Criopreservação de sêmen ovino em meio à base de água de coco em pó (ACP-102c) adicionada de óleo de coco extra virgem
Cryopreservation of ram sperm in extender based on powered coconut water (ACP-102c) added with extra virgin coconut oil
Periódico: Pesquisa Veterinária Brasileira (Submetido em 19 de junho de 2017)
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Criopreservação de sêmen ovino em meio à base de água de coco em pó (ACP-102c) adicionada de óleo de coco extra virgem1
Bruna F. Brito2*, Bárbara M. B. Santos3, Leonardo A. R. Cabral², Thalles G.P. Nunes 2, Francisco J. R. Silveira Jr.4, Annice A. Cortez 2, Cristiane C. M. Salgueiro3, José F. Nunes²
ABSTRACT.- Bruna F. Brito²*, Bárbara M. B. Santos³, Leonardo A. R. Cabral², Thalles G.P. Nunes 2, Francisco J. R. Silveira Jr. 4, Annice A. Cortez 2, Cristiane C. M. Salgueiro3 & José F. Nunes. 2017. [Cryopreservation of ram sperm in extender based on powdered coconut water (ACP-102c) added with extra virgin coconut oil] Criopreservação de sêmen ovino em meio à base de água de coco em pó (ACP-102c) adicionada de óleo de coco extra virgem. Pesquisa Veterinária Brasileira 00(0):00-00. Universidade Estadual do Ceará, Avenida Silas Munguba,1700, Campus Itaperi,
Fortaleza, Ceará, 60.714-903, Brasil. *Autor para correspondência: britobf@live.com
The objective of this study was to evaluate the effect of the extender based on powdered coconut water (ACP-102c) added with extra virgin coconut oil on the cryopreservation of ovine sperm. The experiment was carried out at the Laboratory of the Goat and Sheep Sperm Technology (LTSCO) and Fazenda Ouro Branco, Ceará, Brazil. The sperm of five Dorper rams was collected with the aid of an artificial vagina; then assembled in a pool, divided into four equal aliquots and diluted in one step in the extenders: T1 (TRIS + 20% egg yolk), T2 (ACP-102c + 20% egg yolk + 7% glycerol), T3 (ACP-102c + 10% coconut oil + 7% glycerol), and T4 (ACP-102c + 20% coconut oil + 7% glycerol). The samples were packaged and submitted to a refrigeration curve (0.35 °C / min.), stabilized at 4 °C for 2 h, frozen in nitrogen vapor (-60 °C) and stored in liquid nitrogen (-196 °C). After thawing, the samples were evaluated for the following sperm quality parameters: total motility (MT), curvilinear velocity (VCL), linear velocity (VSL), mean velocity (VAP), sperm viability, DNA fragmentation, and mitochondrial activity (p < 0.05). According to the results, T3 differed from control treatments only for MT; however, this remained within the values recommended by the Manual of the Brazilian College of Animal Reproduction. Thus, it can be concluded that ACP-102c extender added with 10% coconut oil is efficient in maintaining the quality of cryopreserved ovine spermatozoa.
INDEX TERMS: Ovine, sperm, freezing, coconut water, coconut oil.
RESUMO.- Objetivou-se avaliar o efeito do diluente à base de água de coco em pó (ACP-102c)
adicionado de óleo de coco extra virgem na criopreservação de sêmen ovino. O experimento foi realizado no Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino (LTSCO) e na Fazenda Ouro Branco, Ceará, Brasil. O sêmen de cinco ovinos da raça Dorper foi coletado com o auxílio de vagina artificial; em seguida, reunidos em um pool, dividido em quatro alíquotas iguais e diluídas em um step nos diluentes: T1 (TRIS + 20% gema de ovo), T2 (ACP-102c + 20% gema de ovo + 7% glicerol), T3 (ACP-102c + 10% óleo coco + 7% glicerol) e T4 (ACP-102c + 20% óleo de coco + 7% glicerol). As amostras foram envasadas e submetidas a uma curva de refrigeração (0,35 °C/min.), estabilizadas a 4 °C por 2h, congeladas em vapor de nitrogênio (-60 °C) e armazenadas em nitrogênio líquido (-196 °C). Após a descongelação, as amostras foram avaliadas quanto aos seguintes parâmetros de qualidade espermática: motilidade total (MT), velocidade curvilinear (VCL), velocidade linear (VSL), velocidade média do percurso (VAP), viabilidade espermática, fragmentação do DNA, e atividade mitocondrial (p < 0,05). De acordo com os resultados, o T3 foi inferior aos tratamentos controle apenas quanto à MT (p<0.05); no entanto, este se manteve dentro dos valores preconizados pelo Manual do Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. Desta forma, pode-se concluir que o meio ACP-
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2 Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), Universidade Estadual do Ceará
(UECE), Av. Dr. Silas Munguba,1700, Campus Itaperi, Fortaleza, Ceará, 60.714-903, Brasil. Pesquisa de Mestrado com o apoio FUNCAP/CAPES/CNPq.*Autor para correspondência: britobf@live.com,
leocabral1991@gmail.com, thalles_gothardo@hotmail.com, annicevet@gmail.com,
nunesuece@gmail.com.
