As células renais embrionárias humanas (HEK293) estáveis eram transfectadas com os canais TRPV1. As células eram gentilmente cedidas pelo Doutor Michael Caterina (Johns Hopkins University, Baltimore, MD, EUA). As células HEK293 transfectadas com o canal, bem como as do tipo selvagem, foram mantidas a temperatura de 37 0C, em 5% de CO2 em Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM, Life Technologies Rockville, MD) e 10% de soro bovino fetal (FBS, Life Technologies). Tanto as células HEK293 transfectadas quanto as do tipo selvagem eram utilizadas somente após 24 horas da transfecção.
4.5 PERFUSÃO NEURONAL
Os neurônios eram perfundidos com solução de Locke, que apresentava a seguinte composição (mM): 136 de NaCl, 5,6 de KCl, 7,2 de NaH2PO4, 14,3 de NaHCO3, 1,2 de MgCl2, 2,2 de CaCl2, e 10,0 de dextrose; a solução era equilibrada com 95% de O2 e 5% de CO2. Nos experimentos em que o meio livre de Ca2+ era necessário, o CaCl2 era substituído por MgCl2.
4.6 CÂMARA DE REGISTRO
Uma câmara de registro convencional, com via de fluxo retangular de 200 µl, funcionava como percurso para as soluções de Locke normal ou livre de Ca2+. A perfusão era feita por um sistema de fluxo pela gravidade (4 ml/min). A solução era renovada a cada 14 segundos, conforme determinado pelo manual do marcador fluorescente. A câmara de registro estava montada sobre um microscópio invertido (TE200; Nikon, Tóquio, Japão) equipado com objetiva transmissora de radiação ultravioleta (SuperFluor, 40X, N. A. 1.4, Nikon). A objetiva permitia visualização direta dos neurônios ou medição de fluorescência.
4.7 IMAGEM DE CÁLCIO
No estudo dos transientes de cálcio era utilizado um indicador fluorescente conhecido como FURA-2-AM. Antes dos experimentos, as células eram carregadas com 1 µM do indicador por 45 a 60 minutos, à temperatura ambiente. O indicador tem a capacidade de atravessar a membrana plasmática. No interior da célula há clivagem do grupamento éster, permitindo retenção do indicador (KAO, 1994).
Após esta etapa, o disco contendo as células carregadas de FURA- 2-AM era acoplado à câmara de registro, com perfusão contínua de solução de Locke normal ou livre de Ca2+. A medição da fluorescência era feita com um espectrofotômetro de excitação dual operando em modo microfluorimétrico. O espectrofotômetro estava acoplado ao microscópio invertido por um cabo de fibra ótica. A célula em estudo era excitada alternadamente por radiações de 340 nm e 380 nm obtidas em dois monocrônomos (Deltascan Illumination System, Photonic Technology International (PTI), South Brunswick, NJ); a fluorescência de 510 nm emitida passava por um dicromo e daí para um tubo fotomultiplicador (D-104 microscope photomultiplier, PTI) com sinal digitalizado (COHEN et al., 1997). A aquisição e análise das imagens eram feitas pelo software Felix 1.1 (PTI), e a razão obtida das duas excitações correspondia à variação de cálcio livre no citoplasma (Figura 4). A fluorescência obtida era corrigida para auto-fluorescência através de medição prévia em ambiente sem a presença de células. A [Ca2+]i aparente era calculada a partir da razão de fluorescência R, pela seguinte equação:
[Ca2+]
i = Kd(R Rmin)/(Rmax R)(sf,2/sb,2) , onde Kd era a constante
de ligação efetiva, Rmin o valor limite de fluorescência do indicador livre de Ca2+, e Rmax o valor limite de fluorescência do indicador saturado com Ca2+. Experimentalmente, o fator sf,2/sb,2 era a razão da intensidade de fluorescência medida quando todos os indicadores estavam livres de Ca2+ sobre a intensidade de fluorescência medida quando todos os indicadores estavam ligados ao Ca2+ (GRYNKIEWICZ et al., 1985). Essas constantes de calibração eram determinadas experimentalmente tanto para o set- up quanto para as condições experimentais utilizadas.
