A identidade da via de influxo de cálcio induzida por cafeína em neurônios sensitivos primários de ratos

Universidade Federal Fluminense

JOÃO PAULO LIMA DAHER

A IDENTIDADE DA VIA DE INFLUXO DE CÁLCIO INDUZIDA POR

CAFEÍNA EM NEURÔNIOS SENSITIVOS PRIMÁRIOS DE RATOS

Niterói

2007

JOÃO PAULO LIMA DAHER

A IDENTIDADE DA VIA DE INFLUXO DE CÁLCIO

INDUZIDA POR CAFEÍNA EM NEURÔNIOS SENSITIVOS

PRIMÁRIOS DE RATOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Área de concentração: Patologia Investigativa

Orientadores: Vânia Lopes e Daniel Weinreich

Niterói

2007

D Daher, João Paulo Lima

A identidade da via de influxo de cálcio induzida por cafeína em neurônios sensitivos primários de ratos / João Paulo Lima Daher. Niterói, 2007.

114f.

Dissertação de Mestrado (Patologia Investigativa – Programa de Pós-Graduação em Patologia) – Universidade Federal Fluminense

Orientadores: Vânia Lopes e Daniel Weinreich Bibliografia: f. 85-100

1. METABOLISMO DO CÁLCIO INTRACELULAR. 2. VIA DE INFLUXO DE CÁLCIO.

3. NEURÔNIOS SENSITIVOS PRIMÁRIOS. I. Universidade Federal Fluminense. II. Título.

CDD

JOÃO PAULO LIMA DAHER

A IDENTIDADE DA VIA DE INFLUXO DE CÁLCIO INDUZIDA POR CAFEÍNA EM NEURÔNIOS SENSITIVOS PRIMÁRIOS DE RATOS

Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Área de concentração: Patologia Investigativa

Aprovado em ___________ de 2007.

BANCA EXAMINADORA

Professor Doutor Oswaldo Nascimento (examinador prévio)

Universidade Federal Fluminense

Professora Doutora Heloísa Werneck de Macedo

Universidade Federal Fluminense

Professor Doutor Roberto Sanchez Dornelles Oliveira

Universidade Federal do Estado do Rio De Janeiro

Aos mestres Carlos Magno e Maria Cristina.

Agradeço a todos os meus familiares, em especial à Zenith. Em todos os momentos, vocês foram uma verdadeira família.

Agradeço aos meus orientadores, Vânia Glória Silami Lopes e Daniel Weinreich, por sua contribuição inestimável à minha formação acadêmica.

Agradeço aos meus amigos e conselheiros Salim Kanaan, Alexandre Miguel Benjó e Thaís Helena Moreira Veiga.

Agradeço a todos os funcionários do Departamento de Patologia da Universidade Federal Fluminense e do Departamento de Farmacologia da Universidade de Maryland.

Agradeço a todas as pessoas que trabalham pelo progresso do mundo.

Agradeço aos governos da República Federativa do Brasil e dos Estados Unidos da América, pelos crescentes investimentos na área de educação.

Os transientes de Ca2+ _{induzidos por cafeína (CICTs) em neurônios sensitivos}

aferentes vagais (neurônios do gânglio nodoso) são produzidos por dois mecanismos distintos: liberação dos estoques intracelulares via receptores rianodina e influxo de Ca2+ _{através da membrana plasmática, por ativação de um}

receptor desconhecido. Utilizamos microfluorimetria de neurônios do GN de ratos para medirmos as mudanças da concentração intracelular de Ca2+ _e

testarmos a hipótese do receptor de potencial transiente vanilóide do tipo 1, TRPV1, ser a via de influxo de Ca2+_{. Aplicação de cafeína (10 mM) produziu}

CICTs em todos os neurônios testados, com uma média de 394 ± 32 nM. Os CICTs foram parcialmente dependentes da via de influxo de Ca2+_{, que variou de 33 a 98}

% do transiente total de Ca2+ _{(média de 54 ± 9 %; n=6). Aplicação de dois}

antagonistas seletivos do TRPV1 (IRTX, 100 nM e BCTC, 175 nM) reduziu de forma significativa os CICTs para 45 ± 8% (n = 9) e 33 ± 4% (n = 8), respectivamente. Esses valores não apresentaram diferença significativa em relação às inibições dos CICTs observadas em meio extracelular nominalmente livre de Ca2+_{. As amplitudes médias dos CICTs em solução de Locke livre de Ca}2+

e solução de Locke livre de Ca2+ _{com IRTX ou com BCTC não apresentaram}

diferenças significativas entre si (n = 5 e 7, respectivamente). Coletivamente, essas observações sugerem que a cafeína produz influxo de Ca2+

por ativação dos canais TRPV1.

Palavras-chave: cafeína; influxo de Ca2+_{; TRPV1; CICR; gânglio nodoso; nervo}

Abstract

Caffeine-induced Ca2+ _{transients (CICTs) in vagal sensory afferent neurons}

(nodose ganglion neurons) are produced by two distinct mechanisms: release from intracellular stores via ryanodine receptors and Ca2+ _{influx across the}

plasma membrane, due to activation of an unknown receptor. In isolated rat NGNs, we used single-cell microfluorimetry to measure changes in intracellular Ca2+ _{and to test whether TRPV1 receptors underlie the Ca}2+ _{influx pathway.}

Caffeine (10 mM) evoked CICTs in all neurons tested (n=44) averaging 394 ± 32 nM. CICTs were partially dependent upon a Ca2+ _{influx pathway that ranged}

between 33 and 98 % (mean, 54 ± 9 %, n=6) of the total Ca2+ _transient.

Application of two selective TRPV1 antagonists (IRTX, 100 nM and BCTC, 175 nM) significantly attenuated CICTs by 45 ± 8% (n = 9) and 33 ± 4% (n = 8), respectively. These values were not significantly different from the inhibition of CICTs observed when recordings were made in nominally zero extracellular Ca2+_{. The peak average amplitudes of CICTs in Ca}2+_{-free Locke}

solution and Ca2+_{-free Locke solution with IRTX or with BCTC were not}

significantly different from one another (n = 5 and 7, respectively). These observations suggest that caffeine can induce a Ca2+ _{influx by activating}

TRPV1 channels.

Keywords: Caffeine; Ca2+ _{influx; TRPV1; CICR; nodose ganglion; vagus nerve;}

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Mecanismo de sinalização de Ca2+ intracelular...21

Figura 2 Anatomia do nervo vago e do gânglio nodoso...33 Figura 3 Árvore filogênica da superfamília dos TRP...37

Figura 4 Conjunto experimental da técnica de imagem de cálcio.49

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 Avaliação da reprodutibilidade dos transientes de Ca2+ induzidos por cafeína em solução de Locke normal...53

Gráfico 2 Avaliação da participação do Ca2+ extracelular nos transientes de Ca2+ induzidos por cafeína...55

Gráfico 3 Avaliação da participação do Ca2+ extracelular nos transientes de Ca2+ induzidos por cafeína...57

Gráfico 4 Avaliação da participação do canal TRPV1 nos transientes de Ca2+ _{induzidos por cafeína...59}

Gráfico 5 Avaliação das porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ e em solução de Locke normal com IRTX...60

Gráfico 6 Avaliação do antagonista seletivo do canal TRPV1 no bloqueio do influxo de Ca2+ induzido por cafeína...62

Gráfico 7 Avaliação das porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ _{e em solução de} Locke livre de Ca2+ _{com IRTX...63} Gráfico 8 Avaliação da participação do canal TRPV1 nos transientes de Ca2+ induzidos por cafeína...65

Gráfico 9 Avaliação das porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ _{e em solução de} Locke normal com BCTC...66

Gráfico 10 Avaliação do antagonista seletivo do canal TRPV1 no bloqueio do influxo de Ca2+ _{induzido por cafeína...68}

Gráfico 11 Avaliação das porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ _{e em solução} de Locke livre de Ca2+ _{com BCTC...69}

Gráfico 12 Avaliação das porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+, em solução de Locke normal com IRTX, e em solução de Locke normal com BCTC...70

Gráfico 13 Avaliação dos CICTs registrados em células HEK293 transfectadas estavelmente com o canal TRPV1...73

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Efeito de zero Ca2+ nominal e antagonistas seletivos do TRPV1 sobre os transientes de Ca2+ induzidos por cafeína em neurônios do gânglio nodoso registrados isoladamente...71

LISTA DE ABREVIATURAS

BCTC Butil-cloro-tetra-carboxamida cADPR Ribose de ADP cíclico

CICI Influxo de Ca2+ _{induzido por cafeína} CICR Liberação de Ca2+ _{induzida por Ca}2+ CICT Transiente de Ca2+ induzido por cafeína CPA Ácido ciclopiazônico