3 Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO), UECE, Av. Dr. Silas Munguba,1700, Campus Itaperi,
Fortaleza, Ceará, 60.714-903, Brasil. barbarabandeiras@hotmail.com, crismelloacp@gmail.com.
4 Faculdade Tecnológica do Nordeste,Rua Coronel Correia, 1119, Soledade, Caucaia, Ceará, 61603-
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102c adicionado de 10% óleo de coco é eficiente na manutenção da qualidade dos espermatozoides ovinos criopreservados.
TERMOS DE INDEXAÇÃO: Ovino, sêmen, congelação, água de coco, óleo de coco.
INTRODUÇÃO
As biotecnologias de conservação de sêmen ovino são de fundamental importância, uma vez que possibilitam a preservação do material genético, permitem a implantação das mesmas em diversas regiões, devido à facilidade de transporte do material genético e, consequentemente, uma melhoria nos rebanhos.
Dentre as biotecnologias de conservação seminal recomenda-se a criopreservação, uma vez que os espermatozoides não sobrevivem por muito tempo no sêmen in natura, tornando-se necessário a adição de diluentes para otimizar o meio que o envolve e manter a sua sobrevivência. Esses diluentes fornecem proteção contra os produtos do metabolismo espermático e as mudanças de temperatura, principalmente, nos processos de criopreservação.
Um bom diluente deve apresentar ausência de toxicidade, osmolaridade semelhante ao do sêmen, pH favorável e ser de preparação simples e de baixo custo. Características essas que estão presentes no diluente à base de água de coco, promovendo a sobrevivência e viabilidade dos gametas masculinos (Nunes 1998).
A água de coco tem apresentado resultados positivos na manutenção da viabilidade e poder fecundante dos espermatozoides em experimentos in vitro e in vivo, sendo possível sua utilização em processos biotecnológicos, como a inseminação artificial, sem os custos elevados com diluentes importados (Nunes 1998). Devido aos excelentes resultados obtidos nos primeiros estudos com água de coco in natura, foi desenvolvido um meio de conservação seminal à base de água de coco em pó (ACP), caracterizado pela padronização e estabilização, permitindo a conservação de suas características benéficas e facilitando o seu uso em regiões onde não se dispõe do fruto (Nunes & Salgueiro 2011).
O componente responsável pela proteção contra o choque térmico é denominado crioprotetor não-penetrante, sendo a gema de ovo a substância mais utilizada. Porém, por ser um produto cru e de origem animal, apresenta a possibilidade de contaminação biológica do diluente e, subsequente produção de endotoxinas capazes de prejudicar a capacidade de fecundação dos espermatozoides (Aires et al. 2003, Gil et al. 2003). Outras desvantagens referentes à utilização da gema de ovo, são atribuídas à opacidade óptica, causada pelos grânulos formados, que dificultam o exame imediato através da avaliação microscópica, o prejuízo causado à respiração do espermatozoide e a diminuição da motilidade (Bousseau et al. 1998, Martin 2005).
Estudos avaliando a qualidade dos espermatozoides ovinos congelados com diluentes suplementados com caseína e óleos vegetais, observaram que nenhum dos meios utilizados no presente estudo pós-descongelação obtiveram resultados superiores quando comparados ao diluente contendo gema de ovo. No entanto, concluíram que apesar de não ter sido demonstrado efeito superior desses óleos na qualidade seminal pós-descongelação, são ainda necessárias mais pesquisas sobre assunto (Del Valle et al. 2013).
O óleo de coco, obtido a partir da polpa do coco fresco maduro (Cocos nucifera L.), é composto por ácidos graxos saturados (mais de 80%) e ácidos graxos insaturados. Os ácidos graxos saturados presentes no óleo de coco são: capróico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico e esteárico, e os insaturados são: oléico e linoléico. Esses ácidos graxos são os mesmo observados no plasma seminal de pequenos ruminantes (Cardoso et al. 2011).