4.8 REAGENTES
Os reagentes eram comprados dos seguintes vendedores: da empresa Sigma, cafeína, capsaicina; da empresa Calbiochem (La Jolla, CA), ácido ciclopiazônico; da empresa Biomol International (Plymouth Meeting, PA), N-(4-t-Butilfenil)-4-(3- cloropiridina-2-yl)tetrahidropirazina-1(2H)-carboxamida (BCTC); da empresa Molecular Probes (Eugene, OR), éster de acetoximetil de FURA-2 (FURA-2-AM); da empresa Teflabs (Austin, TX), sal de pentapotássio de FURA-2 (Austin, TX); da empresa Tocris (Ellsville, MO), iodoresiniferatoxina (IRTX).
As soluções contendo os reagentes eram preparadas diariamente a partir de soluções de estoque armazenadas no refrigerador. As soluções contendo os reagentes eram colocadas no meio do experimento por abertura de válvulas de três vias. Cada válvula era ligada a um reservatório contendo uma concentração conhecida do reagente em solução de Locke normal ou livre de Ca2+. Quando necessário, os neurônios eram perfundidos com solução de Locke livre de Ca2+ antes da aplicação do reagente específico. As concentrações dos reagentes eram: 10 mM de cafeína; 100 nM de IRTX; 175 nM de BCTC; 5 µM de ácido ciclopiazônico (CPA); 50 nM de capsaicina.
4.9 ANÁLISE DE DADOS
Nossos dados eram analisados e convertidos em gráficos no programa SigmaPlot 2000 (SPSS, Chicago, IL). As análises estatísticas eram realizadas no programa SigmaStat 2.0 (SPSS) e os resultados expressos em média ± erro padrão. A significância estatística era avaliada pelo teste ANOVA combinado com Student- Newman-Keuls, que comparavam os pares de resultados. P < 0,05 indicava significância estatística.
5.RESULTADOS
Os neurônios do GN de ratos adultos apresentaram transientes de Ca2+ consideráveis após uma breve aplicação de cafeína. A aplicação da cafeína (10 mM, 15 s) produziu transientes de Ca2+ induzidos por cafeína em todas as células estudadas, com amplitude média de 394 ± 32 nM (n = 44). As amplitudes dos CICTs foram consistentes no decorrer do experimento. Em quatro neurônios, a aplicação de cafeína (10 mM, 15 s) produziu transientes de Ca2+ que não apresentaram diferença significativa (p > 0,05) entre si (Gráfico 1). As amplitudes médias foram de 218 ± 20 nM, 221 ± 24 nM, e 213 ± 35 nM para a primeira, segunda e terceira aplicações, respectivamente (n = 4; Gráfico 1).
Cafeína
50 nM
30 s
Gráfico 1 – Avaliação da reprodutibilidade dos transientes de Ca2+ induzidos por cafeína em solução de Locke normal. Três aplicações de cafeína (10 mM, 15 s) produziram três CICTs em solução de Locke normal. As amplitudes médias dos CICTs foram de 218 ± 20 nM, 221 ± 24 nM, e 213 ± 35 nM (n = 4) para a primeira, segunda e terceira aplicações, respectivamente. Os transientes de Ca2+ não apresentaram diferenças significativas entre si. (p > 0,05).
Para avaliarmos a participação do Ca2+ extracelular nos CICTs dos neurônios do GN de ratos aplicamos cafeína (10 mM, 15 s) nos mesmos, em solução de Locke normal ou em solução de Locke livre de Ca2+. A amplitude dos CICTs foi reduzida de forma significativa em solução de Locke livre de Ca2+. Os transientes de Ca2+ induzidos por cafeína em solução normal de Locke tiveram amplitude média de 304 ± 32 nM (n = 6; Gráfico 2). Os CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ tiveram amplitude média de 122 ± 29 nM (n = 6; Gráfico 2). Houve redução média de 54 ± 9% dos valores de controle (n = 6; Gráfico 2). Após lavagem em solução de Locke normal, a amplitude média dos CICTs retornou a dos valores de controle, 286,4 ± 28 nM (n = 6; Gráfico 2). Esses resultados sugerem que os neurônios do GN de ratos, assim como os neurônios do GN de coelhos, apresentam a via de influxo de Ca2+ induzida por cafeína.
