4.4 Procedimento experimental
4.4.1 Busca de um bom conjunto DNA-microesfera para re-
Após colocar a amostra no microscópio, devemos procurar um bom con- junto DNA-microesfera para realizar as medidas. A Fig. 4.5a representa as diversas situações possíveis encontradas na amostra: microesferas grudadas na lâmina, microesferas grudadas em DNAs soltos em solução, DNAs gruda- dos na lâmina mas sem microesferas, DNAs soltos em solução e etc. Devemos procurar um conjunto onde uma das pontas do DNA esteja grudada na lâ- mina e a outra ponta numa microesfera. Como não visualizamos o DNA com o microscópio óptico, esta procura é indireta. O procedimento usado é o seguinte:
1) Procuramos uma esfera de poliestireno que não esteja grudada na lâ- mina e a prendemos com a pinça óptica.
2) Movimentando a lamínula com os deslocadores do microscópio, ob- servamos se a esfera escapa da pinça e volta à sua posição inicial quando deslocamos suficientemente a lamínula.
3) Caso isto aconteça, significa que existe uma molécula de DNA pren- dendo a esfera na lamínula, situação que desejamos.
4) Para verificar se existe somente uma molécula de DNA prendendo a esfera, deslocamos esta em diferentes direções, observando se acontece o mesmo do item (2). Devemos observar o perfil circular do deslocamento da esfera, isto é, o deslocamento máximo da molécula antes da esfera soltar da pinça em relação à posição de equilíbrio deve ser o mesmo para qualquer direção (ver Fig. 4.5b). Este procedimento não garante a existência de um único DNA ligando a microesfera à lamínula, mas é um forte indício de que isto seja verdade.
4.4.2 Medida do perfil de retroespalhamento das micro-
esferas
Esta medida é feita de maneira idêntica à descrita na seção 2.2.3 e serve para caracterizar a pinça óptica e o feixe espalhado pela microesfera (laser He-
Figura 4.5: (a) Diversas configurações possíveis encontradas na amostra. (b) Método usado para identificar um bom conjunto DNA-microesfera. Observe o perfil circular: o deslocamento máximo deve ser o mesmo em todas as direções. Os tamanhos da esfera de poliestireno e do DNA estão fora de escala para melhor entendimento da figura.
Ne). Neste caso, no entanto, fazemos o ajuste da curva por uma gaussiana∗, com a finalidade de extrair os parâmetros característicos do feixe espalhado. Conforme discutido no Capítulo 2, medimos a intensidade retroespalhada pela microesfera em função do tempo. Primeiramente, transformamos o eixo dos tempos em posição. Para isso, filmamos com a câmera CCD o movimento da microesfera enquanto movemos a pinça óptica em relação ao feixe de He- Ne. Dessa forma, determinamos a posição inicial e final da microesfera, e como temos do gráfico o intervalo de tempo total deste movimento, acha- mos a velocidade de movimento desta. Com esta velocidade, convertemos facilmente o eixo dos tempos em posição.
A seguir, fazemos o ajuste do gráfico com uma função gaussiana usando para isso o programa Kaleida Graph. A Fig. 4.6 mostra um típico ajuste obtido com este procedimento. A forma da gaussiana usada é
I = I0exp −(x − ¯x)2 2σ2 , (4.3)
e do ajuste determinamos o valor médio ¯x, o desvio padrão σ e a intensi- ∗Na realidade, o perfil de retroespalhamento não precisa ser necessariamente gaussi- ano. Conforme comentamos no Capítulo 2, este perfil é apenas uma calibração, que no caso das medidas com DNA é útil para relacionarmos a posição x da microesfera com a intensidade retroespalhada por esta em cada ponto. Em praticamente todas as nossas me- didas, entretanto, procuramos alinhar o laser de He-Ne o detector de fótons para obter um perfil de retroespalhamento gaussiano, pois este pode ser ajustado com grande facilidade.
dade máxima I0. Estes parâmetros serão importantes na análise do perfil de estiramento, que discutiremos a seguir.
Figura 4.6: Perfil típico de retroespalhamento mostrando a intensidade (em
unidades arbitrárias) como função da posição da microesfera. Ajustando esta curva com Eq. 4.3, determinamos os parâmetros I0, ¯x e σ.
4.4.3 Medida da constante de força da pinça óptica
Outro parâmetro que precisamos medir é a constante de força da pinça óptica. O procedimento usado é o mesmo descrito nas seções 2.3.4 e 2.3.6. Uma observação importante é que, em todas as medidas com DNA, não variamos a altura da microesfera de poliestireno em relação à lamínula. O valor da constante de força da pinça óptica será utilizado posteriormente na análise do perfil de estiramento da molécula de DNA.
4.4.4 Medida do perfil de estiramento da molécula de
DNA
O perfil de estiramento nada mais é do que uma medida da intensidade retroespalhada pela microesfera enquanto esticamos a molécula de DNA com uma velocidade controlada. Para tanto movimentamos o estágio do micros- cópio, e consequentemente a lamínula, com velocidade constante. A Fig. 4.7
mostra a geometria do experimento. A altura h da microesfera é mantida
fixa∗ em 3,5 µm enquanto deslocamos o estágio do microscópio com veloci-
dade constante (v = 0,058 µm/s), usando para isto o deslocador piezo, que possui precisão nanométrica. A força que o DNA exerce sobre a microesfera é em módulo igual a força que a pinça óptica exerce sobre a mesma, pois o experimento é realizado no regime quase-estático.