Em um recente estudo, avaliando a qualidade de espermatozoide caprinos criopreservados em meio à base de água de coco em pó adicionanda de óleo de coco, foi observado a ação crioprotetora do óleo de coco, entretanto, os dados obtidos foram inferiores ao preconizado pelo CBRA (Santos 2013).
Diante disso, objetivou-se avaliar o efeito do diluente à base de água de coco em pó adicionada de óleo de coco extra virgem na criopreservação de espermatozoides ovinos.
MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho está em conformidade com o projeto aprovado pela Comissão de Ética para o Uso de Animais da Universidade Estadual do Ceará (UECE) com o número de protocolo: 1845940/2016 e foi executado no Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino (LTSCO), inserido no Núcleo Integrado de Biotecnologia (NIB) da UECE, juntamente a Fazenda Ouro Branco. O
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Núcleo está localizado na cidade de Fortaleza, no Estado do Ceará, Brasil, com latitude de 3°43’47” sul e longitude de 38°30’37” oeste e altitude de 16 metros acima do nível do mar. O clima da região, de acordo com a classificação de Koppen, é quente e úmido, com médias térmicas variando entre 26 a 27 °C, máximas de 30 °C e mínimas de 19 °C. A Fazenda Ouro Branco localiza-se em Amanari, distrito do município de Maranguape, Ceará.
Utilizou-se cinco reprodutores ovinos da raça Dorper, com idade entre 1-4 anos, mantidos em manejo semi-intensivo, alimentados com pasto verde e concentrado comercial com 18% de proteína bruta, além de sal mineral e água à vontade. As colheitas de sêmen foram realizadas com auxílio de vagina artificial, duas vezes por semana, perfazendo seis colheitas por animal, totalizando 30 ejaculados. Após a colheita, avaliou-se cada ejaculado quanto ao volume, concentração, motilidade massal, percentual de espermatozoides móveis e vigor. Foram utilizados apenas ejaculados com volume superior a 0,5 ml, percentual de espermatozoides móveis superior a 80%, concentração
mínima de espermatozoides de 3,5 x 109 espermatozoides (sptz) /ml e escore mínimo de 3,5 para
motilidade massal e vigor (CBRA 2013).
Para a criopreservação seminal utilizaram-se os diluentes ACP-102c e TRIS. O diluente ACP- 102c foi preparado segundo recomendação do fabricante (ACP Biotecnologia, Fortaleza, Ceará, Brasil). O diluente TRIS consistiu na adição de 300 mM de Tris-hidroximetil-aminometano, 94,7 mM de ácido cítrico monohidratado e 27,8 mM de glicose. O diluente TRIS foi acrescido de 20% de gema de ovo (G.O.) e 7% de glicerol, e o diluente ACP-102c foi fracionado em três alíquotas as quais foram acrescidas de 20 % de gema de ovo, 10% de óleo de coco (O.C.), 20 % de óleo de coco. As três alíquotas foram acrescidas de 7% de glicerol e, para todos os diluentes, foi acrescido 40 mg de gentamicina para cada 100 ml de diluente.
Em cada coleta, os ejaculados foram reunidos em um pool, divididos em quatro alíquotas e diluídos a 34 °C nos tratamentos T1 (TRIS-20% G.O.-7% glicerol), T2 (ACP102c-20% G.O.-7% glicerol), T3 (ACP102c-10% O.C.-7% glicerol) e T4 (ACP102c-20% O. C.-7% glicerol), obtendo uma
concentração final de 400x106 sptz/ml. Em seguida, as amostras foram envasadas em palhetas de 0,5
ml e refrigeradas até 4 °C em 120 min., a um decréscimo de 0,35 °C/min. Ao atingir 4 °C, as amostras foram acondicionadas em geladeira a 4 °C por 2 h, para estabilização. Após este período, as palhetas foram congeladas em vapor de nitrogênio (- 60 °C) por 15 min., a uma altura de 4 cm do nitrogênio líquido, e então imersas em nitrogênio líquido a -196 °C e armazenadas em botijões criogênicos.
