Formas alternativas: superestiramento e supertorção

O DNA pode apresentar-se em formas diferentes quando submetido a uma grande força de estiramento ou a um torque de rotação em torno do seu eixo.

Figura 3.5: Comparação entre as três formas de DNA: A, B e Z.

Estas situações levam, respectivamente, às chamadas formas superestirada (overstretched) e supertorcida (overwound).

Superestiramento

A Fig. 3.6 mostra o típico comportamento da força em função da extensão para um experimento de estiramento da molécula, semelhante aos realizados neste trabalho, que apresentaremos nos Capítulos 4 e 5. Observe que, quando a força atinge a faixa dos 60 pN, a curva apresenta um platô, e a força per- manece praticamente constante durante um certo intervalo onde a molécula continua sendo esticada. Este comportamento indica que, neste intervalo, a molécula pode ser alongada com uma força adicional muito pequena.

Nesta região está ocorrendo uma transição estrutural na molécula de DNA, conhecida como transição de superestiramento (overstretch transition). A transição dura até o DNA atingir aproximadamente 1,7 vezes o seu com- primento de contorno na forma B [39]. Alguns autores atribuem como causa desta transição a fusão do DNA, ou seja, a separação das fitas para aquela região de forças [40,41]. O valor exato da força onde a transição tem início depende do pH da solução. Para pH = 6,0, a transição começa em 67 pN e para pH = 3,1, começa em 47 pN [39], por exemplo.

Figura 3.6: Curva de força em função da extensão para uma molécula de

DNA. Observe que no regime de grandes forças (_{∼ 60 pN) a curva apresenta}

um platô, onde ocorre a transição de superestiramento [39].

tipo de transição, pois nossa pinça óptica não tem potência suficiente para exercer forças da magnitude de 60 pN. De fato, as forças máximas que atingi- mos nos nossos experimentos estão na faixa dos 5 pN, conforme discutiremos nos Capítulos 4 e 5.

Supertorção

Até aqui consideramos o DNA como uma molécula linear, que pode fa- cilmente ser colocada na forma retilínea caso as duas pontas sejam suficien- temente afastadas. Em alguns casos, entretanto, as duas pontas da molécula podem estar ligadas covalentemente, formando uma estrutura circular. Os plasmídeos são moléculas circulares de DNA que estão separadas do DNA cromossômico. Geralmente ocorrem em bactérias e por vezes também em organismos eucarióticos. Outros exemplos onde ocorrem DNA na forma cir- cular são nas mitocôndrias, nos cloroplastos e em alguns tipos de vírus e bacteriófagos.

Em DNAs circulares é relativamente fácil gerar um tipo de conformação tridimensional chamada de supertorcida, superenrolada ou super-hélice. Esta

estrutura é definida como o enrolamento da dupla hélice sobre si mesma. Em- bora seja mais comum em DNAs circulares, as super-hélices também podem ser geradas em DNAs lineares desde que as duas extremidades da molécula es- tejam fixas. Atualmente sabemos que este tipo de estrutura é extremamente importante para a funcionalidade da molécula. De fato, o grau de superen- rolamento é importante em processos como a replicação e a transcrição. Na célula, o grau de superenrolamento é controlado e modificado por enzimas conhecidas como topoisomerases. O superenrolamento pode ser basicamente de dois tipos: plectonêmico e toroidal. O primeiro tipo, mais comum, ocorre quando o DNA encontra-se em solução. O segundo tipo ocorre com o DNA enrolado em proteínas, como as histonas, para formar os nucleossomos, as- sumindo assim a forma de um toróide. A Fig. 3.7 mostra as estruturas conhecidas como plectonemas, geradas devido ao superenrolamento numa molécula de DNA circular.

Figura 3.7: Formação das estruturas conhecidas como plectonemas numa

molécula de DNA circular, devido ao superenrolamento.

Estruturas de super-hélices são bastante estudadas no ramo da Matemá- tica conhecido como topologia. A maneira mais simples de gerar este tipo de estrutura é girar a molécula de DNA em torno do seu próprio eixo. A rotação pode ocorrer no sentido do giro da dupla hélice (superenrolamento positivo) ou no sentido contrário (superenrolamento negativo), sendo o segundo tipo mais comum na natureza.

Strick e colaboradores [42,43] realizaram experimentos onde geraram es- truturas de super-hélice usando uma pinça magnética para manipular e girar moléculas de DNA em torno de seu próprio eixo. Para tanto, utilizaram microesferas feitas de material magnético no lugar do poliestireno. Estudos semelhantes também foram realizados recentemente por Gore et al. [44]. Uma pinça óptica convencional, do tipo usada em nosso trabalho, não pode ser

usada para estes tipos de estudo, onde estamos interessados em aplicar tor- ques e girar a molécula de DNA em torno de seu próprio eixo. Isto acontece porque as microesferas empregadas possuem perfeita simetria e portanto não podem ser giradas por feixes de laser comuns, sem momento angular. Por outro lado, não podemos empregar neste caso microesferas de material mag- nético, pois uma pinça óptica não será capaz de aprisioná-la, uma vez que materiais magnéticos tendem a absorver grande parte da potência da luz in- cidente. Um trabalho interessante e recente, onde esta dificuldade foi contor- nada, foi realizado por Oroszi et al. em 2006 [45]. Neste trabalho, os autores usam uma prensa para transformar as microesferas de poliestireno em discos, quebrando assim a perfeita simetria do objeto. Com este procedimento, os autores mostraram que é possível girar estes discos, e consequentemente a molécula de DNA ligada a eles, simplesmente girando o plano de polarização do laser da pinça óptica.

3.1.5 O DNA do fago λ

Em nossos experimentos, o DNA usado é o do fago λ, um vírus que infecta a bactéria E. coli. Este DNA é ideal para os experimentos de estiramento, devido ao seu tamanho. Uma molécula de λ-DNA possui aproximadamente 48.500 pares de base, o que resulta em um comprimento de contorno médio de 16,5 µm. Para efeito de comparação, o DNA humano possui da ordem de 3,4 bilhões de pares de base, com um comprimento de contorno médio da ordem de 1 m.

Conforme discutiremos no Capítulo 4, é relativamente fácil encontrar mo- léculas de λ-DNA com valores do comprimento de contorno até 30% maiores ou menores que este valor médio. Acreditamos que uma das causas disto seja a variabilidade genética dos organismos, conforme comentado na seção 3.1.3. Este fato será discutido em maiores detalhes no Capítulo 4.