Figura 4.7: Geometria do experimento de estiramento da molécula de DNA.
A altura h da microesfera é mantida fixa em 3,5 µm enquanto deslocamos o estágio do microscópio com velocidade constante (v = 0,058 µm/s). A força que o DNA exerce sobre a microesfera é em módulo igual a força que a pinça óptica exerce sobre a mesma, pois o experimento é realizado no regime quase- estático.
Em todos os experimentos, a velocidade usada foi de 0,058 µm/s. Esta velocidade é baixa o suficiente para garantir que a microesfera passa por es- tados de equilíbrio e para garantir que a força de Stokes sobre a microesfera é desprezível. Como a microesfera está presa na pinça óptica, uma das ex- ∗A altura é medida antes de iniciarmos o movimento da lamínula. Para o nosso ex- perimento, o ângulo θ da Fig. 4.7 é pequeno, e portanto a componente-z da força que o DNA exerce sobre a microesfera é pequena se comparada à componente-x. Desta forma, a altura da microesfera não varia significativamente durante a medida do perfil de estira- mento. Isto é comprovado experimentalmente observando que a imagem da microesfera no monitor não sofre variações devido a mudanças em h.
tremidades do DNA fica fixa, enquanto a outra, ligada à lamínula, é puxada com velocidade constante. Dessa forma, a molécula de DNA é esticada até que a microesfera escape do poço de potencial da pinça óptica. Coletando a intensidade retroespalhada pela mesma durante este procedimento em função do tempo, obtemos o perfil de estiramento. O eixo dos tempos é facilmente convertido no estiramento da molécula de DNA ao longo da direção paralela à lamínula (xDN A) usando a velocidade do motor. A Fig. 4.8 mostra um típico perfil de estiramento obtido com este procedimento.
Figura 4.8: Típico perfil de estiramento da molécula de DNA, mostrando a
intensidade (normalizada) em função do estiramento xDN A da molécula.
4.4.5 Determinação da curva de força × extensão da
molécula de DNA
A partir da medida do perfil de estiramento, podemos obter a curva de força × extensão para a molécula de DNA. Para tanto, devemos converter a intensidade retroespalhada em força, pois o tempo já foi convertido na extensão da molécula (ao longo do eixo x) usando a velocidade do motor, como explicado na seção anterior.
A intensidade retroespalhada pode ser convertida facilmente na força exercida pelo DNA usando as características da pinça óptica, determina- das pelo perfil de retroespalhamento e pela medida da constante de força. Primeiramente, invertemos a Eq. 4.3 para escrever a posição x em função da intensidade I∗. Dessa forma, determinamos a posição da microesfera em cada instante no perfil de estiramento. Determinamos então a posição inicial x0 (correspondente à intensidade inicial no perfil de estiramento), e a variação de posição para cada ponto, dada por
∆x = x− x0. (4.4)
Finalmente, a força na direção x é determinada multiplicando-se a varia- ção de posição pela constante de força da pinça óptica,
Fx = κ∆x. (4.5)
Note que estamos denotando por x a posição do centro da microesfera no
poço de potencial, e por xDN A o estiramento da molécula de DNA.
Observe que esta é a força que a pinça óptica exerce sobre a microes- fera quando esta é afastada da posição de equilíbrio do poço de potencial. No entanto, conforme discutimos, esta é igual, em módulo, à força exercida pela molécula de DNA para afastar a microesfera da posição de equilíbrio do poço de potencial da pinça, visto que o experimento é realizado em re- gime quase-estático, com uma velocidade de deslocamento da lamínula muito baixa. Dessa forma, obtemos uma curva que mostra a força em função da extensão para a molécula de DNA. A Fig. 4.9 mostra uma típica curva ob- tida com este procedimento. Esta curva é ajustada usando-se a expressão de Marko e Siggia [21], e do ajuste determinamos o comprimento de contorno L e o comprimento de persistência A da molécula.
Na realidade, como estamos trabalhando experimentalmente na direção x, é mais conveniente usar a componente x da Eq. 3.36 para fazer o ajuste. Esta componente é facilmente determinada conhecendo-se a altura fixa da ∗Esta é uma outra razão para escolhermos um perfil de retroespalhamento gaussiano, visto que este tipo de curva pode ser invertido com facilidade. A função inversa é um logaritmo, que possui variação lenta. Desta forma, o erro estimado neste processo de inversão é muito pequeno, situando-se dentro da barra de erro experimental.
microesfera em relação à lamínula, que no nosso caso é h = 3,5 µm. Na Fig. 4.7, observe que a extensão total do DNA é z = px2
DN A+ h2 e Fx = F cos θ = F (xDN A/z). Fazendo estas considerações na Eq. 3.36, a expressão final da componente x da força é Fx = kBT A p x2 DN A+ h2 L + 1 4 1− √ x2 DN A+h2 L 2 − 14 xDN A p x2 DN A+ h2 . (4.6)
Figura 4.9: Típica curva de força (componente x) × extensão da molécula
de DNA. Ajustando esta curva com a Eq. 4.6, determinamos o comprimento de contorno L e o comprimento de persistência A da molécula. Neste caso particular, obtivemos do ajuste L = 15,5 µm e A = 49,9 nm.
Para a molécula de λ-DNA pura, na ausência de fármacos, obtemos com este procedimento os valores médios L = (16,5 ± 1) µm e A = (50 ± 3) nm, obtidos através de uma média para cerca de 20 moléculas de DNA dife- rentes. Estes resultados estão em excelente acordo com dados reportados na literatura [17,27,63,70].