizados testes com três câmeras diferentes, ausência e presença de fluxo de ar, testes de fumaça e bioensaios indiscriminantes com cairômonio octenol e animais. A fim de avaliar o funcionamento do olfatômetro e suas adaptações Como resultados pode-mos observar que não existem olfatômetros específicos para A. aquasalis, nem para o gênero Anopheles, e nenhum olfatômetro vertical com fluxo de ar para avaliar a resposta olfativa de insetos anemotáxicos. Observamos que plumas de odor geradas no teste de fumaça por vapor de água são muito mais densas, sendo mais apropria-das para avaliar a estrutura da pluma de odor do que as geraapropria-das por ácido acético e hidróxido de amônia, além de serem atóxicas e de baixo custo. Quanto as imple-mentações notamos que a câmera GoPro Hero 3+ demonstrou desempenho superi-or as outras testadas, avaliando com nitidez movimentos de atração e ativação dos mosquitos; o fluxo de ar gerou turbulência nos testes de pluma de odor, tornando a difusão ativa ao invés de passiva. Nos bioensaios indiscriminantes com octenol ob-servamos que taxas de 15mg/h tem maior média de atratividade (66,7%) comparada as de 14 mg/h (33,3%) e 18mg/h (0%), demonstrando que há relação entre a taxa de volatilização e número de insetos atraídos (p<0.05); com diferentes hospedeiros ob-servamos não haver relação (p=1.00) entre diferentes espécies e atratividade de A
avaliar o comportamento de insetos anemotáxicos hematófagos torna os resultados obtidos mais confiáveis, pois o aparelho é específico para os insetos, permitindo a realização de estudos comportamentais mais simples e exatos.
ABSTRACT
The Anopheles genus mosquitoes are vectors of the Plasmodium that cause human malaria, the development of new tools, methods and techniques to fight ma-laria transmission are high priority. In order to develop new ways to fight the mosqui-to, we have to understand its behavior when searching for the host, which is the main link in the transmission of the disease. The olfactometers are a simple and reliable way to obtain behavioral responses of insects, when used in a specific way for the tested insect. Although widely employed in the study of agricultural entomology for pest control, the use of olfactometry for the study of vector insects in Brazil is scarce. Due to the eminent importance of developing new ways to block the link of patho-gens transmission from mosquitoes to humans, it is essential to optimize tools that help us to understand the vector behavior. Considering that, the study aimed at de-veloping a vertical olfactometer with air flow for the haematophagous insects,using
Anopheles aquasalis as experimental model. The existence of such tool was verified
in worldwide public patent databases, afterwards the olfactometer was built based on existing models, with the implementation of the air flow and video system, in order to become suitable to anemotaxis insects as described in the literature. Tests were per-formed with three different cameras, absence and presence of airflow, smoke tests and indiscriminate bioassays with kairomone octenol and animals in order to assess the functioning of the olfactometer and its implementations. As results, we can assert that there are no specific olfactometers for the Anopheles aquasalis nor to the Anopheles genus, and there is no vertical olfactometer with air flow to evaluate the smell response in anemotaxis insects. We observed that odor plumes generated in the smoke test from water vapor are much denser, being more suited to the evalua-tion of its structure than those generated by acetic acid and ammonium hydroxide, in addition to being non-toxic and low-cost. About the implementations, we noted that the GoPro Hero 3+ camera demonstrated superior performance to the other tested, capturing clearly attraction and activation movements of the mosquitoes; the air flow
generated turbulence in the odor plume tests, making the diffusion active instead of passive. In the indiscriminate bioassays with octenol we observed that rates of 15mg/h have the highest average of attractiveness (66.66%) compared to 14 mg/h (33.33%) and 18mg/h (0%), demonstrating that there is a relation between volatiliza-tion rate and the number of insects attracted (p<0.05); with different hosts we ob-served no relation (p=1:00) among different species and attractiveness rate of
Anopheles aquasalis. We conclude that the development of a specific tool to assess
the haematofagous anemotaxis insects behavior makes the obtained results more reliable, due to the device being specific to the insect, allowing the realization of sim-pler and more accurate behavioral studies.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 13
1.1 COMPORTAMENTO DE BUSCA PELO HOSPEDEIRO : A QUÍMICA DA ATRAÇÃO ... 13
1.2 OLFATOMETRIA : RAPIDEZ E PRECISÃO EM ESTUDOS COMPORTAMENTAIS ... 16
1.3 GÊNERO Anopheles : IMPORTÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA ... 19
1.4 Anopheles aquasalis : UM BOM MODELO EXPERIMENTAL ... 20
1.5 CONTROLE ENTOMOLÓGICO X RESISTÊNCIA A INSETICIDAS ... 22
1.6 JUSTIFICATIVA ... 25
1.7 OBJETIVO GERAL ... 26
1.7.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 26
2 MATERIAIS E MÉTODOS... 27
2.1 CONSULTAS EM BASES DE PATENTES PÚBLICAS ... 27
2.2 CONSTRUÇÃO DO OLFATÔMETRO ... 27
2.3 TESTE DE FUMAÇA ... 33
2.3.1 PLUMA DE ODOR COM ÁCIDO ACÉTICO E HIDRÓXIDO DE AMÔNIA ... 33
2.3.2 PLUMA DE ODOR COM VAPOR DE ÁGUA ... 34
2.4 IMPLEMENTAÇÕES DESENVOLVIDAS ... 34
2.4.1 SISTEMA DE VÍDEO ... 34
2.4.2 FLUXO DE AR ... 35
2.5 REALIZAÇÃO DOS BIOENSAIOS INDISCRIMINANTES ... 36
2.5.1 INSETOS UTILIZADOS NOS BIOENSAIOS ... 37
2.5.2.1 OBTENÇÃO DA TAXA DE VOLATILIZAÇÃO DO OCTENOL .. 38
2.5.2.2 BIOENSAIOS INDISCRIMINANTES COM OCTENOL ... 39
2.5.3 BIOENSAIOS INDISCRIMINANTES COM HOSPEDEIROS DISTINTOS ... 40
3 RESULTADOS ... 41
3.1 CONSULTAS EM BASES DE PATENTES PÚBLICAS ... 41
3.2 TESTE DE FUMAÇA ... 41
3.3 IMPLEMENTAÇÕES DESENVOLVIDAS ... 41
3.3.1 FLUXO DE AR ... 42
3.4 BIOENSAIOS INDISCRIMINANTES ... 44
3.4.1 TESTES COM 1-OCTEN-3-OL (OCTENOL) ... 45
3.4.1.1 PERDA MÉDIA DE OCTENOL POR HORA E APÓS 24 HORAS ... 45
3.4.1.2 BIOENSAIOS COM OCTENOL ... 47
3.5 BIOENSAIOS COM HOSPEDEIROS DISTINTOS ... 49
4 DISCUSSÃO ... 50
5 CONCLUSÕES ... 58
REFERÊNCIAS ... 59
1 INTRODUÇÃO
1.1 COMPORTAMENTO DE BUSCA PELO HOSPEDEIRO : A QUÍMICA DA ATRAÇÃO
Os insetos interagem com o meio em que vivem e com os outros organismos sendo da mesma espécie ou não através de estímulos químicos. Esses compostos químicos agem nos insetos como gatilhos fisiológicos desencadeando comportamento específico para o composto identificado, dessa forma que os insetos acham parceiros para acasalamento, sítios para oviposição, buscam alimentos ou presa, se defendem contra predadores e organizam suas comunidades no caso dos insetos sociais. Os compostos químicos são de modo geral denominados semioquímicos e são classificados dependendo do comportamento fisiológico que despertam no inseto . Os semioquímicos (semioquímicos = sinais + químicos) são basicamente classificados e divididos em: feromônios, os quais são mediadores químicos intraespecíficos, e aleloquímicos, os quais são mediadores químicos intrerspecíficos (figura 1) (ZARBIN; RODRIGUES; LIMA, 2009).