DMEM Dulbecco´s modified Eagle medium DRG Gânglio da raiz dorsal

ER Retículo endoplasmático FBS Soro bovino fetal

FURA-2-AM Éster de acetoximetil de FURA-2 GN Gânglio nodoso

HBSS Solução salina balanceada de Hank HEK293 Célula renal embriônica humana

IP3R Receptor de inositol trifosfato IRTX Iodoresiniferatoxina

L-15 Meio de Leibovitz

LOC Canal de Ca2+ controlado por ligante LTP Potenciação de longo termo

MP Membrana plasmática

NTS Núcleo do trato solitário PLC Fosfolipase C

RyR Receptor rianodina

sAHP Hiperpolarização lenta pós-potencial de ação SMOC Canal de Ca2+ _{controlado por segundo mensageiro} SOC Canal de Ca2+ _{controlado por estoque}

TRP Receptor de potencial transiente TRPV1 Receptor vanilóide do tipo 1

SUMÁRIO

3.2 LIBERAÇÃO DE CÁLCIO INTRACELULAR...024

3.3 MECANISMOS DE TRANSPORTE DE CÁLCIO...027

3.4 NERVO VAGO...029

3.4.1 Neurônios vagais motores...030

3.4.2 Neurônios vagais sensitivos...030

3.5 FISIOLOGIA DO CÁLCIO NOS NEURÔNIOS DO GÂNGLIO NODOSO...034

3.6 RECEPTOR DE POTENCIAL TRANSIENTE...036

3.6.1 Família Vanilóide...038

3.6.2 Receptor Vanilóide do tipo 1...038

3.6.3 Receptor Vanilóide do tipo 1 nas doenças...039

4 MATERIAL E MÉTODOS...043

4.1 ANIMAIS...043

4.2 DISSECÇÃO DOS NEURÔNIOS DO GÂNGLIO NODOSO...043

4.3 DISSOCIAÇÃO E CULTURA DOS NEURÔNIOS...044

4.4 CÉLULAS TRANSFECTADAS...046 4.5 PERFUSÃO NEURONAL...046 4.6 CÂMARA DE REGISTRO...047 4.7 IMAGEM DE CÁLCIO...047 4.8 REAGENTES...050 4.9 ANÁLISE DE DADOS...051 5 RESULTADOS...052

6 DISCUSSÃO...074

7 CONCLUSÕES...083

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...085

9 APÊNDICES...101

9.1 APÊNDICE A...101

9.1.1 Solução de Locke normal...101

9.1.2 Solução salina balanceada de Hank...102

9.1.3 Meio de Leibovitz...103

9.2 APÊNDICE B...106

1.INTRODUÇÃO

A cafeína produz uma elevação transitória da concentração citoplasmática dos íons Ca2+ _{livres (transientes de Ca}2+_{), numa} variedade de neurônios centrais e periféricos (USACHEV & THAYER, 1999). Em neurônios sensoriais primários vagais de coelhos (neurônios do gânglio nodoso), a cafeína produz transientes de Ca2+ _{pela ativação de duas vias distintas: via de liberação e via} de influxo (HOESCH et al., 2001).

Em todos os neurônios do gânglio nodoso (GN), a cafeína produz transientes de Ca2+ _{por ativação dos receptores rianodina} (RyRs), resultando em liberação de Ca2+ _{do retículo} endoplasmático (ER; COHEN et al., 1997; HOESCH et al., 2001).

Em cerca de 50% dos neurônios do GN de coelhos, os transientes de Ca2+ _{induzidos por cafeína (CICTs) são produzidos por uma via} adicional de influxo através da membrana plasmática (MP). Essa via é independente de voltagem e não-seletiva; permanece funcionante após o esvaziamento dos estoques intracelulares de Ca2+ _{ou após bloqueio do fenômeno de liberação de Ca}2+ _induzida por Ca2+ _{(CICR); está ausente em meio extracelular livre de Ca}2+ _e é independente dos canais de Ca2+ controlados por estoque (HOESCH et al., 2001). Até o momento não foi determinada a identidade dessa via de influxo.

A família vanilóide dos canais receptor de potencial transiente (TRPVs) é candidata à via de influxo de Ca2+ _induzida por cafeína. A subfamília vanilóide do tipo 1 (TRPV1) é altamente permeável ao Ca2+, tem padrão eletrofisiológico do tipo não-seletivo, e pode ser modulada por várias moléculas (MONTELL et al., 2002; BENHAM et al., 2002; PEDERSEN et al., 2005; PINGLE

et al., 2007). Além disso, os canais TRPV1 estão presentes e são funcionantes em 70 a 85% dos neurônios do GN de ratos (MARSH et al., 1987; ZHAO et al., 2006).

No presente trabalho utilizamos ferramentas farmacológicas específicas do canal TRPV1 para testarmos se este canal pode funcionar como via de influxo de Ca2+ _{ativada por cafeína em} neurônios do GN de ratos e células renais embriônicas humanas (HEK293) estavelmente transfectadas com o canal TRPV1.

2.OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO PRINCIPAL

- Identificar a via de influxo de cálcio ativada por cafeína em neurônios do gânglio nodoso de ratos.

- Dissociar e cultivar os neurônios do gânglio nodoso de ratos.

- Cultivar células renais embriônicas humanas transfectadas com o canal receptor de potencial transiente vanilóide do tipo 1. - Selecionar ferramentas farmacológicas específicas para estudo das vias de influxo e liberação de cálcio.

- Medir os transientes de cálcio pela técnica de imagem de cálcio.

3.REVISÃO DE LITERATURA

Os íons Ca2+ _{funcionam como segundos mensageiros que regulam} amplo espectro de processos celulares, incluindo: excitabilidade de membrana (HILLE, 2001); canais iônicos (HILLE, 2001); expressão de genes (BITO et al., 1996); liberação de neurotransmissores (KATZ & MILEDI, 1968); contração muscular (FABIATO & FABIATO, 1975); e secreção de hormônios (CURRY et al., 1968) e sucos digestivos (PETERSEN, 1992). Os transientes de Ca2+ podem resultar do influxo desses íons através de canais da membrana plasmática, ou liberação dos mesmos por abertura de canais dos estoques intracelulares. As células também expressam

mecanismos de transporte de Ca2+ _{que controlam a recuperação dos} transientes e regulam a concentração dos íons Ca2+ _livres ([Ca2+_{]i) no citosol. A figura 1 mostra um esquema da sinalização} de Ca2+ intracelular. Citoplasma

Ca

_Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

IP

Ca

Ca

2+

Figura 1 – Mecanismo de sinalização de Ca2+ intracelular

3.1 INFLUXO DE CÁLCIO

As correntes de Ca2+ através da membrana plasmática (influxo de Ca2+) se enquadram em três grandes categorias: correntes controladas por voltagem, correntes controladas por ligante, e correntes de Ca2+ _{controladas por estoque. O influxo de Ca}2+ controlado por voltagem está presente em todas as células excitáveis e é desencadeado por despolarizações de membrana. Pode ocorrer através de qualquer um dos vários subtipos (L, P/Q, N, R, ou T) de canais de Ca2+ _{controlados por voltagem (VGCCs),} altamente seletivos para o íon (HILLE, 2001). Alguns processos fisiológicos em que o papel do influxo de Ca2+ controlado por voltagem é bem estudado incluem: liberação de neurotransmissores (KATZ & MILEDI, 1968), atividade marcapasso do coração (HILLE, 2001), e potencial de ação cardíaco (BERNE & LEVY, 2001).

O influxo de Ca2+ _{também ocorre através de canais} controlados por ligante (LOCs) (receptores ionotrópicos). Em geral, esses canais são permeáveis aos íons Ca2+ _{e são do tipo} não-seletivo, mostrando permeabilidade importante aos íons Na+, K+, e Ca2+ (HILLE, 2001).

Os ligantes fisiológicos que desencadeiam influxo de Ca2+ _podem ser produzidos pela própria célula-alvo, por uma célula do mesmo tecido, ou por uma célula de outra parte do corpo. Nesse último caso, os ligantes são levados às células-alvo pela corrente sanguínea. Consequentemente, o influxo de Ca2+ pode ser controlado por ligantes fisiológicos produzidos à distância. Exemplos de processos fisiológicos em que se relata o influxo do Ca2+ controlado por ligante incluem: potenciação de longo termo (LTP) no hipocampo (BLISS & COLLINGRIDGE, 1993), ativação de leucócitos por mediadores inflamatórios (LI et al., 2002), e estimulação de musculatura lisa vascular por vasopressina (WALLNOFER et al., 1987).