Outra forma de avaliarmos a participação do Ca2+ extracelular nos CICTs dos neurônios do GN de ratos é pelo esvaziamento dos seus estoques intracelulares dependentes da CICR. Uma aplicação inicial de cafeína (10 mM; 15 s) em solução de Locke normal produziu CICTs com amplitude média de 332 ± 64 nM (n = 5; Gráfico 3).
Cafeína
Livre de Ca
2+100 nM
30 s
Gráfico 2 – Avaliação da participação do Ca2+ extracelular nos transientes de Ca2+ induzidos por cafeína. O primeiro e o terceiro CICTs foram produzidos por cafeína (10 mM, 15 s) em solução de Locke normal. O segundo CICT foi produzido por cafeína (10 mM, 15 s) em solução de Locke livre de Ca2+. A diferença de amplitude entre a média dos CICTs de controle e o segundo CICT representa o influxo através da membrana plasmática. A amplitude dos CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ foi de 54 ± 9% da amplitude dos CICTs de controle (n = 6) produzidos em solução de Locke normal.
Para esvaziamento dos estoques intracelulares dependentes da CICR, selecionamos o ácido ciclopiazônico (CPA), que é um inibidor da Ca2+ ATPase (bomba SERCA) do retículo endoplasmático (SEIDLER et al., 1989). O CPA bloqueia recaptação de Ca2+ a partir do citosol (THOMAS & HANLEY, 1994). Aplicamos CPA (5 µM) continuamente por 16 minutos. O esvaziamento dos estoques referidos foi acelerado por duas aplicações iniciais e sucessivas de cafeína (10 mM; 15 s; n = 5; Gráfico 3), em solução de Locke normal, em presença continuada de CPA. Para demonstrarmos o pleno esvaziamento dos estoques referidos, aplicamos cafeína (10 mM; 15 s) em solução de Locke livre de Ca2+, em presença continuada de CPA. Como esperado, a cafeína não produziu CICTs (n = 5; Gráfico 3). Por último, para demonstrarmos a participação do Ca2+ extracelular nos CICTs, aplicamos cafeína (10 mM; 15 s) em solução de Locke normal, em presença continuada de CPA. O CPA produziu CICTs com amplitude média de 105 ± 23 nM (n = 5; Gráfico 3). Esses resultados sugerem que os neurônios do GN de ratos apresentam influxo de Ca2+ induzida por cafeína.
Cafeína
Livre de Ca
2+CPA
2 min 200 nM
Gráfico 3 - Avaliação da participação do Ca2+ extracelular nos transientes de Ca2+ induzidos por cafeína. Cafeína (10 mM; 15 s) produziu CICTs de controle com amplitude média de 332 ± 64 nM (n = 5). Em seguida, CPA (5 µM) foi aplicado de forma continuada para esvaziamento dos estoques de Ca2+ dependentes da CICR. Duas aplicações sucessivas de cafeína (10 mM; 15 s) aceleraram o esvaziamento dos estoques. Em seguida, aplicação de cafeína (10 mM; 15 s) não produziu CICTs em solução de Locke livre de Ca2+ (n = 5). Por último, aplicação de cafeína (10 mM; 15 s) produziu CICTs em solução de Locke normal (n = 5), demonstrando a participação do Ca2+ extracelular nos CICTs.
Para determinarmos o envolvimento do canal TRPV1 nos CICTs, utilizamos dois antagonistas seletivos do canal TRPV1, iodoresiniferatoxina (IRTX, 100 nM; WAHL et al, 2001) e N-(4-t- Butilfenil)-4-(3-cloropiridina-2-yl)tetrahidropirazina-1(2H)-
carboxamida (BCTC, 175 nM; POMONIS et al., 2003; VALENZANO et al., 2003). Ambos os antagonistas inibiram os transientes de Ca2+ produzidos pelo agonista seletivo do canal TRPV1, capsaicina (50 nM), em mais de 90% dos neurônios estudados (n = 4 para cada antagonista, dados não mostrados).