Figura 1 – Nomenclatura adotada para semioquími-cos e critérios biológisemioquími-cos de classificação desses compostos.
Entre os semioquímicos os estudos e aplicações de feromônios sexuais empregados ao controle de insetos praga no país são bem desenvolvidos, contando com a estrutura do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Semioquímicos na Agricultura. Esse foi formado com intiuito de diminuir a dependência externa desenvolvendo bases tecnológicas para a identificação, síntese e uso de semioquímicos entre insetos e plantas na agricultura brasileira (INCT-Semioquímicos na Agricultura, 2015). No entanto, quando se trata de insetos vetores, apesar da ampla ocorrêcia em todo o país pesquisas relativas à semioquímicos e suas interações ainda são escassas (EIRAS, 2001).
Os aleloquímicos são classificados basicamente com relação a consequência que geram ao emissor e ao receptor do sinal químico e dessa forma são classificados da seguinte maneira: Alomônios (+ -): o sinal químico gera vantagem para o emissor e desvantagem para o receptor, por exemplo os venenos neuropeptídeos que diversas espécies de vespas produzem ; Sinomônios(++): o sinal químico evoca no receptor uma resposta comportamental ou fisiológica adaptativa favorável tanto para o emissor como para o receptor, por exemplo a relação entre abelhas e flores (a relação mediada por sinomônios é bastante comum entre insetos herbívoros e plantas); Cairomônios (- + ): o sinal químico gera desvantagem para o emissor e vantagem para o receptor, por exemplo a relação entre mosquitos e hospedeiros (figura 2) (VILELA ; DELLA-LUCIA, 2001) a qual é o escopo do presente trabalho.
O comportamento de busca por alimento dos insetos hematófagos é guiado pelo odor do hospedeiro, o qual emite compostos voláteis como CO2 e octenol
(1-octen-3-ol), e não voláteis como ácido lático e ácidos graxos. O odor é gerado por reações metabólicas do organismo como a respiração, despertando reações fisiológicas nos mosquitos à procura de alimento. Novas estratégias de controle visando o monitoramento de mosquitos podem ser desenvolvidas baseadas no comportamento de busca à fonte de alimento e nos compostos voláteis emitidos pelos hospedeiro, os cairomônios (EIRAS, 2001).
O sistema olfativo dos mosquitos é basicamente composto por neurônios de receptores olfativos (NROs), que constituem o sistema olfativo periférico, e centros superiores cérebrais que recebem mensagens dos NROs. As sensilas localizadas nos palpos, antenas e probóscide são estruturas que abrigam os NROs, os quais detectam compostos voláteis e transduzem os sinais químicos em elétricos que são identificados pelo sistema nervos central. A detecção de odores específicos como CO2, octenol, ácido lático e amônia é efetuada por proteínas receptoras localizadas
na membrana dendrítica dos NROs (BOHBOT et al., 2013).
O grau de associação entre mosquitos e hospedeiros é extremamente variável podendo ser (1) generalistas: alimentando-se de uma gama de hospedeiros, (2) estritamente zoofílico: alimentando-se apenas de animais, (3) ou antropofílico: alimentando-se de humanos. A busca pelo hospedeiro é principalmente desencadeada por respostas olftativas de longo alcance e é a grande responsável pela localização do hospedeiro, voando contra o fluxo de ar formado por correntes de ventos, seguindo plumas de odor formadas por compostos voláteis emanados dos hospedeiros. As respostas de curta distância para auxiliar a encontrar o hospedeiro também são utilizadas no comportamento de busca e funcionam através da pouca visão do mosquito, detecção de temperatura e umidade, porém tem menos importância (GIBSON; TORR, 1999).
1.2 OLFATOMETRIA: RAPIDEZ E PRECISÃO EM ESTUDOS COMPORTAMENTAIS
A olfatometria é uma técnica utilizada para demonstrar como determinado semioquímico afeta o comportamento ou fisiologia do inseto. A principal função da olfatômetria é produzir dados qualitativos ou quantitativos, dependendo da pergunta a ser respondida, de maneira rápida, eficiente e precisa. Para esse tipo de estudo são utilizados aparelhos chamados olfatômetros. Existem vários olfatômetro disponíveis para venda, porém todos tem um mesmo princípio de funcionamento podendo ser adaptado para o tipo de inseto a ser testado (EIRAS; NETO, 2001).
Os olfatômetros basicamente apresentam os mesmos elementos: câmara para inserção dos insetos testados, área para inserção do composto químico (ou fonte de odor) e área de leitura (câmara para onde os insetos voam ou caminham se atraídos pelo composto químico). Os dados são gerados através de bioensaios classificados em: (1) bioensaios indiscriminantes avaliando apenas a atração ou não do inseto à fonte de odor e (2) bioensaios discriminates avaliando todo o comportamento do inseto até a fonte de odor, observando alterações comportamentais mesmo quando o inseto não chega à área de leitura do olfatômetro (EIRAS; NETO, 2001).
Para a realização de testes comportamentais para a compreensão do compor-tamento de vetores frente à cairomônios é necessária à utilização de aparelhos es-pecíficos para o inseto testado. Existem aparelhos desenvolvidos para avaliar espe-cificamente respostas comportamentais de mosquitos como o olfatômetro de tubo Y (GEIER; BOECKH, 1999), o olfatômetro para estudos comportamentais de mosqui-tos (OMRANI, 2010) e aparelhos adaptados como o túnel de vento, desenvolvido para indústria aeroespacial, e o olfatômetro horizontal de dupla escolha utilizado na entomologia médica para avaliar a resposta dos insetos a plumas de odor, porém todos orientados no eixo horizontal e constituídos em acrílico (EIRAS; NETO, 2001). Todos os olfatômetros e aparelhos citados anteriormente contém basicamente um tubo principal que se bifurca em dois tubos, onde em cada tubo da bifurcação é
inse-tos a serem testados (figura 3), ou seja, testando basicamente dois composinse-tos quí-micos ao mesmo tempo, avaliando qual é o mais atraente.
