Células inflamatórias e fibroblastos

A análise histológica foi quantificada com o microscópio Zeiss (modelo Axiostar plus 1169-151, Alemanha). Uma magnificação de 400X foi usada no estudo na região da lesão. Imagens individuais demonstraram que a lesão foi capturada em todos os coelhos. Na análise histológica a lesão foi definida pela área de epitélio desnudo em 3 dias ou um epitélio fino em 7 dias com presença de reação inflamatória e processo cicatricial. Um único patologista de maneira cega realizou a contagem das células da reação inflamatória e dos colágenos. Três a cinco campos de cada peça histológica que continha a lesão foram analisados por coelho. Para a contagem das células inflamatórias foi usada uma ocular com retículo que apresentava 50 linhas horizontais que ligavam cem pontos. Foram contabilizadas as células associadas à inflamação e ao remodelamento da mucosa (linfócitos, neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, fibroblastos e plasmócitos). O valor foi expresso em densidade numérica, que representa a porcentagem de freqüência relativa destas células (número de células em 62.500μm2

), em cada campo, com aumento de 400X de aumento da lesão (Das et al., 2007; Mallik et al., 2007) (Figura 7).

Material e método 33

Figura 7 - Imagem do retículo utilizado para quantificação das células inflamatórias.

4.5.2 Fibras colágenas

A quantificação das fibras colágenas foi feita por meio de um sistema digital de imagens com auxílio do software Image Pro Plus versão 4.5.0.29 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, EUA), instalado em um microcomputador ligado a uma câmera digital (JVC, TK- C1380 Color Vídeo Camara, Victor Company of Japan Limited, Japão) acoplado a um microscópio óptico (Leica DMR, Leica Microsystems, Wetzlar GmbH, Alemanha) que pode ser usado com sistema de polarização. Neste sistema de captura de imagens, a câmera estava configurada para capturar as imagens de maior birrefringência e calculá-las em micrômetros quadrados. A concentração de fibras colágenas foi determinada pela quantidade de fibras colágenas de maior birrefringência por unidade de área medida (área de fibras colágenas dividida pela área total x100).

Material e método 34

As medidas morfométricas da inflamação e do colágeno foram transferidas para o programa SPSS 14.0 (Statistical Package for Social Scienses, Chicago, IL) para análise estatística.

4.6 Análise estatística

Para avaliação estatística da reação inflamatória e do colágeno utilizou-se o teste não paramétrico de Mann-Whitney, com o intuito de verificar possíveis diferenças entre ambos os tempos considerados. O teste não paramétrico de Wilcoxon foi aplicado para avaliar possíveis diferenças entre os grupos, intervenção e controle. A significância estatística foi definida como p<0,05.

Resultados 36

5.1 Reação inflamatória

As figuras 8 (A e B) e 9 (A e B) mostram a reação inflamatória na lesão das pregas vocais no terceiro e sétimo dia do controle e da intervenção (corticosteróide), lâminas coradas com hematoxilina-eosina.

(A)

(B)

Figura 8 – Reação inflamatória na lesão da prega vocal após o 30 dia (A) controle, HE (400X); (B) intervenção com corticosteróide, HE (400X) (HE = hematoxilina-eosina)

Resultados 37

(A)

(B)

Figura 9 – Reação inflamatória na lesão da prega vocal após o 70 dia: (A) controle, HE (400X); (B) intervenção com corticosteróide, HE (400X). (HE = hematoxilina-eosina)

Resultados 38

Com relação à reação inflamatória os resultados foram apresentados em forma de média de reação inflamatória (MRI):

1) MRI1: A média geral da densidade numérica de todas as células em relação à intervenção foi 3,16±1,12células/μm2

no grupo com corticóide e 2,48±0,98 células/μm2

no grupo controle, e não foi observada diferença significativa (p=0,099) (Tabela 1).

Tabela 1 - Média da densidade numérica de todas as células (MRI1) em relação à

intervenção (corticóide x controle)

Mínimo Máximo Mediana Par de variáveis n Média da densidade numérica de todas células inflamatórias (células/μm2) Desvio-padrão (células/μm2) (células/μm2₎ Significância (p) corticóide 12 3,16 1,12 1,52 4,83 3,10 controle 12 2,48 0,98 1,18 4,63 2,17 0,099 n = quantidade de coelhos

2) MRI2: A média da densidade numérica de cada célula (linfócitos, neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, fibroblastos e plasmócitos) em relação à intervenção pode ser vista no Gráfico 1 (Anexo 1). Não houve diferença significativa para nenhum parâmetro entre os grupos corticóide e controle.