Para avaliação do sêmen criopreservado, duas palhetas por diluente foram descongeladas em banho Maria a 37 °C por 30 segundos, acondicionadas em tubos tipo Eppendorfs e incubadas por cinco minutos em banho Maria a 37 °C. As amostras de sêmen descongeladas foram avaliadas quanto aos parâmetros cinéticos, viabilidade espermática, atividade mitocondrial espermática e dispersão da cromatina espermática.
A motilidade espermática foi avaliada em Sistema de Análise de Sêmen Auxiliado por
Computador (CASA), com uso do programa Sperm Class Analyser® (SCA®, Microptic S.L., Barcelona,
Espanha) que processa imagens obtidas em microscópio de contraste de fase acoplado a uma câmara digital. Foram utilizadas as seguintes variáveis do programa: 25 quadros/s, sendo 25 quadros/campo; velocidade limite para espermatozoides lentos de 30μm/s; limite para velocidade média de 60 μm/s; retilinearidade mínima para espermatozoides progressivos de 80%. Para a avaliação, diluiu-se o sêmen descongelado nos diluentes-base (ACP-102c e TRIS) a 37 °C, até a
concentração de 40 x 106 sptz/ml. Dez microlitros desta diluição foram alíquotados em câmara de
Makler (Sefi Medical Instruments Ltda., Haifa, Israel), pré-aquecida a 37 °C, para se estudar as variáveis: percentual de espermatozoides móveis, velocidade curvilinear (VCL - μm/s), velocidade linear (VSL - μm/s), e velocidade média do percurso (VAP - μm/s).
A viabilidade espermática foi avaliada pela técnica de coloração de esfregaço utilizando o corante eosina-nigrosina (eosina 1 g, nigrosina 2 g, citrato de sódio 3,57 g, e água destilada qsp. 100 ml - Baril et al. 1993). Foram confeccionados esfregaços em lâmina pré-aquecida a 37 °C utilizando 5 μl do corante eosina nigrosina adicionado de 5 μl do sêmen rediluído. Foram contadas 200 céulas espermáticas por lâmina e classificadas como viáveis (não coradas) e não viáveis (coradas).
A atividade mitocondrial foi verificada pela técnica citoquímica (Hrudka 1987). Foi pesado 0,0045 g de 3,3’-diaminobenzidina (DAB) e diluído em 300 µl de solução tampão fosfato salina (PBS).
A seguir, uma alíquota de 25μl de amostra foi incubada com 50 μl de DAB+PBS, a 37 °C, por 40 min.
Após incubação, foram confeccionados esfregaços em lâmina de vidro pré-aquecidas, estas fixadas em formol a 10% por 10 min., lavadas com água destilada e secas a temperatura ambiente (22 °C). Todo o procedimento deste teste foi realizado protegidos da luz.
Para análise da atividade mitocondrial, as lâminas foram observadas em microscópio de contraste de fase em aumento de 400x, sendo contados 200 espermatozoides/lâmina, e classificados
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de acordo com o grau de coloração da peça intermediária em quatro classes: Classe I [células espermáticas com peça intermediária totalmente corada indicando alta atividade mitocondrial -DAB I]; Classe II [células espermáticas com mais da metade dos segmentos corados (ativos) indicando atividade mitocondrial média a alta - DAB II]; Classe III [células espermáticas com menos da metade dos segmentos corados (ativos) indicando baixa atividade mitocondrial - DAB III]; Classe IV [células espermáticas com peça intermediária totalmente descorada indicando ausência de atividade mitocondrial - DAB IV] (Hrudka 1987).
Para avaliação da integridade do DNA, utilizou-se o teste SCD (Sperm Cromatine Dispersion). A agarose de baixo peso molecular foi fervida por 5 min., em seguida, uma alíquota de 50 µl de agarose foi acondicionada em tubo tipo Eppendorf e mantida em banho Maria a 37 °C por 5 min. A seguir, uma alíquota de 25 µl da amostra de sêmen descongelada foi adicionada ao Eppendorf contendo agarose. Em lâmina previamente preparada, foram aliquotados 2 µl do sêmen diluído na agarose em cada ponto devidamente sinalizado e em seguida cobertas com lamínulas, sendo um total de oito alíquotas por lâmina. Posteriormente, as lâminas foram acondicionadas em geladeira por 5 min. Após o tempo de acondicionamento, foram retiradas as lamínulas e as lâminas submetidas a uma série de soluções: solução de HCL (7 min.); solução de lise (25 min.); água destilada (5 min.), e álcool 70%, 90% e 95% respectivamente (2 min. cada). Em seguida, as lâminas foram secas em temperatura ambiente (22 °C) e posteriormente submetidas à coloração com kit Panótico. Por fim,
as lâminas foram lavadas com água destilada e secas em temperatura ambiente (22 °C). Duzentas
células espermáticas foram avaliadas e o percentual de células com DNA íntegro (DNAi) determinado pela presença de grande halo de dispersão de cromatina ao redor da cabeça do espermatozoide e o percentual com DNA fragmentado (DNAf) determinado pela ausência do halo (Fernández et al. 2005, Cavalcante et al. 2014).