O influxo de Ca2+ através de canais controlados por estoque (SOCs) ocorre em resposta à diminuição da concentração do íon nos estoques intracelulares. O mecanismo é ativado para aumentar

a [Ca2+_]

i e assim reencher os estoques intracelulares de Ca2+. Portanto, é um mecanismo fisiológico que mantém a concentração adequada do íon livre nos estoques intracelulares (PUTNEY et al., 2001). A maior parte das correntes controladas por estoque é não-seletiva.

Essas correntes foram demonstradas em muitos tipos celulares, incluindo células acinares pancreáticas (KRAUSE et al., 1996), células cromoafins adrenais (ZERBES et al., 1998), e neurônios do gânglio da raíz dorsal (DRG) (USACHEV & THAYER, 1999). Os mecanismos celulares específicos do influxo de Ca2+ controlado por estoque permanecem obscuros.

3.2 LIBERAÇÃO DE CÁLCIO INTRACELULAR

São conhecidos dois tipos de canais de liberação de Ca2+ intracelular: canais de receptores rianodina (RyRs), e canais de receptores d-mio-inositol 1,4,5-trifosfato (IP3Rs) (HILLE, 2001). Os RyRs e IP3Rs são canais de Ca2+ de alta condutância e estão expressados na endomembrana de revestimento do ER. Esses canais apresentam ativação regenerativa, ou seja, ativação em onda dos

receptores da endomembrana de revestimento do ER (BERRIDGE, 1998; BERRIDGE, 2002; NAKAMURA et al., 1999), gerando amplificação do sinal de Ca2+_{. Embora os RyRs e IP3Rs medeiam} liberação de Ca2+ de seus respectivos estoques, eles diferem quanto aos mecanismos de ativação.

A liberação de Ca2+ _{via RyRs se dá por aumento da concentração} dos íons Ca2+ _{no citosol, num processo denominado “liberação de} Ca2+ induzida por Ca2+” (CICR) (HILLE, 2001). Os íons que desencadeiam a CICR são oriundos do influxo de Ca2+ através dos VGCCs e dos LOCs, localizados na membrana plasmática. Dessa forma, a CICR é um mecanismo em que pequenos transientes de Ca2+ são amplificados em transientes de Ca2+ _{muito maiores. O fenômeno} da CICR vem sendo muito estudado em miócitos cardíacos, onde é essencial ao funcionamento dos mecanismos de excitação-contração subjacentes à atividade muscular cardíaca (FABIATO & FABIATO, 1975). O fenômeno também foi identificado em neurônios dos sistemas nervoso periférico (LIPSCOMBE et al., 1988; HUA et al., 1993; COHEN et al., 1997; USACHEV & THAYER, 1999) e central (KANO et al., 1995; JACOBS & MEYER, 1999). Especificamente em neurônios, a CICR tem participação importante nos processos de regulação da excitabilidade de membrana (LI & HATTON, 1997; MOORE et al., 1998) e liberação de neurotransmissores por

exocitose (PENG, 1996; SMITH & CUNNANE, 1996). O fenômeno da liberação de Ca2+ _{induzida por IP}

3 (IICR) é produzido por aumento da concentração de IP3 no citosol (HILLE, 2001); alguns subtipos de IP3Rs são produzidos por aumento da [Ca2+]i (BERRIDGE, 1998).

O IP3 é liberado no citosol após clivagem de lipídios da membrana plasmática, por ação da enzima fosfolipase C (PLC) que, por sua vez, está funcionalmente acoplada a receptores da superfície celular (BERRIDGE, 1993). Esses receptores de superfície são ativados por ligantes e recebem a denominação de receptores metabotrópicos. A ativação desses receptores desencadeia cascatas sinalizadoras que resultam em liberação intracelular de segundos mensageiros, tais como IP3, íons Ca2+_{, e diacilglicerol} (ALBERTS, 1994). Os ligantes que ativam os receptores metabotrópicos, assim como os que ativam receptores ionotrópicos, podem ser produzidos pela própria célula-alvo, por uma célula do mesmo tecido, ou por uma célula de outra parte do corpo. Nesse último caso, os ligantes são levados à célula-alvo pela corrente sanguínea. Consequentemente, as vias de liberação e influxo de Ca2+ podem ser controladas por ligantes fisiológicos produzidos à distância. Os mecanismos fisiológicos que envolvem a IICR incluem exocitose de hormônios gonadotróficos da hipófise (TSE et al., 1997) e ativação de plaquetas por trombina (BRASS &

JOSEPH, 1985). Muitas células expressam tanto CICR como IICR (IINO, 1987; KHODAKHAH & ARMSTRONG, 1997; GOLOVINA & BLAUSTEIN, 2000; BOLTON et al., 1999).

A co-expressão desses dois mecanismos sugere que os RyRs e IP3Rs são regulados de forma independente, podendo haver interações importantes entre eles. Além de funcionarem como reservatório, os estoques intracelulares de Ca2+ _{também desempenham papel ativo} nos mecanismos de sinalização do íon. Um exemplo já mencionado é o da depleção de Ca2+ ativando os SOCs e, consequentemente, influxo de Ca2+. Além disso, o mecanismo de abertura dos RyRs e IP3Rs está condicionado ao grau de enchimento dos estoques de Ca2+ _{(FRIEL & TSIEN, 1992; USACHEV & THAYER, 1999; BERRIDGE,} 1998). Sendo assim, níveis elevados de Ca2+ nos estoques facilitam abertura desses canais (BERRIDGE, 1998).

3.3 MECANISMOS DE TRANSPORTE DE CÁLCIO

Para manterem o funcionamento da sinalização de Ca2+_{, as} células expressam sistemas de transporte em suas membranas e endomembranas. O bombeamento dos íons Ca2+ _{para fora do citosol}

garante manutenção da [Ca2+_]

i em níveis baixos (na ordem de 10-7 M).

Esses sistemas de transporte consistem em: ATPases de Ca2+ presentes na membrana plasmática; ATPases de Ca2+ presentes na endomembrana do ER; e trocadores de Na+/Ca2+. As ATPases utilizam energia da hidrólise de ATP para abastecerem os estoques intracelulares de Ca2+ _{(ATPases de Ca}2+ _{na endomembrana do ER, ou} bombas SERCA), e extrusão do íon para o meio extracelular (ATPases de Ca2+ na membrana plasmática, ou bombas PMCA). Essas bombas fazem ligação de alta afinidade com o Ca2+, permitindo captação e extrusão do íon, mantendo as [Ca2+_]

i em níveis submicromolares. O trocador de Na+_/Ca2+ _{é outro mecanismo de} transporte na membrana plasmática e está presente em células que acoplam gradientes eletroquímicos de Na+ e Ca2+ (BLAUSTEIN & LEDERER, 1999). Dependendo do potencial de membrana e das concentrações intra e extracelulares dos íons, o trocador de Na+_/Ca2+ _{pode mediar influxo de Na}+ _{e efluxo de Ca}2+_{, ou vice} versa. Devido a essa reversibilidade de transporte, cinética rápida, e expressividade elevada em miócitos cardíacos, o trocador de Na+_/Ca2+ _{tem papel de destaque nos potenciais de ação} cardíacos e transientes de Ca2+ _associados.

3.4 NERVO VAGO

O nervo vago, também conhecido como décimo nervo craniano (NC X), inerva várias estruturas viscerais, incluindo coração, grandes vasos, pulmões, traquéia, pâncreas, estômago, intestinos delgado e grosso, e faringe (MEI, 1983; BERTHOUD & NEUHUBER, 2000). O nervo vago carreia informações motoras e sensoriais desses órgãos (MEI, 1983). Algumas observações sugerem que a atividade nervosa vagal tem influência importante sobre o sistema nervoso central (GEORGE et al., 2000). Por exemplo, a estimulação do nervo vago pode melhorar os sintomas da depressão grave e epilepsia (RUSH et al., 2000). Permanecem desconhecidos os mecanismos fisiológicos que coordenam a melhora desses sintomas. No entanto, esses achados sugerem que o nervo vago tem influência no sistema nervoso central, além da já conhecida influência sobre as vísceras.

3.4.1 Neurônios vagais motores

O componente motor (eferente) do nervo vago é parte do ramo parassimpático do sistema nervoso autonômico e controla a fisiologia de muitas vísceras. Exemplos de funções autonômicas controladas pelo nervo vago incluem freqüência cardíaca e tônus gástrico.