Resultados 39

Gráfico 1 - Média da densidade numérica de cada célula (MRI2) (linfócitos, neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, fibroblastos e plasmócitos) em relação à intervenção (corticóide x controle). (p = significância)

3) MRI3: Média geral da densidade numérica de todas as células em função do tempo (3 e 7 dias) e da intervenção também foi semelhante entre os grupos corticóide e controle (Gráfico 2) (Anexos 2 e 3).

Resultados 40

Gráfico 2 - Média geral da densidade numérica de todas as células (MRI3) em função do tempo (3 e 7 dias) e da intervenção (corticóide x controle). (p = significância)

5.2 Fibras colágenas

A média do total de área analisada no estudo, para cada prega vocal, foi de 48.478µm2 para o grupo das pregas com corticóide e de 47.609µm2 para o grupo controle, não havendo diferença significativa entre as mesmas (p=0,386) (Tabela 2).

Resultados 41

Tabela 2 - Média da área total analisada versus intervenção.

Par de variáveis n Média da área total analisada (µm2) Desvio- padrão (µm2) Mínimo (µm2) Máximo (µm2) Significância (p) Colágeno corticóide 12 48.478 11.210 17.151 53.780 Colágeno controle 12 47.609 6.048 34.302 53.780 0,386 n = quantidade de coelhos

A concentração das fibras colágenas de cada prega vocal foi calculada em micrometros quadrados (área de colágeno medida dividida pela área total x100) (Gráfico 3) (Anexo 4).

Resultados 42

Gráfico 3 - Média da área do colágeno, em valores porcentuais, medido do controle e da intervenção em 3 e 7 dias.

A concentração das fibras colágenas aumentou significativamente em 7 dias, tanto nas pregas vocais que receberam corticóides quanto nas pregas vocais que não receberam medicamento. (p=0,037) (Tabela 3 e Figuras 10A e B).

Tabela 3 - Média da medida do colágeno em função do tempo.

Par de variáveis dia n

Média da medida de colágeno (%) Desvio-padrão (%) Significância (p) 3 6 0,02 0,02 Colágeno corticóide 7 6 0,35 0,26 0,037 3 6 0,31 0,36 Colágeno controle 7 6 0,80 0,31 0,037 n = quantidade de coelhos

Resultados 43

(A)

(B)

Resultados 44

Quanto à deposição de colágeno, a média da área em porcentagem do colágeno total das pregas vocais (para 12 coelhos aos 3 e 7 dias da cirurgia) com injeção de corticóide foi de 0,18 (Área de colágeno medida: 86,231µm2 dividida pela área total considerada: 48.478µm2 x100), enquanto no grupo controle foi de 0,57 (Área de colágeno medida: 273,668µm2 dividida pela área total considerada: 47.609µm2 x100).

Essa comparação foi estatisticamente significante com o valor de p igual a 0,002, demonstrando que a intervenção medicamentosa (corticóide) promoveu a redução da quantidade de colágeno durante a cicatrização (Tabela 4).

Tabela 4 – Média da área do colágeno total em relação à intervenção (3 e 7 dias). Par de Variáveis n Média da área medida de colágeno (%) Desvio- padrão (%) Mínimo (%) Máximo (%) Significância (p) Colágeno corticóide 12 0,18 0,25 0,001 0,69 Colágeno controle 12 0,57 0,41 0,01 1,06 0,002 n = quantidade de coelhos

A deposição de colágeno no grupo com corticóide foi estatisticamente menor em 3 dias e permaneceu menor em 7 dias após a lesão cirúrgica (Gráfico 4) (Anexos 5 e 6).

Resultados 45

Gráfico 4 - Média da área do colágeno aos 3 e 7 dias em relação à intervenção. (p = significância)

Discussão 47

Por causa das dificuldades de estudar as características fisiopatológicas das pregas vocais em humanos, as pesquisas necessitam utilizar modelos animais com frequência. Um dos modelos animais mais utilizados é o coelho (Hirano et al., 2004, Rousseau et al., 2004a; Branski et al., 2005) pois, embora este não seja um modelo perfeito, a sua prega vocal apresenta estrutura complexa, semelhante à encontrada na prega vocal humana (Valente et al., 2005).

A fibrose na prega vocal é causada por lesão e inflamação. Procedimentos fono-cirúrgicos inapropriados causam cicatriz fibrosa na prega vocal com facilidade. Essa cicatriz desorganiza a lâmina própria da mucosa da prega vocal e modifica as propriedades biomecânicas das pregas vocais com aumento da resistência viscoelástica da mucosa. Isso reduz a vibração das pregas vocais e causa disfonia, geralmente, difícil de ser tratada (Hirano, 2005).