Os dados obtidos foram expressos em média e desvio padrão e analisados através do software estatístico R-project© versão 3.3.2 (The R Foundation, Viena, Áustria). Os dados foram submetidos ao teste de homocedasticidade Box-Cox e ao teste de normalidade Cramer-von Mises, as proporções encontradas para os parâmetros espermáticos foram submetidas ao Teste de Student- Newman-Keuls para comparação entre os diluentes pós-descongelação. Os resultados foram considerados significativos quando p < 0,05.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
No presente estudo, o sêmen ovino foi diluído e criopreservado nos diluentes TRIS- 20%
G.O.-7% glicerol, ACP102c-20% G.O. -7% glicerol, ACP102c-10% O.C. -7% glicerol e ACP102c-20%
O.C. -7% glicerol. Os parâmetros cinéticos incluindo o VSL, VCL, VAP, bem como a motilidade foram analisados em sistema de análise de sêmen auxiliada por computador (CASA). Adicionalmente, as análises da viabilidade espermática foram realizadas pelo método de coloração de eosina-negrosina (EN), da fragmentação de DNA pelo teste SCD (Sperm Cromatine Dispersion) e a atividade mitocondrial pelo teste de oxidação do 3,3’- diaminobenzinde.
A motilidade espermática é uma importante característica seminal para avaliar o potencial de fertilidade de espermatozoides. Vários estudos sugerem evidências entre os parâmetros de motilidade e a fertilidade (Stålhammar et al. 1994, Januskauskas et al. 2003).
Nesse estudo, excetuando-se as variáveis motilidade e viabilidade, em todos as demais (VCL, VSL, VAP, DNAi e atividade mitocondrial) não foi observada diferença estatística entre os quatro tratamentos (Tabela 1, 2 e 3). Logo após a descongelação, o sêmen criopreservado nos diluentes TRIS (20% G.O. -7% glicerol) e ACP102c (20% G.O. -7% glicerol, 10% O.C. -7% glicerol e 20% O.C. -
7% glicerol) diferiu estatisticamente (p < 0,05) para a variável motilidade, em que o TRIS foi superior
aos tratamentos à base de ACP-102c (p < 0,05) (Tabela 1). Os dados corroboram com o trabalho de criopreservação do sêmen ovino em meio diluente à base de água de coco em pó (ACP-102c), onde observou que o TRIS apresentou superioridade para a variável motilidade e manteve similar as velocidades (Cavalcante et al. 2014).
Os resultados demonstraram que a adição de 10% do óleo de coco (32,78% + 16,72) manteve a qualidade do sêmen semelhante ao diluente ACP102c-20% G.O. (22,58% + 6,14) em todos os parâmetros avaliados (p>0.05) e foi inferior estatisticamente do diluente TRIS – 20% G.O. (68,40% + 14,25) somente em relação ao parâmetro motilidade (p<0.05), no entanto os dados de motilidade do T3 foram superior a 30%, valor preconizado pelo CBRA.
Recente estudo demonstrou evidências do efeito crioprotetor do óleo de coco adicionado ao diluente ACP-101c (específico para caprinos) na sobrevivência espermática pós-descongelação; no entanto, os resultados obtidos quanto a motilidade progressiva ( T1 -10%, T2 -7%), , VSL (T1 – 21,15, T2 – 24,4 µm/s ) e VAP (T1 – 34,15, T2 – 40,9 µm/s ) (Santos 2013). Além disso, exceto o parâmetro
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de motilidade, VCL e viabilidade, os demais parâmetros cinéticos e qualitativos foram semelhantes entre todos os tratamentos pós-descongelação. Ressalta-se ainda que, ao comparar o diluente ACP- 102c acrescido de gema de ovo e acrescido de 10% de óleo de coco, não foi observado diferença estatística em nenhum parâmetro, inclusive na motilidade (Tab. 1).