3.4.2 Neurônios vagais sensitivos

Tradicionalmente, devido a seu papel na função autonômica, o nervo vago é considerado um nervo motor. No entanto, o nervo vago é misto e contém fibras nervosas sensitivas e motoras, sendo que as fibras sensitivas compõem 80% do nervo vago. Essas fibras inervam grande variedade de estruturas viscerais,

estruturas da cabeça e do pescoço, e carreiam uma variedade de informações sensitivas, incluindo quimio-, termo-, barocepção e paladar da região faríngea.

Anatomicamente, os neurônios sensitivos vagais são pseudounipolares (MEI, 1983; BERTHOUD & NEUHUBER, 2000) e apresentam eixo axonal curto conectado a um axônio longo. Os corpos celulares (somata) estão alojados nos gânglios vagais inferiores (nodoso) e superiores (jugular). O axônio longo se projeta para a periferia (processo periférico) e para o sistema nervoso central (processo central). Os processos periféricos dos neurônios sensitivos vagais carreiam informações das estruturas viscerais e, consequentemente, expressam muitos receptores especializados, incluindo mecano-, termo-, e quimioreceptores. Os processos centrais dos neurônios sensitivos vagais fazem sinapse com os núcleos dos tratos solitários (NTSs) do tronco encefálico. A figura 2 mostra a anatomia do nervo vago e do gânglio nodoso.

O presente estudo utiliza neurônios do gânglio vagal inferior, ou neurônios do gânglio nodoso. Os neurônios

sensitivos vagais são encontrados somente no GN, e são críticos na homeostase autonômica-visceral.

Esses neurônios têm atividade sensitiva vagal central e periférica (HAY & KUNZE, 1994; MOORE et al., 1999), o que os torna modelos representativos da fisiologia de ambas as regiões. Manter o funcionamento desses neurônios é essencial à integração dos sinais viscerais com o sistema nervoso central e seus reflexos autonômicos subsequentes.

Nervo Vago

Pulmões

Coração

Laringe

Traquéia

Brônquios

Gânglio

Nodoso

Trato

Gastrointestinal

3.5 FISIOLOGIA DO CÁLCIO NOS NEURÔNIOS DO GÂNGLIO

NODOSO

Os transientes de Ca2+ são produzidos nos neurônios do GN por diversos mecanismos, incluindo CICR e influxo de Ca2+ controlados por voltagem e por ligante. O mecanismo de influxo de Ca2+ controlado por voltagem foi bem estudado em neurônios do GN (MENDELOWITZ & KUNZE, 1992; MOORE et al., 1998; CORDOBA-RODRIGUEZ et al., 1999). Os neurônios do GN expressam os seguintes subtipos de VGCCs: L, N, R e T. Cada subtipo de VGCC tem papel fisiológico específico nesses neurônios. O mecanismo de influxo de Ca2+ controlado por ligante também foi demonstrado nos neurônios do GN. Alguns exemplos: influxo produzido por ATP através de receptores P2X (VIRGINIO et al., 1998), influxo produzido por acetilcolina através de receptores nicotínicos (COOPER, 2001), e influxo produzido por capsaicina através de receptores vanilóides (BIELEFELDT, 2000). Todos os neurônios do GN apresentam o fenômeno da CICR. Cafeína, um agonista clássico da CICR, também desencadeia influxo de Ca2+ _{em neurônios do GN de} coelhos por ativação de uma corrente de Ca2+ _{não-seletiva (HOESCH} et al., 2001). Os neurônios do GN também apresentam o fenômeno da IICR (HOESCH et al., 2002).

A capacidade de disparar potenciais de ação é a propriedade mais importante de um neurônio. O estudo da fisiologia dos potenciais de ação é, portanto, crítico para entendimento da função neuronal. Em neurônios do GN, os potenciais de ação ativam os VGCCs. O influxo de Ca2+ resultante produz a CICR e, consequentemente, transientes de Ca2+ _{(COHEN et al., 1997). Em} neurônios do GN, os transientes de Ca2+ _{produzidos em resposta} aos potenciais de ação ativam correntes de K+ _{que hiperpolarizam} a membrana. Essa hiperpolarização dura vários segundos após o potencial de ação, e é denominada hiperpolarização lenta pós-potencial de ação (sAHP). A sAHP regula a excitabilidade de membrana (WEINREICH & WONDERLIN, 1987), reduzindo a freqüência dos potenciais de ação. A IICR também ativa correntes de K+ em neurônios do GN (HOESCH et al., 2004). Coletivamente, essas observações sugerem que os receptores ionotrópicos e metabotrópicos modulam a excitabilidade dos neurônios do GN, e que o cálcio de destaque nesse processo.

3.6 RECEPTOR DE POTENCIAL TRANSIENTE

A superfamília dos canais receptor de potencial transiente (TRP) tem participação na [Ca2+_]

i como via de influxo do íon e, em alguns casos, via de liberação intracelular. Todos os TRPs apresentam seis domínios transmembranosos, organizados em canais de cátions, cuja permeabilidade aos diferentes cátions varia entre as isoformas. Em mamíferos, a superfamília dos canais TRP se subdivide em sete famílias, a saber: família TRPC (canônica), família TRPV (vanilóide), família TRPM (melastatina), família TRPP (policistina), família TRPML (mucolipina), família TRPA (anquirina), e família TRPN (NOMPC) (MONTELL, 2002; MORAN et al., 2004; TURNER et al., 2003). A figura 3 mostra uma árvore filogênica da superfamília dos TRPs. Essas famílias não foram totalmente caracterizadas, mas estão ganhando interesse crescente devido ao seu envolvimento em várias doenças humanas. Os canais de influxo de Ca2+ compreendem: todos os TRPCs; todos TRPVs; TRPM1, 2, 3, 6, 7, e 8; TRPA1; TRPP2, 3, e 5; e TRPML1, 2, e 3. Desses, destacamos os canais TRPV1 e TRPM8, que também funcionam como canais de liberação de Ca2+ _{intracelular (TURNER} et al., 2003; VENNEKENS et al., 2000).

(PERDERSEN et al., 2005)

3.6.1 Família Vanilóide

A família vanilóide (TRPV), com base em sua estrutura e função, compreende quatro grupos nos mamíferos: TRPV1/TRPV2, TRPV3, TRPV4 e TRPV5/6. TRPV5 e 6 são os únicos canais de Ca2+ seletivos da família TRPV, e são intimamente regulados pela [Ca2+]i (NILIUS et al., 2000; BENHAM, 2002; VENNEKENS et al., 2000). Os TRPV1-4 são canais de cátion não-seletivos e termossensíveis, embora TRPV1 e 4 são também ativados por vários outros estímulos (NILIUS et al., 2003; NILIUS et al., 2004; HELLIWELL, 1998; BENHAM et al., 2002).

3.6.2 Receptor Vanilóide do tipo 1

O receptor vanilóide do tipo 1 (TRPV1) foi o primeiro membro da família vanilóide a ser identificado em mamíferos, e o único estudado mais extensivamente. O RNA mensageiro (mRNA) do TRPV1 é encontrado predominantemente em neurônios aferentes primários do tipo nociceptivo, cujos corpos celulares residem nos gânglios da raíz dorsal, trigeminal, ou nodoso (CATERINA et al., 1997; SZALLASI et al., 1995; CATERINA et al., 2000; HELLIWELL et al., 1998).

O TRPV1 tem participação importante nos fenômenos nociceptivos. Um estudo com animais nocauteados para este canal confirmou sua função de detectar e integrar os estímulos dolorosos térmicos e químicos (CATERINA et al., 2000; PEDERSEN et al., 2005). O canal TRPV1 é o único ativado por compostos vanilóides, tais como capsaicina, resiniferatoxina, e olvanila, assim como vários outros estímulos, como calor moderado (≥43 °C), pH baixo (≤5.9), ligante de receptor canabinóide anadamida, eicosanóides 12-(S)-HPETE, 15-(S)-12-(S)-HPETE, 5-(S)-HETE, e leucotrieno B4 (PEDERSEN et al., 2005).

3.6.3 Receptor Vanilóide do tipo 1 nas doenças

O canal TRPV1 é o mais bem caracterizado da família dos TRPVs. Consequentemente, não é surpresa que esteja conectado a um amplo espectro de doenças. O TRPV1 participa de disfunções dolorosas sensitivas, tais como dor neuropática, hiperestesia, hiperalgesia, alodínia, e dor espontânea em queimação. Estudos com ratos nocauteados para o TRPV1 expandiram o conhecimento sobre a fisiologia deste canal.