Atualmente, nenhum método terapêutico pode ser considerado efetivo no tratamento ou prevenção da cicatriz fibrótica (Hirano et al., 2004). Injeção de corticosteróides é um dos métodos mais utilizados e está associado com a diminuição da rigidez, melhora do fechamento glótico e da qualidade vocal, conforme os resultados de Bouchayer e Cornut(1998),e Mortensen e Woo (2006), porém algum grau de fibrose sempre permanece. Além da injeção de esteróides, outras substâncias têm sido utilizadas com intuito preventivo, como a mitomicina C, porém, no estudo de Garret et al. (2001), não demonstrou benefício na prevenção de fibrose. No estudo de Socher (2009), no entanto, houve menor deposição de colágeno até 90 dias após a

Discussão 48

cirurgia de enxertia de gordura nas pregas vocais que receberam mitomicina C. Mais recentemente, alguns resultados encorajadores foram descritos com a injeção de fator do crescimento hepatócito que apresenta atividade antifibrótica potente (Hirano et al., 2004).

Vários outros materiais injetáveis têm sido também testados para flexibilizar a prega vocal já cicatrizada como o colágeno bovino (Ford, Bless, 1987), colágeno autólogo (Ford et al., 1995) e gordura autóloga (Brandenburg et al., 1992). No entanto, nenhum desses materiais é capaz de restaurar as alterações fibróticas da lâmina própria e conseguir uma viscoelasticidade ideal idêntica à da prega vocal normal.

A injeção local de corticosteróide é eficaz para atingir concentração elevada em apenas um órgão alvo, como na laringe, com menor ocorrência de efeitos adversos, pois são rapidamente inativados após a absorção, de modo que só metabólitos inativos passam à corrente circulatória (Wannmacher, Ferreira, 1998). Para administração local injetável, utilizam-se, de preferência, corticóides de longa ação, como triancinolona, acetato de metilprednisolona e dexametasona. A triancinolona é largamente utilizada para infiltrações intra-articulares em ortopedia, e seus efeitos e segurança têm sido confirmados (Boehnke et al., 1994; Caldwell, 1996). Bouchayer e Cornut(1998)utilizaram hidrocortisona injetável na prega vocal que pode diminuir os sinais inflamatórios presentes, mas por causa de sua meia-vida curta, provavelmente, interfere menos na cicatrização. Teoricamente, para prevenir formação de tecido fibroso, os corticosteróides de longa duração seriam mais eficazes, o que nos fez optar pela injeção de dexametasona, que além de apresentar alta potência e longa duração tem baixo custo.

Discussão 49

Como referido anteriormente, o tratamento da fibrose da prega vocal é muito limitado e algumas pesquisas têm sido feitas no intuito de prevenir sua formação. Muitos fonocirurgiões utilizam esteróides injetáveis na lesão cirúrgica da prega vocal por causa de seus efeitos na cicatrização (Bouchayer, Cornut, 1998; Mortensen, Woo, 2006). Eles afetam a síntese e maturação do colágeno, alteram a força de tensão nas feridas, inibem a função do fibroblasto e deprimem a ação antibacteriana e fagocitária de algumas células de defesa, resultando na alteração do padrão e retardo da cicatrização das feridas (Kloth, McCulloch, 1998). Seu efeito é mais marcante durante os primeiros quatro dias após a lesão. Após esse período, eles têm pouco efeito, exceto para inibir a resistência normal à infecção (Piccinato et al., 2002). Segundo os estudos de Branski et al. (2005) e de Tateya et al. (2006), o processo cicatricial agudo representa o período crítico no qual uma intervenção terapêutica pode diminuir a rigidez da cicatriz da prega vocal, pois as células inflamatórias e os fibroblastos começam a sintetizar os componentes da matriz extracelular a partir do segundo e terceiro dias após a lesão. Assim, se o objetivo é a prevenção da formação da fibrose, o momento ideal da aplicação de um corticosteróide de longa duração é no início do processo inflamatório, ou seja, ao final da cirurgia. Foi com o intuito de avaliar a possibilidade de modular o processo de cicatrização que escolhemos a fase inicial do processo cicatricial para a injeção do corticosteróide nesse estudo. A decisão de avaliar o processo de cicatrização no terceiro dia foi baseada na descrição de Branski et al. (2005) que demonstraram que nesse período ocorre uma maciça proliferação de células inflamatórias e fibroblastos em torno de uma ferida cirúrgica realizada na prega vocal. A deposição de colágeno novo se inicia em torno do quinto dia, e nesse momento, os fibroblastos são as células predominantes. No sétimo dia,

Discussão 50

um colágeno mais maduro já pode ser notado (Leibovich, 1975). Também no estudo de Tateya et al. (2006) foi demonstrado que os componentes da matriz extracelular como o ácido hialurônico, o colágeno e a fibronectina são produzidos logo após uma incisão cirúrgica na prega vocal. Eles são mais proeminentes entre o terceiro e quinto dia. Os autores concluem que esse pode ser o período mais importante em pesquisa terapêutica feita com o objetivo de prevenir cicatriz fibrosa após lesão da prega vocal.