Feinsod (1979) desenvolveu um olfatômetro vertical para avaliar a resposta olfativa de fêmeas de Aedes aegypti por correntes de convecção (temperatura+umidade) que a curta distância são responsáveis por carrear os compostos químicos (figura 4) (FEINSOD; SPIELMAN, 1979). O qual pode ser utilizado também para avaliar a preferência olfativa de insetos a determinada taxa de volatilização de um semioquímico ou da mistura entre eles quando já estão misturados (SILVA et. al. 2005)
O olfatômetro vertical minimiza o viés comportamental ignorado nos olfatômetros de tubo Y (dupla escolha), pois são aparelhos desenvolvidos no eixo horizontal e com fluxo de ar também horizontal (ROSIGNOL; DOGAN, 1999). No entanto como os insetos anemotáxicos são guiados por correntes de vento se deslocando no eixo vertical em zigue-zague para a fonte de odor, ensaios comportamentais que não utilizam fluxo de ar ou eixo vertical estão excluindo anemotaxia, limitando os seus testes a respostas comportamentais de curta distância geradas apenas por correntes de convecção (temperatura + úmidade) (EIRAS; NETO, 2001).
1.3 GÊNEROS Anopheles: IMPORTÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA
Existem cerca de 485 espécies de mosquitos no gênero Anopheles conhe-cidas, encontrados em quase todo o mundo, com espécies que ocorrem em zonas temperadas, subtropicais e tropicais, vão desde elevações ao nível do mar até ter-renos montanhosos, ausentes na maioria das ilhas do Pacífico, Nova Zelândia, Fiji, Nova Caledônia e ilhas isoladas no Atlântico (Walter Reed Biosystematics Unit, 2015). Aproximadamente 45 espécies são consideradas vetores dos Plasmodium causadores da malária humana (FORATTINI, 2002).
A malária caracteriza-se por ser uma doença febril aguda (DFA) e os pri-meiros sintomas se manifestam aproximadamente de 10 a 15 dias após a picada do mosquito infectado, causando febre, cefaleia calafrios e vômitos, se não tratada ode levar a morte. Existem grupos considerados de alto risco de desenvolver ma-lária grave, podendo levar rapidamente a morte como crianças abaixo de cinco anos, mulheres grávidas e pacientes com HIV/AIDS (WORLD HEALTH ORGANI-ZATION, 2015).
No Brasil particularmente a malária é reportada desde 1587 relatado no “Notícia do Brasil” de Gabriel Soares de Souza's, no qual a existência de uma “febre terçã e quartã “ é descrita ocorrendo entre os índios Tupinambás. A partir de então várias epidemias violentas de malária foram relatadas causando muitas mortes, relacionadas ao fluxo populacional como, por exemplo, a migração em massa de nordestinos com destino ao norte do país para extração de látex em 1870 e a construção da ferrovia Madeira-Mamoré na região amazônica 1910/1913. No início do século passado em 1930 houve também uma grande epidemia devido a introdução de Anopheles gambie uma espécie exótica vinda da África, introduzida no Rio Grande do Norte e Ceará, porém foi erradicado com sucesso devido ao programa intenso de controle vetorial (DEANE, 1986).
Atualmente a área endêmica para malária no Brasil está restrita a região amazônica incluindo os estados do Acre, Amazonas, Amapá, Pará, Rondônia,
Roraima, Tocantins, Mato Grosso e Maranhão (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015). Porém se avaliarmos a nível global, doença ainda acomete 300 milhões e mata 1 milhão de pessoas por ano, 3.2 bilhões de pessoas, quase metade da população mundial, vive em área de risco de contágio sendo a maior parte na África-subsariana, mas também são consideradas áreas de risco de transmissão Ámerica latina, Ásia e em menores proporções o Oriente médio e partes da Europa (WHO, 2015).
A importância epidemiológica do gênero Anopheles gera esforços de grupos de pesquisas no mundo inteiro procurando compreender a tríade vetor-parasito-hospedeiro. A criação de mosquitos em laboratório permite a realização de estudos das interações naturais dessa tríade, os quais são muito importantes para o desenvolvimento de estratégias que possam ser aplicadas em campo. Porém, esses tipos de estudos não são possíveis quando há dificuldades de colonização da espécie em laboratório como podemos verificar com A. darlingi, principal vetor da malária no Brasil, pois para haver a manutenção da colônia os mosquitos devem copular sozinhos após algumas gerações, o que ainda não conseguiram obter com sucesso com essa espécie. Entretanto, Anopheles aquasalis vem sido colonizado com êxito há alguns anos em vários laboratórios do mundo (BAHIA et al., 2010; LOUNIBOS; CONN, 2000; RIOS-VELÁSQUEZ et al., 2013).
1.4 Anopheles aquasalis: UM BOM MODELO EXPERIMENTAL
Anopheles aquasalis são mosquitos considerados vetores primários da
malária humana possuindo ampla distribuição geográfica no continente sul americano, no geral restritos a áreas costeiras e ambientes com influência marítima. Apresentando indivíduos do sudeste do Brasil (São Paulo) até a Colômbia (figura 5) (FORATTINI, 2002; CONSOLI E LOURENÇO, 1994). Apesar de ser um mosquito encontrado exclusivamente em áreas litorâneas há relatos de exemplares encontrados no sertão nordestino a mais de 100 quilómetros de distância do litoral,
porém apenas quando o solo tem alta concentração de cloretos ou quando sofre invasões de marés, como por exemplo, em Belém (PA) (DEANE, 1986).
Em relação aos hábitos alimentares podemos dizer que A. aquasalis é geralmente zoofílico, quando comparado a outros vetores como Anopheles darlingi, principal vetor da malária humana no país, entretanto há evidências de que dependendo da localização geográfica que o mosquito habita e da densidade de oferta do hospedeiro ele pode demonstrar hábitos alimentares zoofílicos, optando por picar animais não humanos ou antropofílicos, preferindo picar humanos (FLORES-MENDOZA et al., 1996) .
Estudos demonstraram em testes laboratoriais que o A. aquasalis tem maiores taxas de infectividade por Plamsodium vivax, principal Plasmodium causador da malária no Brasil, do que A. Darlingi Anopheles albitarsis, Anopheles
nuneztovari e Anopheles triannulatus (MS, 2015).
Portanto, devido sua grande importância epidemiológica e possibilidade de obter colônia em laboratório A. aquasalis propicia um bom modelo experimental para testes comportamentais e testes de infecção com Plasmodium auxiliando a compreender o elo entre vetor, parasito e humano. É importante enfatizar que no Rio Grande do Norte desde 1980 não realizam estudos com A. aquasalis, e os estudos realizados foram apenas a nível taxonômico sem avaliações da bionomia ou comportamento desse vetor que é encontrado comumente no RN (XAVIER, 1980).
1.5 CONTROLE ENTOMOLÓGICO X RESISTÊNCIA A INSETICIDAS
O programa de controle vetorial preconizado pela WHO adota como principal medida de combate ao vetor a utilização de mosquiteiros impregnados com inseticida piretróide e pulverização intradomiciliar com o inseticida piretróide, atualmente a única classe permitida para uso de combate ao Anopheles. Tais medidas estão atribuídas a grande redução dos casos de pessoas infectadas uma vez que entre 2000 e 2015 os casos de malária decaíram em 37% a nível mundial (WHO, 2015). Os inseticidas se mostram muito eficientes, pois interrompem o ciclo de transmissão ainda no vetor, porém já foram relatados casos de resistência em vários locais como na África-subsariana e Índia (WHO, 2015). Dessa forma o desenvolvimento de novas metodologias, técnicas e armadilhas de combate ao vetor são consideradas de caráter prioritário (WHO, 2015).