A sensibilidade aos estímulos dolorosos está reduzida em ratos nocauteados para o TRPV1, e não há hiperalgesia térmica induzida por inflamação (CATERINA et al., 2000; DAVIS et al., 2000). Em humanos, a dor neuropática tende a ser crônica e debilitante, ocorrendo em condições como neuralgia trigeminal, neuropatia diabética, neuralgia pós-herpética, câncer terminal, amputação, e traumatismo nervoso. Estas condições estão relacionadas aos canais TRPVs, em especial TRPV1 e 4. A densidade de canais TRPV1 está aumentada em pacientes com doenças gastrointestinais dolorosas, tais como doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, e colite ulcerativa (GEPPETTI & TREVISANI, 2004; YIANGOU et al, 2001). Nas osteoartrites dolorosas há sensibilização do canal TRPV1 e aumento de sua densidade nas articulações sinoviais (SZABO et al., 2005). O TRPV1 também está presente nos neurônios aferentes cardíacos, controlando os reflexos simpáticos cardiogênicos e nocicepção em eventos isquêmicos cardíacos (ZAHNER et al, 2003; PAN & CHEN, 2004). A ativação do TRPV1 contribui para a doença de refluxo gastroesofágico (GERD), na qual os pacientes podem apresentar sintomas de queimação cardíaca e dor torácica (MATTHEWS et al., 2004). Além disso, o canal TRPV1 também participa do controle de hipertensão induzida por ingesta de sal.

Administração do agonista capsaicina em ratos neonatos causa degeneração dos neurônios sensoriais que expressam o canal TRPV1. Há então aumento exagerado da pressão sanguínea dos ratos após ingesta de sal, sugerindo que o canal participa do controle deste processo (VAISHNAVA & WANG, 2003; WANG, 2005). Outro papel do TRPV1 foi reconhecido nas doenças da bexiga urinária, onde a ativação do canal produz sintomas de hiperreflexia visceral e hiperalgesia inflamatória. Essa sintomatologia é imediatamente revertida com o uso de antagonistas seletivos do TRPV1 (DINIS et al., 2004). Como esperado, ratos nocauteados para o TRPV1 não desenvolvem estes sintomas (BIRDER et al., 2002). O TRPV1 agrava o reflexo de tosse em doenças respiratórias. Em pacientes com tosse crônica, a densidade do canal está aumentada em neurônios que inervam as vias aérias (GRONEBERG et al., 2004). As possibilidades terapêuticas de interferência na atividade do TRPV1 incluem bloqueio do canal por uso de antagonistas seletivos, e dessensibilização do mesmo por uso de agonistas. A combinação de agonistas para dessensibilização do TRPV1, e remoção microcirúrgica dos neurônios nociceptivos, poderiam teoricamente ser utilizados no tratamento de hiperalgesia inflamatória, hiperatividade de bexiga urinária, emese, câncer, e toxicidade neuronal.

No entanto, devido a maior parte dos agonistas desse canal produzirem efeitos colaterais, sobretudo no sistema respiratório, é recomendado o uso de antagonistas específicos do TRPV1 (APPENDINO et al., 2005).

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 ANIMAIS

Eram estudados ratos Sprague Dawley, pesando entre 120 a 200 g, adultos, do sexo masculino. A dieta dos animais era normocalórica, normolipídica e normoprotéica.

4.2 DISSECÇÃO DOS NEURÔNIOS DO GÂNGLIO NODOSO

Os animais eram sacrificados por inalação de CO2, conforme aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Maryland, Baltimore. As massas corporais dos animais eram então medidas por uma balança apropriada. Em seguida, os animais eram fixados a uma bancada de dissecção.

A região cervical anterior dos mesmos recebia um corte longitudinal mediano. Com a ajuda de um separador, a traquéia era rebatida para que o nervo vago fosse bem visualizado. Usando-se tesoura de dissecção, o tecido conjuntivo era afastado e o nervo vago seguido até o GN. Quando o GN era visualizado, realizava-se um corte na porção distal a ele, seguido de outro corte proximal. O gânglio, juntamente com uma parte do nervo vago, era inteiramente retirado. Durante esse procedimento, a região inteira era banhada com solução salina balanceada de Hanks (HBSS; Apêndice A) gelada. Em seguida, o tecido retirado era transferido para uma placa de Petri. Realizava-se então a dissociação mecânica, com retirada de grande parte do conjuntivo aderido ao gânglio. Essa dissociação era auxiliada com um estereoscópio, que possibilitava distinção entre tecido conjuntivo e gânglio.

4.3 DISSOCIAÇÃO E CULTURA DOS NEURÔNIOS

Os neurônios do GN eram dissociados enzimaticamente e mecanicamente como descrito previamente (JAFRI et al., 1997; Apêndice B). Os gânglios eram rapidamente dissecados e o tecido conjuntivo cuidadosamente removido.

Os gânglios dissecados eram então colocados numa solução contendo 10 mg de colagenase tipo 1A (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, EUA), 10 mg de dispase II (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, EUA), 10 ml de HBSS livre de Ca2+ e Mg2+, e 2 µl de NaOH (1 M). A solução contendo os gânglios ficava em incubadeira a 37°C por 120 minutos. Ao término desse tempo, os neurônios do GN eram dissociados através de pipeta de Pasteur com diâmetro reduzido em chama (Apêndice B). O material passava então por três centrifugações consecutivas, a 700 G por 45 segundos (Apêndice B). Nos intervalos das centrifugações, o sobrenadante era aspirado a vácuo e o depósito de neurônios era ressuspenso em outra solução contendo meio de Leibovitz (L-15) (Gibco, BRL, Rockville, MD, EUA; Apêndice A) e 10% de soro fetal bovino (FBS) (JRH Bioscience, Lenexa, KN, EUA). Os neurônios eram então plaqueados em discos de vidro de 25 mm (Fisher, Newark, DE, EUA) cobertos com poli-d-lisina (0.1 mg ml-1_{, Sigma Chemical Co., St} Louis, MO, EUA; Apêndice B). Os neurônios plaqueados eram incubados a 37˚C por duas horas. Após esse período, 2 ml da solução de L-15 e FBS eram adicionados aos pratos, que eram então colocados numa estufa à temperatura ambiente (Apêndice B). As células estavam em condições experimentais após duas horas e podiam ser usadas até 48h de cultura (Apêndice B).

4.4 CÉLULAS TRANSFECTADAS

As células renais embrionárias humanas (HEK293) estáveis eram transfectadas com os canais TRPV1. As células eram gentilmente cedidas pelo Doutor Michael Caterina (Johns Hopkins University, Baltimore, MD, EUA). As células HEK293 transfectadas com o canal, bem como as do tipo selvagem, foram mantidas a temperatura de 37 0C, em 5% de CO2 em Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM, Life Technologies Rockville, MD) e 10% de soro bovino fetal (FBS, Life Technologies). Tanto as células HEK293 transfectadas quanto as do tipo selvagem eram utilizadas somente após 24 horas da transfecção.

4.5 PERFUSÃO NEURONAL

Os neurônios eram perfundidos com solução de Locke, que apresentava a seguinte composição (mM): 136 de NaCl, 5,6 de KCl, 7,2 de NaH2PO4, 14,3 de NaHCO3, 1,2 de MgCl2, 2,2 de CaCl2, e 10,0 de dextrose; a solução era equilibrada com 95% de O2 e 5% de CO2. Nos experimentos em que o meio livre de Ca2+ _{era necessário, o} CaCl2 era substituído por MgCl2.

4.6 CÂMARA DE REGISTRO

Uma câmara de registro convencional, com via de fluxo retangular de 200 µl, funcionava como percurso para as soluções de Locke normal ou livre de Ca2+_{. A perfusão era feita por um} sistema de fluxo pela gravidade (4 ml/min). A solução era renovada a cada 14 segundos, conforme determinado pelo manual do marcador fluorescente. A câmara de registro estava montada sobre um microscópio invertido (TE200; Nikon, Tóquio, Japão) equipado com objetiva transmissora de radiação ultravioleta (SuperFluor, 40X, N. A. 1.4, Nikon). A objetiva permitia visualização direta dos neurônios ou medição de fluorescência.

4.7 IMAGEM DE CÁLCIO

No estudo dos transientes de cálcio era utilizado um indicador fluorescente conhecido como FURA-2-AM. Antes dos experimentos, as células eram carregadas com 1 µM do indicador por 45 a 60 minutos, à temperatura ambiente. O indicador tem a capacidade de atravessar a membrana plasmática. No interior da célula há clivagem do grupamento éster, permitindo retenção do indicador (KAO, 1994).