Coleman et al. (1999) avaliaram os efeitos da triancinolona injetada em pregas vocais de cães após realização de um microflap lateral (lesão cirúrgica). O mesmo tipo de lesão, sem infiltração de corticosteróide, foi provocada na prega contra-lateral que serviu como controle. Análises pareadas revelaram, um aumento significativo do infiltrado inflamatório em torno do microflap nas pregas vocais com corticosteróide injetado e analisadas em 2, 4 e 6 semanas. No nosso estudo, a quantidade de células inflamatórias foi também maior do lado injetado, porém não estatisticamente significativa (3,16 x 2,48), ou seja, aparentemente a quantidade de células inflamatórias não foi afetada pela injeção de corticosteróide (p>0,05). A diferença observada entre o nosso resultado e os de Coleman et al. (1999) pode ser em razão de diferenças metodológicas como o tipo de lesão e o tempo avaliado.

Ainda em relação aos nossos resultados nos quais o corticóide, aparentemente, não influiu na quantidade de células inflamatórias, o achado deve ser interpretado com cautela e algumas considerações devem ser feitas:

1- Ao contrário do que mostra o resultado, a presença do corticóide intra- tecidual pode ter tido uma ação efetivamente inibidora sobre a migração de células inflamatórias. Entretanto, o fato da corda-estudo ter sofrido, além

Discussão 51

da incisão, os traumas causados pela introdução da agulha e pela expansão do tecido decorrente do volume injetado, pode ter induzido a uma migração maior de células inflamatórias do que na prega controle “anulando”, aparentemente, o efeito inibidor do corticosteróide.

2- Considerando que o volume da medicação injetada é relativamente grande se comparada às reduzidas dimensões da corda vocal do coelho, a possibilidade de difusão da droga por contiguidade para a prega controle ter tido um efeito anti-inflamatório não pode ser totalmente afastada. Todavia, esta hipótese nos parece pouco provável, pois caso isso tenha realmente ocorrido, seria de se esperar que não houvesse diferenças significativas nas concentrações de fibras colágenas.

3- Finalmente, pode-se ainda questionar se não haveria a possibilidade do corticóide injetado ter ação na prega controle mediante seu efeito sistêmico, ou seja, por difusão via-sangüínea. Essa hipótese, entretanto, nos parece muito pouco provável, pois, como citado anteriormente (Wannmacher, Ferreira, 1998), a injeção local do corticosteróide permite uma elevada concentração no tecido alvo, mas é rapidamente inativado após sua absorção, de forma que somente metabólitos inativados passam para a corrente circulatória.

Na literatura, a ação dos corticosteróides sobre as células inflamatórias é principalmente estudada após administração sistêmica de corticosteróides em lesões da pele. Segundo os estudos de Leibovich e Ross (1975), após administração sistêmica de hidrocortisona em porcos da índia, que foram submetidos a uma ferida cirúrgica na pele, o número de neutrófilos e fibroblastos ao redor da lesão de pele

Discussão 52

não foi afetado na resposta inflamatória aguda, mas ocorreu redução do nível de macrófagos na ferida de aproximadamente um terço. Apesar de comparado com controle (porcos da índia com a mesma lesão, mas sem injeção de hidrocortisona), esse estudo não apresenta teste estatístico.

Injeção de corticosteróide de depósito, como a triancinolona, têm sido utilizados em cicatrizes hipertróficas e quelóides. No estudo in vitro de Carroll et al., (2002), foi demonstrado que a diminuição da proliferação celular e do colágeno pela triancinolona é mediada por alterações na secreção de citoquinas.

Em nosso estudo, a metodologia empregada não nos permitiu também chegar a uma conclusão definitiva a respeito do impacto da injeção local do corticóide sobre a proliferação de células inflamatórias. Sendo assim, indubitavelmente, novos estudos sobre o infiltrado inflamatório são necessários pois essas células têm papel importante na deposição e reabsorção de colágeno e fibrina abaixo do epitélio. A distribuição, qualidade e quantidade de colágeno e fibrina podem levar a diferenças no tecido cicatricial (Tateya et al., 2005).