O antagonista seletivo do canal TRPV1, IRTX, reduziu de forma significativa a amplitude dos CICTs. As amplitudes médias dos CICTs em solução de Locke normal e em solução de Locke normal com IRTX (100 nM) foram de 405 ± 114 nM e 205 ± 53 nM, respectivamente (n = 9; Gráfico 4). A amplitude média dos CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ foi de 220 ± 55 nM (n = 9; Gráfico 4). Os CICTs produzidos em solução de Locke normal com IRTX (100 nM) e os CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ foram registrados na mesma célula e não apresentaram diferença significativa (p = 0,814) entre si.
Cafeína
Livre de Ca
2+IRTX
300 nM
1 min
Gráfico 4 – Avaliação da participação do canal TRPV1 nos transientes de Ca2+ induzidos por cafeína. O antagonista seletivo do canal TRPV1, IRTX (100 nM), reduziu de forma significativa as amplitudes dos CICTs. As amplitudes dos CICTs em presença de solução de Locke normal com IRTX foram diferentes das amplitudes dos CICTs de controle (p = 0,001; n = 9). As amplitudes dos CICTs registrados em presença de solução de Locke normal com IRTX não foram diferentes das amplitudes dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ (p = 0,814; n = 9).
Zero Ca2+
IRTX
%
Inibição
0 10 20 30 40 50 60Gráfico 5 – Avaliação das porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ e em solução de Locke normal com IRTX. As porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ e registrados em solução de Locke normal com IRTX foram de 43 ± 6% e 45 ± 8%, respectivamente.
As porcentagens de inibição média dos CICTs em solução de Locke livre de Ca2+ e em solução de Locke normal com IRTX foram de 43 ± 6% e 45 ± 8%, respectivamente (Gráfico 5).
Para determinarmos se a IRTX bloqueou o influxo de Ca2+ induzido por cafeína, comparamos os CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ com os CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ com IRTX, registrados na mesma célula. As amplitudes médias dos CICTs produzidos foram de 398 ± 73 nM em solução de Locke normal, 244 ± 53 nM em solução de Locke livre de Ca2+, e 231 ± 53 nM em solução de Locke livre de Ca2+ com IRTX (n = 5; Gráfico 6). As amplitudes médias dos CICTs em solução de Locke livre de Ca2+ e em solução de Locke livre de Ca2+ com IRTX não apresentaram diferença significativa (p = 0,773) entre si. As porcentagens de inibição média dos CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ e dos CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ com IRTX foram de 39 ± 11% e 43 ± 11%, respectivamente (Gráfico 7). Esses resultados sugerem que o influxo de Ca2+ induzido por cafeína se dá por ativação do canal TRPV1.
Cafeína
Livre de Ca
2+IRTX
1 min 200 nM
Gráfico 6 – Avaliação do antagonista seletivo do canal TRPV1 no bloqueio do influxo de Ca2+ induzido por cafeína. A redução observada nos CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ com IRTX foi semelhante à redução observada nos CICTs produzidos somente em solução de Locke livre de Ca2+ (p = 0,773; n = 5).
%
Inibição
0 20 30 40 60Zero Ca2+
Zero Ca2+ IRTX
50
10
Gráfico 7 – Avaliação das porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ e em solução de Locke livre de Ca2+ com IRTX. As porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ e registrados em solução de Locke livre de Ca2+ com IRTX foram de 39 ± 11% e 43 ± 11%, respectivamente.
Testamos um segundo antagonista seletivo para eliminarmos a possibilidade do IRTX ter reduzido os CICTs independente de
bloquear o canal TRPV1. O antagonista seletivo do canal TRPV1, o BCTC, reduziu de forma significativa a amplitude dos CICTs. As amplitudes médias dos CICTs em solução de Locke normal e em solução de Locke normal com BCTC (175 nM) foram de 572 ± 73 nM e 395 ± 64 nM, respectivamente (n = 8; Gráfico 8). A amplitude média dos CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ foi de 382 ± 59 nM (n = 8; Gráfico 8). Os CICTs produzidos em solução de Locke normal com BCTC (175 nM) e os CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ foram registrados na mesma célula e não apresentaram diferença significativa (p = 0,584) entre si. As porcentagens de inibição média dos CICTs em solução de Locke livre de Ca2+ e em solução de Locke normal com BCTC foram de 33 ± 4% e 34 ± 3%, respectivamente (Gráfico 9).