Vale ressaltar que, durante as análises, observou-se que os tratamentos contendo o óleo de coco, apresentaram uma variação entre as palhetas de uma mesma colheita quanto a motilidade. Isso pode ser justificado pela dificuldade de homogeneização do óleo, o que pode ter ocasionado uma variação na concentração do óleo entre as palhetas, justificando o alto desvio padrão observado nos diluentes acrescidos de óleo.
Assim como a motilidade, as velocidades também são importantes parâmetros para avaliar o potencial de fertilidade. Neste estudo, ocorreu um declínio das velocidades VCL, VSL e VAP no sêmen descongelado (Tab. 1); no entanto, os resultados foram similares para as três velocidades entre os diluentes T1, T2 e T3, apresentando diferença estatística significativa apenas entre o T4 (45,29±8,53) e os tratamentos contendo gema de ovo (T1 - 69,30±14,82 e T2 - 51,11±13,67) quanto a VCL, onde o T4 foi inferior quando avaliados pós-descongelação. Esses resultados demonstram que o sêmen ovino criopreservado nos diluentes empregados neste estudo, não sofreu danos sub letais decorridos em função de efeitos da liberação de radicais livres pela atividade metabólica dos espermatozoides ativos e da liberação de enzimas tóxicas após lise de células mortas (Bag et al. 2004).
Outro fator importante para predizer o potencial de fertilidade espermática é o funcionamento mitocondrial de maneira ordenada e aprimorada, sendo altamente relacionado com altas taxas de funcionalidade e fertilidade da célula espermática (Angrimani et al. 2015). Dessa forma, a avaliação criteriosa da atividade, do potencial e do metabolismo mitocondrial surgiu como ferramenta para o sucesso na seleção de animais de interesse reprodutivo.
Em relação a atividade mitocondrial (Tab. 2), não houve diferença significativa no sêmen descongelado entre os tratamentos e o percentual de células espermáticas com alta (classe I) e média (classe II) atividade mitocondrial correspondem a mais de 50%. Estes índices significam que,na maioria dos espermatozoides mais da metade das mitocôndrias estão ativas nos espermatozoides após a descongelação, o que é compatível para promover a motilidade espermática pós- descongelação.
Além disso, o alto percentual de espermatozoides classe I e II e consequentemente, e um baixo percentual de classe III e IV observados nesse estudo, corroboram com os dados obtidos pela técnica de citoquímica para o sêmen caprino pós-descongelação das raças Boer e Alpina (Cavalcante et al. 2005). Desta forma, os diluentes foram eficazes em manter a função mitocondrial (Tab. 2), mantendo os níveis da síntese de energia (ATP), necessária ao movimento de espermatozoides no trato genital da fêmea.
Quanto à viabilidade e a fragmentação do DNA, acredita-se que o responsável pelas mudanças negativas bioquímicas e fisiológicas durante o armazenamento de espermatozoides seja a produção das espécies reativas de oxigênio (ROS) induzidas pela degradação de membranas espermáticas e pelos ácidos graxos poliinsaturados de alto nível (Vishwanath & Shannon 2000, Hong et al. 2010). As ROS podem interagir com uma variedade de macromoléculas biológicas, tais como proteínas e lipídios, causando danos oxidativos e afetando a integridade promovendo a fragmentação do DNA (Kelly et al. 1998, Gosalvez et al. 2007). No sêmen dos ovinos existem antioxidantes endógenos; no entanto, durante o processo de diluição e criopreservação, há uma diminuição da concentração dessas substâncias, podendo resultar em danos oxidativos.
Nos resultados, apenas o diluente ACP102c-20% O.C. apresentou diferença estatística quando comparado aos diluentes contendo gema de ovo no parâmetro viabilidade espermática (Tab. 3). No percentual de células espermáticas com DNA íntegro, também não foram encontradas diferenças significativas (p > 0,05) entre os diluentes, demonstrando que o ACP102c-10% O.C. é eficaz na manutenção da membrana espermática e na integridade do DNA, evitando a ação das ROS, atuando simultaneamente como crioprotetor e antioxidante.
Os dados desse estudo diferem com os achados do estudo no qual foi realizado a suplementação de 8% de óleo de coco extra virgem a diferentes concentrações de gema de ovo no diluente TRIS em touros. Nesse estudo foi observado que a adição apenas do óleo de coco ao diluente apresentou resultados insatisfatórios e que o melhor resultado foi do tratamento TRIS 20% de gema de ovo adicionado de 8% de óleo de coco, sugerindo assim, que a combinação aumentou a fluidez do