As pregas vocais injetadas com corticosteróide tiveram uma significativa menor deposição de colágeno no sítio da lesão. Apenas um estudo na literatura comparou a deposição de colágeno em lesão de prega vocal após injeção de corticosteróide. No estudo de Alencar et al. (2007), o corticosteróide foi injetado imediatamente antes da exérese de um fragmento de mucosa da borda livre das pregas vocais de seis porcos. Na comparação com o controle (mesma lesão sem a injeção de corticóide), trinta dias após, houve diminuição não significativa do depósito de colágeno na lâmina própria das pregas vocais. Esse estudo avaliou o colágeno trinta dias após o procedimento, enquanto que no nosso, a avaliação foi

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realizada no terceiro e no sétimo dia, fato esse, que não nos permite realizar uma comparação tecnicamente precisa entre os estudos.

Coleman et al. (1999)realizaram a avaliação funcional por estroboscopia e não encontraram diferença na vibração das pregas vocais em seguimento de até seis semanas de pós-operatório. A análise histológica desse estudo não considerou, entretanto, os componentes da matriz extracelular (colágeno, elastina, ácido hialurônico, fibronectina,...) que têm sido considerados os responsáveis pelas propriedades vibratórias da mucosa das pregas vocais, mas apenas o infiltrado inflamatório e a neovascularização. Em nosso estudo, apesar de apenas um único componente da matriz extracelular, o colágeno, ter sido estudado, sabemos que este é um componente importante da fibrose e que tem um papel muito relevante na resistência da cicatriz. Tendo em vista que uma das metas mais importantes da fonocirurgia é minimizar a área cicatricial e a sua rigidez, acreditamos que a redução na deposição de fibras colágenas obtida com injeção local do corticosteróide seja uma providência interessante do ponto de vista funcional pós-operatório.

No nosso estudo, o colágeno foi encontrado na lesão três dias após a incisão cirúrgica na prega vocal e teve um crescimento significativo entre três e sete dias, o que está de acordo com a literatura. No trabalho de Rousseau et al. (2004b), foi encontrada deposição de colágeno em estágios bem iniciais da cicatrização das pregas vocais de porcos. Entre três e 10 dias pós-operatório ele era mais frouxo e desorganizado em relação ao controle (prega vocal contra-lateral sem lesão). Após 15 dias havia maior deposição de colágeno e foram observadas bandas espessas na cicatriz.

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incisão cirúrgica desde o primeiro dia após a lesão, mas principalmente a partir do terceiro dia. O pico foi em torno de cinco dias. O colágeno tipo I diminuiu após cinco dias, mas o colágeno tipo III não diminuiu até o final do estudo (14 dias). Ambos os tipos de colágenos foram mais elevados que os controles (prega vocal contralateral que foi mantida intacta) em 2, 4, 8 e 12 semanas. Em outro estudo dos mesmos autores, o colágeno tipo I declinou após oito semanas da cirurgia das pregas vocais de ratos, embora tenha permanecido acima dos controles, o que sugere uma lenta remodelação nos dois primeiros meses pós-operatório. Os níveis de colágeno tipo III permaneceram elevados e estáveis durante todo o estudo (Tateya et al., 2005). Esses resultados mostram que o processo de deposição e reabsorção cicatricial do colágeno no período pós-operatório é bastante complexo e consequentemente as propriedades viscoelásticas da prega vocal operada devem sofrer grandes alterações ao longo do tempo. Acreditamos que uma melhor compreensão dos mecanismos fisiopatológicos da deposição de colágeno na cicatrização será de grande importância para o tratamento e prevenção de cicatrizes em fonocirurgia.

6.1 Considerações finais

A prevenção e o tratamento ideal da fibrose na prega vocal ainda não foram bem estabelecidos, embora muitas pesquisas tenham sido realizadas. O nosso estudo mostrou efetivamente que, não obstante a injeção do medicamento possa estar associada com maior trauma tecidual decorrente da expansão tecidual provocada, o uso do corticosteróide diminui a deposição de colágeno na cicatrização da prega

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vocal lesionada. Esse fato nos leva a pensar que o uso prático da injeção intra- operatória dessa substância que, há muito tempo, vem sendo realizada por diversos profissionais apoiada até então em deduções intuitivas, tem, agora, um valor cientificamente comprovado, justificando a continuidade do seu emprego. É preciso salientar, todavia, que mais estudos são necessários, principalmente, para avaliar se as alterações do colágeno causadas pelo corticosteróide persistem a longo prazo e, se efetivamente há impacto significativo dessas alterações a níveis macroscópico da