Após esta etapa, o disco contendo as células carregadas de FURA-2-AM era acoplado à câmara de registro, com perfusão contínua de solução de Locke normal ou livre de Ca2+_{. A medição da} fluorescência era feita com um espectrofotômetro de excitação dual operando em modo microfluorimétrico. O espectrofotômetro estava acoplado ao microscópio invertido por um cabo de fibra ótica. A célula em estudo era excitada alternadamente por radiações de 340 nm e 380 nm obtidas em dois monocrônomos (Deltascan Illumination System, Photonic Technology International (PTI), South Brunswick, NJ); a fluorescência de 510 nm emitida passava por um dicromo e daí para um tubo fotomultiplicador (D-104 microscope photomultiplier, PTI) com sinal digitalizado (COHEN et al., 1997). A aquisição e análise das imagens eram feitas pelo software Felix 1.1 (PTI), e a razão obtida das duas excitações correspondia à variação de cálcio livre no citoplasma (Figura 4). A fluorescência obtida era corrigida para auto-fluorescência através de medição prévia em ambiente sem a presença de células. A [Ca2+]i aparente era calculada a partir da razão de fluorescência R, pela seguinte equação:

[Ca2+_]

i = K_d(R R_min)/(R_max R)(s_f,2/s_b,2) , onde K_d era a constante

de ligação efetiva, Rmin o valor limite de fluorescência do indicador livre de Ca2+_{, e Rmax o valor limite de fluorescência do} indicador saturado com Ca2+. Experimentalmente, o fator sf,2/sb,2 era a razão da intensidade de fluorescência medida quando todos os indicadores estavam livres de Ca2+ _{sobre a intensidade de} fluorescência medida quando todos os indicadores estavam ligados ao Ca2+ _{(GRYNKIEWICZ et al., 1985). Essas constantes de} calibração eram determinadas experimentalmente tanto para o set-up quanto para as condições experimentais utilizadas.

4.8 REAGENTES

Os reagentes eram comprados dos seguintes vendedores: da empresa Sigma, cafeína, capsaicina; da empresa Calbiochem (La Jolla, CA), ácido ciclopiazônico; da empresa Biomol International (Plymouth Meeting, PA), N-(4-t-Butilfenil)-4-(3-cloropiridina-2-yl)tetrahidropirazina-1(2H)-carboxamida (BCTC); da empresa Molecular Probes (Eugene, OR), éster de acetoximetil de FURA-2 (FURA-2-AM); da empresa Teflabs (Austin, TX), sal de pentapotássio de FURA-2 (Austin, TX); da empresa Tocris (Ellsville, MO), iodoresiniferatoxina (IRTX).

As soluções contendo os reagentes eram preparadas diariamente a partir de soluções de estoque armazenadas no refrigerador. As soluções contendo os reagentes eram colocadas no meio do experimento por abertura de válvulas de três vias. Cada válvula era ligada a um reservatório contendo uma concentração conhecida do reagente em solução de Locke normal ou livre de Ca2+_{. Quando} necessário, os neurônios eram perfundidos com solução de Locke livre de Ca2+ _{antes da aplicação do reagente específico. As} concentrações dos reagentes eram: 10 mM de cafeína; 100 nM de IRTX; 175 nM de BCTC; 5 µM de ácido ciclopiazônico (CPA); 50 nM de capsaicina.

4.9 ANÁLISE DE DADOS

Nossos dados eram analisados e convertidos em gráficos no programa SigmaPlot 2000 (SPSS, Chicago, IL). As análises estatísticas eram realizadas no programa SigmaStat 2.0 (SPSS) e os resultados expressos em média ± erro padrão. A significância estatística era avaliada pelo teste ANOVA combinado com Student-Newman-Keuls, que comparavam os pares de resultados. P < 0,05 indicava significância estatística.

5.RESULTADOS

Os neurônios do GN de ratos adultos apresentaram transientes de Ca2+ consideráveis após uma breve aplicação de cafeína. A aplicação da cafeína (10 mM, 15 s) produziu transientes de Ca2+ induzidos por cafeína em todas as células estudadas, com amplitude média de 394 ± 32 nM (n = 44). As amplitudes dos CICTs foram consistentes no decorrer do experimento. Em quatro neurônios, a aplicação de cafeína (10 mM, 15 s) produziu transientes de Ca2+ _{que não apresentaram diferença significativa} (p > 0,05) entre si (Gráfico 1). As amplitudes médias foram de 218 ± 20 nM, 221 ± 24 nM, e 213 ± 35 nM para a primeira, segunda e terceira aplicações, respectivamente (n = 4; Gráfico 1).

Cafeína

50 nM

30 s

Gráfico 1 – Avaliação da reprodutibilidade dos transientes de Ca2+ induzidos por cafeína em solução de Locke normal. Três aplicações de cafeína (10 mM, 15 s) produziram três CICTs em solução de Locke normal. As amplitudes médias dos CICTs foram de 218 ± 20 nM, 221 ± 24 nM, e 213 ± 35 nM (n = 4) para a primeira, segunda e terceira aplicações, respectivamente. Os transientes de Ca2+ _{não apresentaram diferenças significativas entre si. (p >} 0,05).

Para avaliarmos a participação do Ca2+ _{extracelular nos} CICTs dos neurônios do GN de ratos aplicamos cafeína (10 mM, 15 s) nos mesmos, em solução de Locke normal ou em solução de Locke livre de Ca2+. A amplitude dos CICTs foi reduzida de forma significativa em solução de Locke livre de Ca2+. Os transientes de Ca2+ _{induzidos por cafeína em solução normal de Locke tiveram} amplitude média de 304 ± 32 nM (n = 6; Gráfico 2). Os CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ _{tiveram amplitude} média de 122 ± 29 nM (n = 6; Gráfico 2). Houve redução média de 54 ± 9% dos valores de controle (n = 6; Gráfico 2). Após lavagem em solução de Locke normal, a amplitude média dos CICTs retornou a dos valores de controle, 286,4 ± 28 nM (n = 6; Gráfico 2). Esses resultados sugerem que os neurônios do GN de ratos, assim como os neurônios do GN de coelhos, apresentam a via de influxo de Ca2+ _{induzida por cafeína.}

Outra forma de avaliarmos a participação do Ca2+ extracelular nos CICTs dos neurônios do GN de ratos é pelo esvaziamento dos seus estoques intracelulares dependentes da CICR. Uma aplicação inicial de cafeína (10 mM; 15 s) em solução de Locke normal produziu CICTs com amplitude média de 332 ± 64 nM (n = 5; Gráfico 3).

Cafeína

Livre de Ca

100 nM

30 s

Gráfico 2 – Avaliação da participação do Ca2+ extracelular nos transientes de Ca2+ induzidos por cafeína. O primeiro e o terceiro CICTs foram produzidos por cafeína (10 mM, 15 s) em solução de Locke normal. O segundo CICT foi produzido por cafeína (10 mM, 15 s) em solução de Locke livre de Ca2+_{. A} diferença de amplitude entre a média dos CICTs de controle e o segundo CICT representa o influxo através da membrana plasmática. A amplitude dos CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ foi de 54 ± 9% da amplitude dos CICTs de controle (n = 6) produzidos em solução de Locke normal.

Para esvaziamento dos estoques intracelulares dependentes da CICR, selecionamos o ácido ciclopiazônico (CPA), que é um inibidor da Ca2+ _{ATPase (bomba SERCA) do retículo endoplasmático} (SEIDLER et al., 1989). O CPA bloqueia recaptação de Ca2+ a partir do citosol (THOMAS & HANLEY, 1994). Aplicamos CPA (5 µM) continuamente por 16 minutos. O esvaziamento dos estoques referidos foi acelerado por duas aplicações iniciais e sucessivas de cafeína (10 mM; 15 s; n = 5; Gráfico 3), em solução de Locke normal, em presença continuada de CPA. Para demonstrarmos o pleno esvaziamento dos estoques referidos, aplicamos cafeína (10 mM; 15 s) em solução de Locke livre de Ca2+_{, em presença continuada de CPA. Como esperado, a cafeína não} produziu CICTs (n = 5; Gráfico 3). Por último, para demonstrarmos a participação do Ca2+ extracelular nos CICTs, aplicamos cafeína (10 mM; 15 s) em solução de Locke normal, em presença continuada de CPA. O CPA produziu CICTs com amplitude média de 105 ± 23 nM (n = 5; Gráfico 3). Esses resultados sugerem que os neurônios do GN de ratos apresentam influxo de Ca2+ induzida por cafeína.