Existem inúmeros tipos de armadilhas para coleta de Anopheles antropofílicos com finalidades distintas dependendo da pergunta a ser respondida pelo trabalho (figura 6), porém nenhuma amplamente utilizada para controle efetivo do vetor, como os mosquiteiros impregnados. Essas geralmente são empregadas na vigilância
entomológica, avaliando, por exemplo, a dinâmica populacional dos mosquitos, implementando estudos epidemiológicos ou perguntas voltadas a bionomia do inseto. Ainda não há nenhuma armadilha disponível no mercado que tenha a eficácia tão boa quanto a atração humana, metodologia atualmente mais utilizada em estudos entomológicos para averiguar a taxa de picadas, grau de antropofilia e a relação entre exposição humana e taxas de transmissão. (LIMA et. al., 2014)
A atração humana consiste basicamente na técnica de captura em que um humano expõe suas pernas e espera os anophelinos antropofílicos pousarem, capturando o inseto com aspirador manual antes que seja picado. Esse método é especialmente eficaz em áreas com as densidades populacionais baixas ou moderada de espécies antropofílicas de Anopheles, como as áreas endêmicas de malária no Brasil, sendo o método mais preciso para determinar parâmetros entomológicos-chave e avaliar medidas de controle a serem tomadas pelos órgãos de saúde (LIMA et al., 2014) .
O aperfeiçoamento de opções alternativas para controle ao vetor que não utilizam inseticidas é alvo de estudo de muitos grupos de pesquisa atualmente, buscando, por exemplo, implementar armadilhas já existentes para o monitoramento, tornando-as específicas para Anopheles antropofílicos otimizando a captura desses mosquitos com objetivo de utilizá-las para controle vetorial. Demonstrando principalmente ser uma alternativa tão eficiente quanto à atração humana, podendo até subistiuí-la o que é muito importante, já que a atração humana é altamente desencorajada pela WHO devido o alto risco do indivíduo contrair malária (GAMA et al., 2013; SCOTT M. SHONE , GREGORY E. GLASS, 2006).
Nessa perspectiva nosso estudo tem como finalidade tornar os testes comportamentais realizados em laboratório mais sensíveis, promovendo um avanço na compreensão do comportamento do vetor, o que é imprescindível para o aprimoramento de armadilhas que não ofereça riscos aos humanos e ao meio ambiente e impeça o vetor a criar resistência aos métodos utilizados, o que dificulta mais ainda o papel do controle de endemias transmitidas por insetos hematófagos .
1.6 JUSTIFICATIVA
A olfatometria é uma técnica rápida e precisa utilizada para evidenciar o comportamento dos insetos frente a odores, porém é necessária a utilização de olfatômetros adequados às características fisiológicas e comportamentais dos insetos testados. Os olfatômetros na área de entomologia médica têm finalidade de obter respostas sobre as preferências ou repelências alimentares e sexuais de insetos hematófagos frente à cairomônios ou feromônios respectivamente. Empregados para o desenvolvimento de compostos que possam ser aplicados em armadilhas para vigilância e controle entomológico. Devido a eminente importância epidemiológica de A. aquasalis, e a crescente resistência de Anopheles aos inseticidas disponíveis utilizados para realização do controle vetorial, faz-se necessário o desenvolvimento de novos meios para dificultar ou bloquear o elo de transmissão vetor-hospedeiro, sendo primordial o aprimoramento de ferramentas que nos auxiliem a compreender o comportamento do vetor. Assim o aperfeiçoamento de um olfatômetro vertical adaptado para insetos anemotáxicos hematófagos utilizando como modelo experimental. A. aquasalis é de notável importância epidemiológica. Além disso, a implementação do estudo da ecologia quimica no Estado do Rio Grande do Norte permite a abertura para bioensaios pioneiros no Estado.
1.7 OBJETIVO GERAL
Otimização do olfatômetro vertical realizando implementações com fluxo de ar e sistema de vídeo a fim de desenvolver uma nova ferramenta que realize bioensaios discriminantes para insetos anemotáxicos hematófagos, utilizando como modelo experimental A. aquasalis.
1.7.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a. Comparar diferentes substâncias como fonte de odor para testes de fumaça;
b. Testar três câmeras diferentes a fim de eleger a melhor para implementação de um sistema de vídeo no olfatômetro tornando apto para bioensaios discriminantes;
c. Avaliar como o fluxo de ar modifica a estrutura da pluma de odor no olfatometro vertical;
d. Realizar bioensaios indiscriminantes com A aquasalis testando diferentes taxas de volatilização do cairomônio octenol;
e. Realizar bioensaios indiscriminantes com A. aquasalis testando hospedeiros distintos;
f. Aperfeiçoar o olfatômetro vertical para ensaios com insetos de importância médica
g. Patentear o olfatômetro vertical com fluxo de ar e sistema de vídeo para insetos anemotáxicos hematófagos.
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 CONSULTAS EM BASES DE PATENTES PÚBLICAS
Realizou-se uma pesquisa nos principais bancos mundiais de patentes, baseado no “Guia prático para buscas em bases de patentes gratuitas” do Instituto Nacional de Propriedade Industrial (INPI) as bases pesquisadas foram pesquisadas foram: INPI para busca de patentes depositadas no Brasil; World Intellectual Property Organization (WIPO) para busca de patentes depositadas nos Estados Unidos; Latipat para busca de patentes depositadas na América Latina e Espanha; Espacenet para busca internacional no escritório europeu de patentes; Japan Patent Office para busca de patentes no escritório japonês de patentes.
A pesquisa foi realizada inserindo nas bases de patentes os termos ”Olfactometer”, “Anopheles aquasalis”, “Vertical Olfactometer”, “Mosquitos”, “Anopheles Genus”, “Insects”, “Hematophagous”, “Anemotaxis”. Individualmente e em combinações entre si, como preconizado pelo guia.
2.2 CONSTRUÇÃO DO OLFATÔMETRO
O olfatômetro vertical foi construído baseado no desenvolvido por Feinsod & Spielman (1979) para avaliar o comportamento de busca ao hospedeiro por fêmeas de Aedes aegypti. Realizaram-se modificações estruturais no tamanho do olfatôme-tro aumentando a altura, largura e comprimento de 28 cm x 20 cm x 20 cm para 90 cm x 50 cm x 50 cm, a fim de tornar suas estruturas capazes de comportar uma fon-te de energia para adaptação de sisfon-temas de vídeo e fluxo de ar, permitindo também a inserção de fontes de odores de variados tamanhos, o que não era possível
ante-riormente devido às pequenas proporções do olfatômetro de Feinsod & Spielman (1979). A fim de tornar o olfatômetro vertical mais sensível para realização de ensai-os com insetensai-os anemotáxicensai-os hematófagensai-osfoi instalado um fluxo de ar, e com intuito de executar bioensaios discriminantesfoi inserido um sistema de vídeo, registrando o comportamento do inseto dentro do olfatômetro, que por ser constituído em alumí-nio (para evitar a impregnação de odores) não permite a visualização do comporta-mento dos mosquitos até a fonte de odor, sendo utilizado apenas para bioensaios indiscriminantes.