Em seguida, testamos se o BCTC teve outros efeitos sobre os CICTs além de bloquear o influxo de Ca2+ induzido por cafeína. Para isso, comparamos os CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ com os CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ com BCTC, registrados na mesma célula.
Cafeína
Livre de Ca
2+BCTC
200 nM
1 min
Gráfico 8 – Avaliação da participação do canal TRPV1 nos transientes de Ca2+ induzidos por cafeína. O antagonista seletivo do canal TRPV1, BCTC (175 nM), reduziu de forma significativa as amplitudes dos CICTs. As amplitudes dos CICTs em presença de solução de Locke normal com BCTC foram diferentes das amplitudes dos CICTs de controle (p < 0,001; n = 8). As amplitudes dos CICTs registrados em presença de solução de Locke normal com BCTC não foram diferentes das amplitudes dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ (p = 0,584; n = 8).
Gráfico 9 – Avaliação das porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ e em solução de Locke normal com BCTC. As porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ e registrados em solução de Locke normal com BCTC foram de 33 ± 4% e 34 ± 3%, respectivamente.
As amplitudes médias dos CICTs produzidos foram de 395 ± 33 nM em solução de Locke normal, 253 ± 25 nM em solução de Locke
livre de Ca2+, e 245 ± 35 nM em solução de Locke livre de Ca2+ com BCTC (n = 7; Gráfico 10). As amplitudes médias dos CICTs em solução de Locke livre de Ca2+ e em solução de Locke livre de Ca2+ com BCTC não apresentaram diferença significativa (p = 0,794) entre si. As porcentagens de inibição média dos CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ e dos CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ com BCTC foram de 36 ± 4% e 38 ± 7%, respectivamente (Gráfico 11). A tabela 1 resume os resultados descritos acima.
Finalmente, as porcentagens de inibição média dos CICTs produzidos em solução de Locke normal com IRTX, em solução de Locke normal com BCTC, e em solução de Locke livre de Ca2+, 45 ± 8%, 33 ± 4% e 54 ± 9%, não apresentaram diferenças significativas entre si (p = 0,117; Gráfico 12). Esses achados suportam a conclusão de que os canais TRPV1 podem servir como via de influxo de Ca2+ induzida por cafeína nos neurônios do GN de ratos.
Cafeína
100 nM
1 min
Gráfico 10 – Avaliação do antagonista seletivo do canal TRPV1 no bloqueio do influxo de Ca2+ induzido por cafeína. A redução observada nos CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ com BCTC foi semelhante à redução observada nos CICTs produzidos somente em solução de Locke livre de Ca2+ (p = 0,794; n = 7).
40 50
Gráfico 11 – Avaliação das porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ e em solução de Locke livre de Ca2+ com BCTC. As porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ e registrados em solução de Locke livre de Ca2+ com BCTC foram de 36 ± 4% e 38 ± 7%, respectivamente.
50 60 70
Gráfico 12 – Avaliação das porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+, em solução de Locke normal com IRTX, e em solução de Locke normal com BCTC. As porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+, em solução de Locke normal com IRTX e em solução de Locke normal com BCTC, 54 ± 9%, 45 ± 8%, e 33 ± 4%, não foram apresentaram diferenças significativas entre si (p = 0,117).