Cafeína

Livre de Ca

CPA

2 min 200 nM

Gráfico 3 - Avaliação da participação do Ca2+ extracelular nos transientes de Ca2+ induzidos por cafeína. Cafeína (10 mM; 15 s) produziu CICTs de controle com amplitude média de 332 ± 64 nM (n = 5). Em seguida, CPA (5 µM) foi aplicado de forma continuada para esvaziamento dos estoques de Ca2+ _{dependentes da CICR. Duas} aplicações sucessivas de cafeína (10 mM; 15 s) aceleraram o esvaziamento dos estoques. Em seguida, aplicação de cafeína (10 mM; 15 s) não produziu CICTs em solução de Locke livre de Ca2+ (n = 5). Por último, aplicação de cafeína (10 mM; 15 s) produziu CICTs em solução de Locke normal (n = 5), demonstrando a participação do Ca2+ extracelular nos CICTs.

Para determinarmos o envolvimento do canal TRPV1 nos CICTs, utilizamos dois antagonistas seletivos do canal TRPV1, iodoresiniferatoxina (IRTX, 100 nM; WAHL et al, 2001) e N-(4-t-

Butilfenil)-4-(3-cloropiridina-2-yl)tetrahidropirazina-1(2H)-carboxamida (BCTC, 175 nM; POMONIS et al., 2003; VALENZANO et al., 2003). Ambos os antagonistas inibiram os transientes de Ca2+ produzidos pelo agonista seletivo do canal TRPV1, capsaicina (50 nM), em mais de 90% dos neurônios estudados (n = 4 para cada antagonista, dados não mostrados).

O antagonista seletivo do canal TRPV1, IRTX, reduziu de forma significativa a amplitude dos CICTs. As amplitudes médias dos CICTs em solução de Locke normal e em solução de Locke normal com IRTX (100 nM) foram de 405 ± 114 nM e 205 ± 53 nM, respectivamente (n = 9; Gráfico 4). A amplitude média dos CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ _{foi de 220 ± 55 nM} (n = 9; Gráfico 4). Os CICTs produzidos em solução de Locke normal com IRTX (100 nM) e os CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ foram registrados na mesma célula e não apresentaram diferença significativa (p = 0,814) entre si.

Cafeína

Livre de Ca

IRTX

300 nM

1 min

Gráfico 4 – Avaliação da participação do canal TRPV1 nos transientes de Ca2+ induzidos por cafeína. O antagonista seletivo do canal TRPV1, IRTX (100 nM), reduziu de forma significativa as amplitudes dos CICTs. As amplitudes dos CICTs em presença de solução de Locke normal com IRTX foram diferentes das amplitudes dos CICTs de controle (p = 0,001; n = 9). As amplitudes dos CICTs registrados em presença de solução de Locke normal com IRTX não foram diferentes das amplitudes dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ (p = 0,814; n = 9).

Zero Ca2+

IRTX

%

Inibição

Gráfico 5 – Avaliação das porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ e em solução de Locke normal com IRTX. As porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ _{e registrados} em solução de Locke normal com IRTX foram de 43 ± 6% e 45 ± 8%, respectivamente.

As porcentagens de inibição média dos CICTs em solução de Locke livre de Ca2+ _{e em solução de Locke normal com IRTX foram de 43 ±} 6% e 45 ± 8%, respectivamente (Gráfico 5).

Para determinarmos se a IRTX bloqueou o influxo de Ca2+ induzido por cafeína, comparamos os CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ com os CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ _{com IRTX, registrados na mesma célula. As} amplitudes médias dos CICTs produzidos foram de 398 ± 73 nM em solução de Locke normal, 244 ± 53 nM em solução de Locke livre de Ca2+, e 231 ± 53 nM em solução de Locke livre de Ca2+ com IRTX (n = 5; Gráfico 6). As amplitudes médias dos CICTs em solução de Locke livre de Ca2+ _{e em solução de Locke livre de Ca}2+ _{com IRTX} não apresentaram diferença significativa (p = 0,773) entre si. As porcentagens de inibição média dos CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ e dos CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ _{com IRTX foram de 39 ± 11% e 43 ± 11%,} respectivamente (Gráfico 7). Esses resultados sugerem que o influxo de Ca2+ _{induzido por cafeína se dá por ativação do canal} TRPV1.

Cafeína

Livre de Ca

IRTX

1 min 200 nM

Gráfico 6 – Avaliação do antagonista seletivo do canal TRPV1 no bloqueio do influxo de Ca2+ induzido por cafeína. A redução observada nos CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ com IRTX foi semelhante à redução observada nos CICTs produzidos somente em solução de Locke livre de Ca2+ _{(p = 0,773; n = 5).}

%

Inibição

Zero Ca2+

Zero Ca2+ IRTX

50

10

Gráfico 7 – Avaliação das porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ e em solução de Locke livre de Ca2+ com IRTX. As porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ _e registrados em solução de Locke livre de Ca2+ _{com IRTX foram de} 39 ± 11% e 43 ± 11%, respectivamente.

Testamos um segundo antagonista seletivo para eliminarmos a possibilidade do IRTX ter reduzido os CICTs independente de

bloquear o canal TRPV1. O antagonista seletivo do canal TRPV1, o BCTC, reduziu de forma significativa a amplitude dos CICTs. As amplitudes médias dos CICTs em solução de Locke normal e em solução de Locke normal com BCTC (175 nM) foram de 572 ± 73 nM e 395 ± 64 nM, respectivamente (n = 8; Gráfico 8). A amplitude média dos CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ _foi de 382 ± 59 nM (n = 8; Gráfico 8). Os CICTs produzidos em solução de Locke normal com BCTC (175 nM) e os CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ foram registrados na mesma célula e não apresentaram diferença significativa (p = 0,584) entre si. As porcentagens de inibição média dos CICTs em solução de Locke livre de Ca2+ _{e em solução de Locke normal com BCTC} foram de 33 ± 4% e 34 ± 3%, respectivamente (Gráfico 9).

Em seguida, testamos se o BCTC teve outros efeitos sobre os CICTs além de bloquear o influxo de Ca2+ _{induzido por cafeína.} Para isso, comparamos os CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ com os CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ _{com BCTC, registrados na mesma célula.}

Cafeína

Livre de Ca

BCTC

200 nM

1 min

Gráfico 8 – Avaliação da participação do canal TRPV1 nos transientes de Ca2+ induzidos por cafeína. O antagonista seletivo do canal TRPV1, BCTC (175 nM), reduziu de forma significativa as amplitudes dos CICTs. As amplitudes dos CICTs em presença de solução de Locke normal com BCTC foram diferentes das amplitudes dos CICTs de controle (p < 0,001; n = 8). As amplitudes dos CICTs registrados em presença de solução de Locke normal com BCTC não foram diferentes das amplitudes dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ _{(p = 0,584; n = 8).}

Gráfico 9 – Avaliação das porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ e em solução de Locke normal com BCTC. As porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ _{e registrados} em solução de Locke normal com BCTC foram de 33 ± 4% e 34 ± 3%, respectivamente.

As amplitudes médias dos CICTs produzidos foram de 395 ± 33 nM em solução de Locke normal, 253 ± 25 nM em solução de Locke

livre de Ca2+_{, e 245 ± 35 nM em solução de Locke livre de Ca}2+ _com BCTC (n = 7; Gráfico 10). As amplitudes médias dos CICTs em solução de Locke livre de Ca2+ _{e em solução de Locke livre de Ca}2+ com BCTC não apresentaram diferença significativa (p = 0,794) entre si. As porcentagens de inibição média dos CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ _{e dos CICTs produzidos em} solução de Locke livre de Ca2+ _{com BCTC foram de 36 ± 4% e 38 ±} 7%, respectivamente (Gráfico 11). A tabela 1 resume os resultados descritos acima.

Finalmente, as porcentagens de inibição média dos CICTs produzidos em solução de Locke normal com IRTX, em solução de Locke normal com BCTC, e em solução de Locke livre de Ca2+_{, 45 ±} 8%, 33 ± 4% e 54 ± 9%, não apresentaram diferenças significativas entre si (p = 0,117; Gráfico 12). Esses achados suportam a conclusão de que os canais TRPV1 podem servir como via de influxo de Ca2+ _{induzida por cafeína nos neurônios do GN} de ratos.

Cafeína

100 nM

1 min

Gráfico 10 – Avaliação do antagonista seletivo do canal TRPV1 no bloqueio do influxo de Ca2+ induzido por cafeína. A redução observada nos CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ com BCTC foi semelhante à redução observada nos CICTs produzidos somente em solução de Locke livre de Ca2+ _{(p = 0,794; n = 7).}

40 50

Gráfico 11 – Avaliação das porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ e em solução de Locke livre de Ca2+ com BCTC. As porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+ e registrados em solução de Locke livre de Ca2+ _{com BCTC foram de} 36 ± 4% e 38 ± 7%, respectivamente.