O olfatômetro é orientado no eixo vertical, composto por três partes principais câmara superior, câmara inferior e área de inserção da fonte de odor:
Câmara superior: Confecionada de alumínio de trama 14x14, em formato de cone invertido com dois orifícios no ápice, um para inserção do sistema de vídeo e um orifício para a inserção dos mosquitos, tampado com algodão durante os testes. Medindo 40 cm de altura com 22 cm de diâmetro, afunilando 8 cm até a extremidade basal do cone terminando com 14 cm de diâmetro (figura 7 ).
A fim de não haver contado visual dos mosquitos com o ambiente externo e minimizar os “efeitos do observador” os quais podem gerar mudanças comportamentais (ALMEIDA et al, 2006) durante a realização dos testes é inserido em volta do cone superior uma barreira visual em forma de cilindro sem fundos constituída de folha de alumínio medindo 40 cm de altura por 35 cm de diâmetro (Figuras 8 e 9 ).
Câmara inferior: É a área de leitura do olfatômetro, onde podemos averiguar quantos mosquitos foram atraídos pela fonte de odor. Constituída de alumínio em formato cilíndrico com uma janela de acrílico para observação dos mosquitos atraídos, medindo 24 cm de altura por 15 cm de diâmetro, com janela de acrílico medindo 12x12 cm (figura 10). A base da área de leitura contém uma estrutura cônica de alumínio medindo 15 cm de altura afunilando com o diâmetro do ápice
medindo 7,5 cm. Abaixo do cone inserimos o fluxo de ar implementado, o qual não é presente no olfatômetro vertical para fêmeas de A. aegypti, o ápice do cone foi telado para impedir que os mosquitos desçam da área de leitura para fluxo de ar durante os experimentos (figura 11).
Área de inserção da fonte de odor: Estrutura confecionada com folhas de alumínio em formato de cubo, medindo 50 cm x 50 cm x 50 cm, sem uma face lateral. Local onde é inserida a fonte de odor para ser avaliada e ao fundo é fixada a fonte de energia. A face superior do cubo possui um orifício onde são encaixadas as câmaras superior e inferior, ficando basicamente em formato de ampulheta com cones de tamanhos diferentes (figura 12).
Olfatômetro montado: As câmaras se interligam encaixando o ápice dos cones um dentro do outro, não utilizando qualquer tipo de material autocolante como fitas ou colas sintéticas para unir as partes do olfatômetro quando montado para ensaios para evitar impregnação do odor dos colantes no olfatômetro como observado por Geier (1999) (figura 7). Todas as partes do olfatômetro que não são desmontáveis foram soldadas ou unidas apenas com rebites de alumínio, exceto a janela de acrílico.
2.3 TESTE DE FUMAÇA
O teste de fumaça é fundamental para simular a arquitetura da dispersão dos compostos voláteis dentro do olfatômetro. Essa dissipação ocorre no ambiente naturalmente carreada por correntes de ventos, dentro das correntes de ventos formam-se plumas de odor, as quais são o local onde se encontram as moléculas de odor nas correntes.
A observação das plumas de odor pode ser realizada em laboratótioa através de substâncias que produzam uma fumaça fria, branca e densa que possa ser visualizada em contraste com um fundo escuro (EIRAS; JEPSON, 1991). Dessa maneira foram testados dois tipos de fumaças obtidas de formas diferentes, avaliando qualitativamente qual a melhor metodologia para observar a dissipação da pluma. Os testes foram filmados e posteriormente avaliados utilizando como parâmetros para avaliação dispersão e densidade da pluma gerada, atribuíndo como categorias baixa média e alta tanto para dispersão como para densidade.
2.3.1 PLUMA DE ODOR COM ÁCIDO ACÉTICO E HIDRÓXIDO DE AMÔNIA
A fumaça foi gerada por um pedaço de algodão embebido com ácido acético (C2H4O2) e hidróxido de amônia (NH4OH) inserido na área de inserção da fonte de odor do olfatômetro, formando uma fumaça esbranquiçada e fria que em contraste com um fundo escuro, permitiu visualizar a estrutura da pluma de odor dentro do equipamento (MOURA et al. 1989).
2.3.2 PLUMA DE ODOR COM VAPOR DE ÁGUA
Para obtenção da pluma de odor com vapor de água, utilizou-se um umidificador de Ar Ultra Air UM05E 4,5 litros - Electrolux, o qual funciona gerando vapor de água ao perceber que a umidade relativa do ambiente está menor do que a programada no aparelho, formando uma fumaça branca e fria.
O umidificador foi inserido na área de inserção da fonte de odor do olfatômetro e ligado em potência máxima de 80% de umidade gerando uma fumaça densa branca e fria.
2.4 IMPLEMENTAÇÕES DESENVOLVIDAS
2.4.1 SISTEMA DE VÍDEO
As camêras foram avaliadas com relação a eficácia de filmar a pluma de odor e mudanças comportamentais dos mosquitos dentro da câmara superior do olfatômetro, tornando o olfatômetro vertical competente para ensaios comportamentais discriminantes.
Os testes realizados utilizaram como classificação SIM, no caso da câmera desempenhar determinada função, ou NÃO, quando a câmera não demonstrou o parâmetro avaliado. Os testes consistiram basicamente em filmagens dos bioensaios realizados e dos testes de fumaça.
A fim de avaliar o melhor sistema de vídeo para ser implementado no olfatômetro foram testadas três câmeras diferentes:
Webcam Mutilaser®: a câmera possui 1.3 megapixels de resolução e luz de LED, ligada por cabo USB ao computador durante os ensaios, pois não possui sistema de memória interna. A lente da câmera foi encaixada diretamente no orifício da câmara superior durante o teste ficando fixa ao olfatômetro.
Sony aplha Nex-C3®: a câmera é semiprofissional, possui 16.2 megapixels de reso-lução e memória interna permitindo gravar os testes sozinhos. A câmera possui lente maior que o orifício da câmara superior do olfatômetro, dessa forma a lente ficou apenas apoiada sob o orifício captando os testes.
Gopro Hero 3+®: a câmera possui 10.0 megapixels de resolução e memória interna permitindo gravar os testes sozinhos. A lente da câmera foi encaixada diretamente no orifício da câmera superior durante os testes ficando fixa ao olfatômetro.
2.4.2 FLUXO DE AR
O fluxo de ar inserido é um cooler com velocidade de 0,4m/s; da fabricante Multilaser®, confeccionado em acrílico, com 7 pás (figura 13), ligado a uma fonte de energia Atx 400 watts da fabricante Clone® (figura 12b).
Para avaliar a capacidade do fluxo de ar gerar dissipação e turbulência da pluma de odor foram realizados testes de fumaça apenas com vapor de água, por ser uma fonte de fumaça atóxica e formar uma pluma bem mais densa do que a fumaça gerada com ácido acético e hidróxido de amônia.
Os testes foram realizados mantendo o fluxo de ar ligado e desligado, utilizamos como parâmetro para avaliar a dissipação: o tamanho da pluma de odor gerada e ausência ou presença de turbulência na pluma de odor. Os testes foram filmados para análises posteriores.
2.5 REALIZAÇÃO DOS BIOENSAIOS INDISCRIMINANTES
A realização dos bioensaios indiscriminantes teve como objetivo certificar a eficiência do olfatômetro vertical adaptado para insetos hematófagos utilizando o cairomônio octenol e hospedeiros já vistos na literatura como atrativos para A.
aquasalis. Essa metodologia permite analisar se o aparelho está apto para
realização de ensaios comportamentais, avaliando se o mosquito demonstra resultados similares aos encontrados na literatura.