Tabela 1. Efeito de zero Ca2+ nominal e antagonistas seletivos do TRPV1 sobre os transientes de Ca2+ induzidos por cafeína em neurônios do gânglio nodoso registrados isoladamente
_____________________________________________________________________________
CONTROLE IRTX ZERO Ca2+Locke ZERO Ca2+Locke+IRTX n
304 ± 32 --- 122 ± 29* --- 6 405 ± 114 205 ± 53* 220 ± 55* --- 9 398 ± 73 --- 244 ± 53* 231 ± 53* 5
CONTROLE BCTC ZERO Ca2+Locke ZERO Ca2+Locke + BCTC n
572 ± 73 395 ± 64* 382 ± 59* --- 8 395 ± 33 --- 253 ± 25* 245 ± 35* 7
_____________________________________________________________________________ Os dados estão expressos em nanomolar (nM) (média ± erro padrão).* p < 0,05, quando comparados aos valores de controle correspondentes. n = número de neurônios do gânglio nodoso avaliado em cada protocolo experimental.
Por último avaliamos os CICTs em células HEK293 transfectadas estavelmente com o canal TRPV1. Essas células não apresentaram CICTs, sugerindo que a ativação do canal TRPV1 pela cafeína (10 mM, 15 s), caso haja, se dá de outra maneira nessas
células (n = 5; Gráfico 13). A presença do canal TRPV1 nessas células pôde ser verificada por duas aplicações sucessivas do agonista seletivo do TRPV1, capsaicina (50 nM), que produziu transientes de Ca2+ em todas as células estudadas (n = 5; Gráfico 13). Repetimos os experimentos em células HEK293 sem o canal TRPV1. Essas células não apresentaram transientes de Ca2+ induzidos por cafeína (10 mM, 15 s) e não apresentaram transientes de Ca2+ induzidos por capsaicina (50 nM, 10 s) (dados não mostrados).
Cafeína
Capsaicina
F / F0 = 2
30 s
Gráfico 13 – Avaliação dos CICTs registrados em células HEK293 transfectadas estavelmente com o canal TRPV1. Essas células não apresentaram CICTs (n = 5). Duas aplicações sucessivas do agonista seletivo do TRPV1, capsaicina (50 nM), produziram transientes de Ca2+ em todas as células estudadas (n = 5).
6.DISCUSSÃO
A via de liberação de Ca2+, CICR, se dá pela ativação dos RyRs (ENDO et al. AL, 1970; FABIATO & FABIATO, 1975). A cafeína é o agonista clássico dos receptores rianodina (SITSAPESAN & WILLIAMS, 1990). Nos neurônios do GN de coelhos, a cafeína produz transiente de Ca2+ por liberação de Ca2+ do retículo endoplasmático, e por influxo de Ca2+ através da membrana plasmática (HOESCH et al., 2001). Nossos resultados indicam que os neurônios do GN de ratos também apresentam a via de influxo de Ca2+ induzida por cafeína. Estudos eletrofisiológicos em neurônios do GN de coelhos demonstraram que a via de influxo se dá por um canal catiônico não-seletivo (HOESCH et al., 2001). Esse canal ainda não havia sido identificado.
O receptor vanilóide do tipo 1 (TRPV1) é um bom candidato porque funciona como um canal não-seletivo (CORTRIGHT & SZALLASI, 2004), apresenta diversidade de substâncias ativadoras (INOUE et al., 2003), e está presente em neurônios sensoriais (LASZLO et al., 2004). No presente estudo, apresentamos evidências farmacológicas que sugerem o canal de cátion não- seletivo como sendo o TRPV1.
Inicialmente, comprovamos a participação do Ca2+ extracelular nos CICTs dos neurônios estudados. Em solução de Locke livre de Ca2+, a aplicação cafeína produziu transientes de Ca2+ reduzidos de forma significativa em 54 ± 9 % dos valores de controle. Em outro experimento, cafeína produziu transientes de Ca2+ após esvaziamento total dos estoques intracelulares de Ca2+ com ácido ciclopiazônico, que é um inibidor da Ca2+ ATPase do retículo endoplasmático. Em conjunto, esses experimentos demonstraram a presença de uma via de influxo de Ca2+ induzida por cafeína nos neurônios estudados.
Usando dois antagonistas específicos e quimicamente distintos do TRPV1, IRTX e BCTC, demonstramos que os transientes de Ca2+ induzidos por cafeína foram reduzidos de forma significativa em 45 ± 8 % e 33 ± 4 %, respectivamente. Os CICTs