50 60 70

Gráfico 12 – Avaliação das porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+, em solução de Locke normal com IRTX, e em solução de Locke normal com BCTC. As porcentagens de inibição média dos CICTs registrados em solução de Locke livre de Ca2+_{, em solução de Locke normal com} IRTX e em solução de Locke normal com BCTC, 54 ± 9%, 45 ± 8%, e 33 ± 4%, não foram apresentaram diferenças significativas entre si (p = 0,117).

Tabela 1. Efeito de zero Ca2+ nominal e antagonistas seletivos do TRPV1 sobre os transientes de Ca2+ induzidos por cafeína em neurônios do gânglio nodoso registrados isoladamente

_____________________________________________________________________________

CONTROLE IRTX ZERO Ca2+Locke ZERO Ca2+Locke+IRTX n

304 ± 32 --- 122 ± 29* --- 6 405 ± 114 205 ± 53* 220 ± 55* --- 9 398 ± 73 --- 244 ± 53* 231 ± 53* 5

CONTROLE BCTC ZERO Ca2+Locke ZERO Ca2+Locke + BCTC n

572 ± 73 395 ± 64* 382 ± 59* --- 8 395 ± 33 --- 253 ± 25* 245 ± 35* 7

_____________________________________________________________________________ Os dados estão expressos em nanomolar (nM) (média ± erro padrão).* p < 0,05, quando comparados aos valores de controle correspondentes. n = número de neurônios do gânglio nodoso avaliado em cada protocolo experimental.

Por último avaliamos os CICTs em células HEK293 transfectadas estavelmente com o canal TRPV1. Essas células não apresentaram CICTs, sugerindo que a ativação do canal TRPV1 pela cafeína (10 mM, 15 s), caso haja, se dá de outra maneira nessas

células (n = 5; Gráfico 13). A presença do canal TRPV1 nessas células pôde ser verificada por duas aplicações sucessivas do agonista seletivo do TRPV1, capsaicina (50 nM), que produziu transientes de Ca2+ em todas as células estudadas (n = 5; Gráfico 13). Repetimos os experimentos em células HEK293 sem o canal TRPV1. Essas células não apresentaram transientes de Ca2+ induzidos por cafeína (10 mM, 15 s) e não apresentaram transientes de Ca2+ _{induzidos por capsaicina (50 nM, 10 s) (dados} não mostrados).

Cafeína

Capsaicina

F / F0 = 2

30 s

Gráfico 13 – Avaliação dos CICTs registrados em células HEK293 transfectadas estavelmente com o canal TRPV1. Essas células não apresentaram CICTs (n = 5). Duas aplicações sucessivas do agonista seletivo do TRPV1, capsaicina (50 nM), produziram transientes de Ca2+ em todas as células estudadas (n = 5).

6.DISCUSSÃO

A via de liberação de Ca2+, CICR, se dá pela ativação dos RyRs (ENDO et al. AL, 1970; FABIATO & FABIATO, 1975). A cafeína é o agonista clássico dos receptores rianodina (SITSAPESAN & WILLIAMS, 1990). Nos neurônios do GN de coelhos, a cafeína produz transiente de Ca2+ por liberação de Ca2+ do retículo endoplasmático, e por influxo de Ca2+ através da membrana plasmática (HOESCH et al., 2001). Nossos resultados indicam que os neurônios do GN de ratos também apresentam a via de influxo de Ca2+ _{induzida por cafeína. Estudos eletrofisiológicos em} neurônios do GN de coelhos demonstraram que a via de influxo se dá por um canal catiônico não-seletivo (HOESCH et al., 2001). Esse canal ainda não havia sido identificado.

O receptor vanilóide do tipo 1 (TRPV1) é um bom candidato porque funciona como um canal não-seletivo (CORTRIGHT & SZALLASI, 2004), apresenta diversidade de substâncias ativadoras (INOUE et al., 2003), e está presente em neurônios sensoriais (LASZLO et al., 2004). No presente estudo, apresentamos evidências farmacológicas que sugerem o canal de cátion não-seletivo como sendo o TRPV1.

Inicialmente, comprovamos a participação do Ca2+ _extracelular nos CICTs dos neurônios estudados. Em solução de Locke livre de Ca2+, a aplicação cafeína produziu transientes de Ca2+ reduzidos de forma significativa em 54 ± 9 % dos valores de controle. Em outro experimento, cafeína produziu transientes de Ca2+ _após esvaziamento total dos estoques intracelulares de Ca2+ _{com ácido} ciclopiazônico, que é um inibidor da Ca2+ ATPase do retículo endoplasmático. Em conjunto, esses experimentos demonstraram a presença de uma via de influxo de Ca2+ _{induzida por cafeína nos} neurônios estudados.

Usando dois antagonistas específicos e quimicamente distintos do TRPV1, IRTX e BCTC, demonstramos que os transientes de Ca2+ _{induzidos por cafeína foram reduzidos de forma} significativa em 45 ± 8 % e 33 ± 4 %, respectivamente. Os CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ tiveram amplitude semelhante aos CICTs produzidos na presença de IRTX, seja esta em solução de Locke normal ou livre de Ca2+_{. Da mesma forma, os} CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+ _tiveram amplitude semelhante aos CICTs produzidos na presença de BCTC, seja esta em solução de Locke normal ou livre de Ca2+. Por último, a comparação entre os CICTs produzidos em solução de Locke livre de Ca2+_{, em solução de Locke normal com IRTX, e em} solução de Locke normal com BCTC, mostrou que há semelhança entre eles. Coletivamente, essas observações sugerem de forma enfática que o canal TRPV1 é o mediador da via de influxo do Ca2+ induzida por cafeína nos neurônios sensoriais primários de mamíferos. Sendo assim, os CICTs desses neurônios resultam de dois mecanismos distintos: ativação de receptores rianodina do retículo endoplasmático e ativação de canais TRPV1 da membrana plasmática, respectivamente.

Os canais TRPV1 têm localização na endomembrana do retículo endoplasmático e na membrana plasmática (MARSHALL et al., 2003). A observação de que os CICTs foram reduzidos por IRTX e BCTC em solução de Locke normal não nos permitiu distinguir a ação desses antagonistas. Essa distinção foi possível pela adição dos mesmos antagonistas a uma solução de Locke livre de Ca2+_{. Os} CICTs produzidos nessas condições foram semelhantes aos produzidos em solução de Locke livre de Ca2+_{. Isso sugere que os} antagonistas, nas dosagens utilizadas, bloquearam apenas os canais TRPV1 envolvidos na via de influxo. Esse raciocínio pode ser reforçado a partir de observações feitas em neurônios do DRG de ratos. Nessas células, a ativação dos TRPV1 envolvidos na via de liberação requer dosagens de capsaicina mil vezes superiores às utilizadas em nossos experimentos (LÁSZLÓ et al., 2004). Em suma, nossos experimentos avaliaram somente os canais TRPV1 envolvidos na via de influxo de Ca2+_.

O gânglio nodoso é constituído de um grupo heterogêneo de neurônios que carreiam informações de um amplo espectro de modalidades mecânicas, térmicas e químicas.

As membranas plasmáticas desses neurônios apresentam uma variedade de canais iônicos controlados por ligante (HIGASHI, 1986). Seria interessante investigarmos se o influxo de Ca2+ induzido por cafeína está presente em algum grupo particular de neurônios do GN. Nos nossos experimentos, observamos que mais de 90% dos neurônios estudados apresentaram influxo do Ca2+ _induzido por cafeína. Essa observação sugere que a mesma porcentagem de células expressa o canal TRPV1 e apresenta transientes de Ca2+ induzidos por capsaicina. De fato, mais de 90% dos neurônios estudados apresentaram transientes de Ca2+ induzidos por capsaicina.

A literatura relata uma porcentagem menor de neurônios do GN de ratos responsivos à capsaicina. Nesse sentido, foi observado que aproximadamente 60% dos neurônios isolados apresentam transientes de Ca2+ _{induzidos por capsaicina (CHUNG et al.,} 2002). Da mesma forma, foi observado que aproximadamente 85% dos neurônios apresentam transientes de Ca2+ induzidos por análogos de capsaicina (ZHAO et al., 2006). Por último, foi observado que 60 a 70% dos neurônios de GNs intactos são despolarizados por capsaicina (MARSH et al., 1987).