Para cada teste foram utilizadas 10 fêmeas, retiradas da gaiola através de sucção por capturador de Castro e inseridas na câmara superior do olfatômetro. Os testes tiveram duração de 10 minutos, divididos em duas partes, inicialmente são contados 5 minutos para ambientação dos mosquitos ao aparelho, pois inserir o inseto diretamente sem um tempo prévio para aclimatação pode alterar as respostas comportamentais frente ao estímulo químico (EIRAS& NETO, 2001) e após o tempo de ambientação é inserida a fonte de odor durante 5 minutos. Todos os bioensaios foram realizados no período noturno a partir das 18:00 horas, bem como todos os bioensaios foram realizados com o fluxo de ar ligado.
Ao final dos 10 minutos mensuraram-se quantos mosquitos foram atraídos pela fonte de odor, considerando-se atrativa quando 60% dos mosquitos desceram para a câmara inferior (área de leitura do teste). Os biensaios são indiscriminates,
pois só objetivaram avaliar a atratividade ou não dos mosquitos e não padrões comportamentais mais refinados como se avalia nos bioensaios discriminantes.
Posteriormente os resultados obtidos foram submetidos a análise estatística pelo pacote de software estatístico BioEstat 5.3 .
2.5.1 INSETOS UTILIZADOS NOS BIOENSAIOS
Todos os mosquitos utilizados para realização dos ensaios foram obtidos através da colônia mantida no insetário do Laboratório de insetos e vetores da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (26ºC, UR 80% e fotoperíodo 12h de claro e 12h de escuro).
Os adultos foram acondicionados em gaiolas de PVC com interior de papel Kraft, alimentados com sacarose a 10%, mel e em camundongos anestesiados. As larvas foram mantidas em bacias plásticas com salina a 0,2% e alimentadas com ração para peixes Tetra Min tropical flakes®.
Os experimentos foram realizados com fêmeas de A. aquasalis 5 à 7 dias após emergirem, mantidas em jejum de 12 à 24 horas antes dos testes, para a alimentação com sacarose não interferir no comportamento de busca pelo hospedeiro.
O projeto foi aprovado pela comissão de ética no uso de animais – CEUA da Universidade Federal do Rio Grande do Norte protocolo nº 023/2013 (Anexo A – Aprovação do CEUA).
2.5.2 TESTES COM 1-OCTEN-3-OL (OCTENOL)
O octenol é utilizado amplamente como cairomônio para atrair insetos hematófagos desde que Hall (1984) o identificou através da expiração de bovino. Recentemente considerado como melhor candidato para utilização em armadilhas iscadas para vigilância de Anopheles, utilizadas para predizer o risco de malária na Guiana Francesa (VEZENEGHO et al., 2013).
Para utilização do octenol em bioensaios primeiramente obtivemos a taxa de volatilização do composto em diferentes volumes. A taxa foi obtida através de testes para calcular a perda média do octenol por hora, a fim de compreendermos como o composto se comportava no ambiente experimental. Dessa maneira podemos avaliar qual o comportamento do inseto frente a taxas de evaporação diferentes. (ANDRADE, 2006).
2.5.2.1 OBTENÇÃO DA TAXA DE VOLATILIZAÇÃO DO OCTENOL
Para a realização dos bioensaios no olfatômetro com octenol mensurou-se a taxa de volatilização do composto em três volumes diferentes 50µl, 100µl e 150µl. Foram utilizados como liberador frascos de vidrode 5 ml com tampas de borracha, as quais foram furadas para receber um pavio de 4 cm, no pavio foi adicionado o octenol puro nos volumes de 50µl, 100µl e 150µl. (VAN ESSEN, 1994) (figura 14). Os três volumes diferentes foram triplicadose pesados a cada hora durante 5 horas e após 24 horas a fim de obtermos as taxas de perda média do octenol por hora.
2.5.2.2 BIOENSAIOS INDISCRIMINANTES COM OCTENOL
Os testes com A. aquasalis foram realizados durante 10 minutos com fêmeas como citado no item 2.5, avaliando três taxas de liberação do octenol 14mg/h, 15mg/h e 18mg/h obtidas como descrito no item 2.5.2.1 com 10 fêmeas para cada concentração, as quais foram triplicadas, totalizando 90 fêmeas avaliadas. Para avaliar se havia relação entre a taxa de volatilização de octenol e o número de A.
2.5.3 BIOENSAIOS INDISCRIMINANTES COM HOSPEDEIROS DISTINTOS
A fim de certificar a eficiência do olfatômetro foram realizados bioensaios indiscriminates com hospedeiros distintos já conhecidos como fontes alimentares A.
aquasalis.
Os testes com animais foram realizados como descrito no item 2.5 com três tipos de hospedeiros distintos: Mus musculus, sexo masculino, adulto; Gallus gallus
domesticus, sem informações sobre o sexo, com aproximadamente 15 dias de vida ; Homo sapiens, pé humano, voluntária do sexo feminino, caucasiana, 23 anos, não
tabagista, não utilizou creme,talcos ou perfumes nos pés antes do teste, não houve lavagem dos pés com sabonetes ou solventes para não retirar ou mascarar o odor característico dos pés, e os pés não estavam suados.
Realizou-se os bioensaios no laboratório com temperatura média de 26ºC e umidade relativa de 80%.Foram utilizadas 10 fêmeas de A. Aquasalis para cada teste, e cada teste teve três repetições,totalizando 90 fêmeas avaliadas.
É importante ressaltar que em nenhum momento dos testes os mosquitos entram em contato direto com os hospedeiros. Para avaliar se havia relação entre os hospedeiros distintos e o número de A. aquasalis atraídos foi realizado o teste de Kruskal-Wallis.
3 RESULTADOS
3.1 CONSULTAS EM BASES DE PATENTES PÚBLICAS
A análise das principais bases de patentes públicas demonstrou que não existem olfatômetros verticais que realizem ensaios discriminantes com fluxo de ar.
Não foram encontrados olfatômetro verticais para insetos anemotáxicos hematófagos; olfatômetros específicos para A aquasalis; olfatômetros para o gênero
Anopheles; e olfatômetros verticais com fluxo de ar para ensaios discriminantes
específicos para mosquitos.
3.2 TESTE DE FUMAÇA
Os testes de fumaça mostraram uma qualidade superior da pluma obtida através de vapor de água nos dois critérios avaliados (tabela 1).
3.3.1 FLUXO DE AR
O fluxo de ar inserido abaixo da câmara inferior do olfatômetro demonstrou gerar dissipação da pluma de odor na câmara superior inteira e turbulência, fazendo com que os compostos voláteis se dissipassem de forma ativa dentro da câmara superior do olfatômetro (tabela 2). Sem o fluxo de ar a pluma de odor chega apenas a 15 cm, ou seja 1/3 do cone superior (figura 15) ficando restrita a base da câmara superior densa e sem turbulência, porém com a inserção do fluxo observamos que a pluma se dissipou dentro do olfatômetro permeando os 40 cm do cone superior de forma dispersa e helicoidal devido a turbulência gerada pelo fluxo de ar (figura 16).
As 3 câmeras demonstraram eficácia em avaliar a estrutura da pluma de odor independente da qualidade obtida nas imagens. A webcam Multilaser® se mostrou ineficiente no parâmetro de avaliação do comportamento dos mosquitos, pois tem uma resolução baixa, apenas aponta ausência ou presença do mosquito, sem detalhar mudanças comportamentais após a exposição do mosquito á fonte de odor. A Sony aplha Nex-C3® se mostrou eficiente em gravar alterações comportamentais dentro do olfatômetro, pois tem alta resolução de imagem, tendo a capacidade de registrar mudanças comportamentais,com ajustes no foco A GoPro Hero 3+® se mostrou superior as outras duas câmeras testadas por apresentar alta resolução de imagem,sendo capaz de registrar mudanças comportamentais com maior qualidade (tabela 3).
3.4.1 TESTES COM 1-OCTEN-3-OL (OCTENOL)
3.4.1.1 PERDA MÉDIA DE OCTENOL POR HORA E APÓS 24 HORAS
Nos resultados para obtenção da perda média de octenol por hora foi observado que as concentrações de 50µl, 100µl e 150µl obtiveram forte correlação entre o tempo decorrido, durante as 5 horas e perda de peso do composto (Figuras 17, 18 e 19).
Todas as concentrações testadas 50µl, 100µl e 150µl permaneceram mantendo comportamento de volatilização após 24 horas de observação do experimento (figuras 20, 21 e 22), porém a concentração de 100µl demonstrou uma correlação mais forte do que as demais, entre o tempo e a perda média do composto com valor de R2 = 0.9969, mantendo um padrão mais linear de volatilização.
3.4.1.2 BIOENSAIOS COM OCTENOL
Os resultados dos bioensaios com 3 diferentes taxa de volatilização de octenol 14mg/h, 15mg/h e 18mg/h demonstraram que a taxa de 15mg/h foi a mais atrativa apresentando 66,6% de média de atratividade, sendo superior a taxa de 14mg/h (33,33%) e de 18mg/h (0%) de média de atratividade (figura 23).
Foi observada uma relação significativa entre a taxa de volatização e o número de mosquitos atraídos (Kruskall Wallis p<0,05) (figura 24).
3.5 BIOENSAIOS COM HOSPEDEIROS DISTINTOS
Não foi observada diferença entre a atrativiade dos hospedeiros testados (Kruskall- Wallis p>0,05). O que foi observado também na frequência relativa de mosquitos atraídos por hospedeiro que apresentou valor igual de 33,33% para todos os hospedeiros (figura 25).
4 DISCUSSÃO
O resultado da pesquisa nos bancos de patentes mundiais mostra a necessi-dade do desenvolvimento de um aparelho de olfatometria vertical considerando as características comportamentais dos insetos anemotáxicos. A otimização de um olfa-tômetro específico para insetos anemotáxicos auxilia a compreender o comporta-mento dos insetos principalmente de importância médica de forma mais precisa, co-mo visto por Batista (2014) ao analisar o comportamento de A darlingi entre odores de indivíduos infectados por P vivax e indivíduos não infectados, o autor cita que o olfatômetro vertical utilizado é apenas para testes comportamentais de curta distân-cia que levam em consideração os fatores temperatura e umidade para obter as res-postas olfativas. Não sendo possível realizar testes comportamentais de longa dis-tância, ou seja, que considerem a anemotaxia do inseto testado.
O olfatômetro vertical com fluxo de ar e sistema de vídeo desenvolvido se di-fere do desenvolvido do para A aegypti pela inserção do fluxo de ar que gera turbu-lência na pluma de odor formada dentro do olfatômetro gerando dispersão da pluma de odor, o que torna a dispersão ativa e não mais passiva como no olfatômetro de Feinsod & Spielman (1979). Os testes de fumaça gerados por ácido acético e hidró-xido de amônia demonstraram que os compostos geram uma fumaça fria e esbran-quiçada, porém intermitente formando uma pluma de odor pouco densa e com baixa dispersão, talvez ideal para ser utilizada em testes no olfatômetro para fêmeas de A.
aegypti que avalia respostas comportamentais a curta distância, utilizando como
fon-te de dispersão apenas a convecção (NETO& EIRAS, 2001).
A pluma formada por vapor de água apresentou fumaça densa esbranquiçada e com alta dispersão, demonstrando ser uma ótima alternativa para avaliação do comportamento de plumas de odor dentro do olfatômetro otimizado, além de se manter constante por determinado período suficiente para ser filmada e avaliada. Pois pluma de vapor de água é gerada por um aparelho de umidificador de ar e não por reações químicas entre compostos interagindo entre si, os quais muitas vezes podem não formar uma boa fumaça dependendo da concentração dos compostos ou da forma que foram manipulados (Moura et al. 1989). A pluma de vapor de água
não é uma prática utilizada na observação da arquitetura da pluma de odor em olfa-tômetros, geralmente observada através de compostos químicos como o tetracloreto de titânio (TiCl4), o qual em contato com o ar gera fumaça bastante densa ideal para observação da pluma de odor, porém extremamente tóxica ao ser inalada. (OMRANI, 2010 ; KAPIAS & GRIFFITHS , 2005).
A pluma de odor gerada pelo umidificador demonstrou ser uma opção atóxica, de baixo custo e de fácil manipulação, podendo ser utilizada sem estruturas comple-xas de renovação de ar como as fumaças geradas por compostos químicos altamen-te tóxicos utilizados, o que é o padrão para padronização de olfatômetros. (OMRANI, 2010)
O fluxo de ar inserido no olfatômetro vertical mostrou-se eficiente em dissipar e gerar turbulência na pluma de odor. A turbulência é importante, pois é responsável por mediar respostas comportamentais de longa distância, permitindo realizar ensai-os que demonstrem a ativação do mensai-osquito e busca pelo hensai-ospedeiro. Diferente das respostas de curta distância que são ativadas apenas por umidade e temperatura geradas por convecção (NETO& EIRAS, 2001), como observamos no olfatômetro para fêmeas de A. aegypti .
Experimentos com A. aegypti em túnel de vento expostos a CO2 demonstram
a influência da estrutura da pluma de odor no comportamento do inseto à procura de hospedeiros. A estrutura da pluma de CO2 turbulenta ou filamentosa apresentou
sig-nificativo aumento na atração dos mosquitos quando comparadas a plumas de odor homegêneas (GEIER; BOSCH; BOECKH, 1999). O olfatômetro vertical ao gerar plumas de odor turbulentas se mostra como opção para avaliar respostas sobre pre-ferências olfativas dos mosquitos quando não há possibilidade de realizar experi-mentos sob condições controladas e com grande estrutura, como os experiexperi-mentos para avaliar respostas olfativas realizados em ambientes de semi campo (LORENZ et al., 2013).
O fluxo de ar demonstrou que aumento do cone superior do olfatômetro para 40 cm a fim de avaliar respostas que não contemplam apenas convecção foi ideal pois a pluma se dissipa por todo cone superior, demonstrando que testes com com-postos voláteis chegariam de forma turbulenta até os mosquitos que estivessem no ápice do cone, porém sem o fluxo de ar a pluma de odor fica restrita apenas a 15 cm
do cone superior, evidenciando a necessidade da implementação do fluxo para gerar turbulência.
Ao avaliar o comportamento de voo de Anopheles em 3D a fim de compreen-der como o mosquito se comporta até encontrar o hospedeiro Spitzen (2013) obser-vou que calor e umidade são elementos importantes no comportamento de busca, porém ao mosquito ser inserido em um sistema com fluxo de ar contrário à direção de voo e com temperatura aquecidao comportamento é intensificado, sugerindo que os mosquitos tem a capacidade de escanear o ambiente em que se encontram du-rante o voo enquanto eles progridem na pluma de odor em busca do hospedeiro. Demonstrando a importância da inserção do fluxo de ar no olfatômetro para realiza-ção de ensaios comportamentais com insetos vetores.
A inserção da câmera proporciona a realização de bioensaios discriminantes o que não era possível no olfatômetro de Feinsod & Spielman. Os testes com siste-ma de vídeo para tornar o olfatômetro vertical apto para bioensaios discriminantes demonstrou que câmeras de baixa resolução como a Webcam Multilaser® são ca-pazes de registrar a ausência ou presença de turbulência na pluma de odor formada por vapor de água, porém com menor qualidade de imagem do que as outras duas testadas mas não foi eficiente em observar mudanças comportamentais nos insetos, o que é essencial para tornar o olfatômetro vertical apto para ensaios discriminantes, pois por ser constituído de alumínio não permite a visualização do comportamento do mosquito até a fonte de odor como no olfatômetro horizontal confeccionado em acrílico por Geier (1999) .
As outras duas câmeras testadas Sony aplha Nex-C3® e Gopro Hero 3+® demonstraram capacidade superior na qualidade das imagens, permitindo registrar com clareza o comportamento da pluma de odor e o comportamento dos mosquitos dentro da câmara superior do olfatômetro. Porém a Gopro Hero 3+® demonstrou ser a melhor candidata a ser implementada no olfatômetro, devido seu tamanho reduzi-do o qual permite a inserção de duas câmeras no cone superior, uma no ápice e ou-tra na base com a finalidade de não haver pontos cegos dentro do olfatômetro.
A Gopro Hero 3+® pode ser inserida diretamente no olfatômetro sem ajuda de suportes para segurar a câmera apenas encaixando a lente no orifício do cone supe-rior do olfatômetro, já da Sony alpha Nex-C3® por ter a lente maior do que o orifício
do cone superior ficou apenas encaixada sobre ele, necessitando de ajuste do fo-co ,o que torna a Gopro Hero 3+® uma opção mais interessante para implementa-ção de um sistema de vídeo no olfatômetro .
A implementação de câmeras ao olfatômetro vertical tem como objetivo inicial torná-lo apto para ensaios discriminantes, permitindo observar o comportamento dos mosquitos até a fonte de odor, dessa forma além de mensurar a quantidade de mos-quitos atraídos por determinado composto é possível avaliar se os mosmos-quitos de-monstram mudanças comportamentais sem efetivamente descer para área de leitu-ra ,configuleitu-rando apenas ativação e não atleitu-ração pelo composto (PINTO et al., 2012). A inserção de uma câmara ao aparelho abre um leque de opções para estudos que podem ser executados no olfatômetro quando o sistema de vídeo é utilizado junto a softwares de análises comportamentais permite avaliações refinadas do comporta-mento de vetores como nos estudos realizados por Sutcliffe ( 2015) e Sptizen (2013).
A utilização do cairomônio octenol sozinho como atrativo para Anopheles não são descritos na literatura, geralmente o composto é utilizado combinado com outros cairomônios agindo de forma sinérgica (LIMA et al., 2014). Porém estudos realizados na Guiana Francesa comparando aramadilhas iscadas apenas com octenol, arama-dilhas iscadas com LurexTM (mistura de compostos sintéticos vendidas comercial-mente) e atração humana demonstraram que a armadilha iscada apenas com octe-nol foi capaz de capturar Anopheles em maior riqueza e abundância do que a arma-dilha iscada com LurexTM, apresentando uma eficiente alternativa para ser utilizada na vigilância entomológica de Anopheles (VEZENEGHO et al., 2014).
A realização de ensaios comportamentais em laboratório com olfatometria an-tecedem trabalho em campo economizando tempo e dinheiro dos pesquisadores, podendo avaliar previamente qual taxa de volatilização do composto é mais indicada para ser implementada a armadilha iscada. Dessa forma podemos considerar que o volume de 100µl se comportou como um bom liberador, pois permite a taxa de libe-ração constante do composto enquanto ele durar, podendo permanecer em campo por um longo período sem mudar suas características (ANDRADE, 2006).
A atratividade da taxa 15 mg/h para mosquitos do gênero Anopheles foi ob-servada também em campo por Gama et. al. (2007) em um trabalho realizado em em Brejo do Mutambal, Município de Varzelândia (MG) avaliando armadilhas
lumino-sas do tipo HP iscadas com diferentes taxas de liberação do octenol, com taxas de volatilização previamente obtidas em laboratório, a taxa de 15mg/h mostrou-se mais eficiente na coleta de Anopheles na área da mata do que as taxas de 0,5 mg/h, 5 mg/h e 30 mg/h, Demonstrando ser uma boa taxa para ser utilizada em campo em armadilhas iscadas para coleta de Anopheles e para realização de bioensaios dis-criminantes no olfatômetro.
O estudo em olfatômetros com insetos hematófagos pode também realizar o caminho inverso ,capturando animais de campo com armadilhas já padronizadas, para realizar experimentos afim de elucidar questões sobre o comportamento de in-setos vetores de difícil colonização. Como o estudo realizado por Pinto et. al. (2012) que utilizou armadilhas luminosas do tipo CDC para capturar Nyssomyia neivai em campo e após a captura realizar testes comportamentais em túnel de vento aferindo as preferências olfativas do vetor da leishmaniose cutânea.
Nos bioensaios indiscriminantes com hospedeiros distintos observamos as mesmas médias de atratividade para os hospedeiros o que evidencia seu hábito ali-mentar variável, dependente do ambiente e população como já visto por Flores-Mendoza (1996). O valor de atratividade abaixo de 50% não é considerado atrativo para testes comportamentais de olfatometria (EIRA & NETO, 2001), é necessário a realização de bioensaios indiscriminantes como outros hospedeiros distintos, para realização de bioensaios discriminantes com hospedeiros com valores de atrativida-de acima atrativida-de 50% para que possamos analisar atrativida-de forma atrativida-detalhada o comportamento de A. aquasalis em busca pelo hospedeiro.
Porém pressupõe-se que mosquitos do gênero Anopheles apresentem baixa resposta a atrratividade em olfatômetros como já visto por BATISTA (2014) e SAN-TOS (informação pessoal)1 realizando experimentos testando a atratividade de fê-meas de A. darlingi em diferentes voluntários humanos, utilizando o olfatômetro para fêmeas de A. Aegypti., obteve taxas de atração de aproximadamente 30%. O que
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SANTOS , T. C. D. - Dados não publicados da sua dissertação de mestrado. Mestrado em Biologia experimental – Universidade de Rondônia , 2015.
