UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
BRUNA FARIAS BRITO
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN OVINO EM MEIO À BASE DE ÁGUA DE COCO EM PÓ (ACP-102c) ADICIONADA DE ÓLEO DE COCO EXTRA VIRGEM
FORTALEZA – CEARÁ 2017
BRUNA FARIAS BRITO
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN OVINO EM MEIO À BASE DE ÁGUA DE COCO EM PÓ (ACP-102c) ADICIONADA DE ÓLEO DE COCO EXTRA VIRGEM
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Veterinárias do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Orientador: Prof. Dr. José Ferreira Nunes Coorientadora: Prof.ª Dr.ª Cristiane Clemente de Mello Salgueiro
FORTALEZA – CEARÁ 2017
BRUNA FARIAS BRITO
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN OVINO EM MEIO À BASE DE ÁGUA DE COCO EM PÓ (ACP-102c) ADICIONADA DE ÓLEO DE COCO EXTRA VIRGEM
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Veterinárias do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para à obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Às pessoas mais importantes da minha vida, sem as quais não teria chegado aonde cheguei: meus pais (Carlos e Edilvane), minhas irmãs (Tuíra e Micaela), meus cunhados (Pedro e Júnior) e minhas amigas (Bárbara Mara, Brandinice, Pamella e Ana Júlia).
AGRADECIMENTOS
A Deus, por todas as oportunidades que tem me concedido nesta vida.
Aos meus Pais, por sempre valorizarem a minha educação e sempre terem me encorajado e dado força para realizar meus sonhos.
Às minhas irmãs, por estarem sempre ao meu lado me apoiando, me escutando e me aconselhando.
Ao Prof. Dr. José Ferreira Nunes, pela orientação e confiança.
À Prof.ª Dr.ª Cristiane Clemente de Mello Salgueiro, pela coorientação e confiança. Ao Prof. Dr. Leonardo Tondello Martins, por aceitar o convite e participar da banca. À Prof.ª Dr.ª Gyselle Viana Aguiar, por aceitar o convite e participar da banca.
A todos os professores da FAVET, do PPGCV e visitantes, pelo conhecimento adquirido ao decorrer dos dois anos de mestrado.
Aos colegas do PPGCV, que estiveram juntos comigo no decorrer do mestrado. Aos colegas do Núcleo Integrado de Biotecnologia da Universidade Estadual do Ceará, aos integrantes do Laboratório de Reprodução de Carnívoros (LRC) e do Laboratório de Biotecnologia de Reprodução de Peixes (LBRP), em especial a Annice Cortez, David Baruc e a Júlia Trúgilo, pelo apoio e colaboração no meu crescimento na área da pesquisa.
Aos colegas do Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen (LRSTS), em especial Thalles Gothardo, pela amizade, apoio e colaboração no meu crescimento na área da pesquisa.
Ao Laboratório de Embriologia da UNIFOR, pela apoio e aprendizado na parte da fertilização in vitro.
Aos colegas do Laboratório de Fisiologia Animal da Universidade Federal do Ceará, pelo aprendizado e auxílio nos desenvolvimentos das análises de dispersão da cromatina.
Ao Departamento de Física da Universidade Federal do Ceará, pelo apoio e por tornar possível a execução do projeto.
A todos os integrantes que passaram pelo Laboratório de Tecnologia do Sêmen de Caprinos e Ovinos, em especial: Gyselle Aguiar, Bárbara Mara, Maurício Cavalcante, Brandinice de Almada, Nayra Carvalho, Lívia Antunes, Leonardo Cabral, Priscila Farias, Juliana Ribeiro, Fábio Ranyeri, Maressa Holanda, Lucas Fonseca, Dona Iraci. À Kelliani Mucida, pela disponibilização da fazenda para realização do experimento.
Aos funcionários e auxiliares técnicos do PPGCV (Adriana, João, Vicente, César e Selmar) que tornaram possíveis uma melhor qualidade de ensino.
Atodos os meus familiares pela confiança e amor.
“Confie sempre no SENHOR, pois ele é nosso eterno abrigo” (Autoria desconhecida).
RESUMO
Os aditivos de origem animal como a gema de ovo e o leite, amplamente empregados na preservação do sêmen, representam um risco potencial na contaminação do sêmen. Com o intuito de reduzir esses impactos quanto ao uso de substâncias de origem animal, o trabalho teve como objetivo, avaliar o efeito do diluente à base de água de coco em pó (ACP -102c) adicionado de óleo de coco extra virgem na criopreservação de sêmen ovino. O experimento foi realizado no Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino (LTSCO) e na Fazenda Ouro Branco, Ceará. Foram coletados ejaculados de cinco ovinos da raça Dorper, com auxílio de vagina artificial. Em cada coleta, os ejaculados com motilidade massal (≥ 3), motilidade progressiva (≥ 80%) e vigor (≥ 3) foram selecionados. Em seguida, os ejaculados foram reunidos em um pool e dividido em quatro alíquotas iguais e diluídas em um
step nos seguintes tratamentos: T1 (TRIS + 20% gema de ovo + 7% glicerol), T2
(ACP-102c + 20% gema de ovo + 7% glicerol), T3 (ACP-(ACP-102c + 10% óleo coco + 7% glicerol) e T4 (ACP-102c + 20% óleo de coco + 7% glicerol). As amostras foram envasadas e submetidas a uma curva de refrigeração (0,35 °C/min.), estabilizadas a 4 °C por 2h, congeladas em vapor de nitrogênio 60 °C) e armazenadas em nitrogênio líquido (-196 °C). Após a descongelação, as amostras foram avaliadas quanto aos seguintes parâmetros de qualidade espermática: motilidade total (MT), velocidade curvilinear (VCL), velocidade linear (VSL), velocidade média do percurso (VAP), viabilidade espermática, fragmentação do DNA, e atividade mitocondrial. Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão. Os dados foram submetidos ao teste de Box-Cox, Cramer-von Mises e as médias comparadas pelo Teste de Student-Newman-Keuls (p < 0,05) utilizando o software R-project 3.3.2 para Windows. Os resultados demonstraram que o T2 foi inferior ao T1 apenas quanto à variável motilidade total (p < 0,05), e o T3 foi inferior ao T1 e ao T2, apenas quanto a motilidade, no entanto, os dados de motilidade para o T3 encontram-se acima do proposto pelo CBRA. Já o T4, foi inferior ao T1 quanto a motilidade, a viabilidade e a VCL (p < 0,05). Conclui-se que a adição de 10% de óleo de coco extra virgem ao ACP-102c é eficaz na manutenção da qualidade de sêmen ovino criopreservado.
ABSTRACT
Animal additives such as egg yolk and milk, widely used in the preservation of semen, represent a potential risk in sperm contamination. The aim of this study was to evaluate the effect of the extender based on powdered coconut water (ACP-102c) added with extra virgin coconut oil in the cryopreservation of ram sperm. The experiment was carried out at the Laboratory of Goats and Sheep Sperm Technology (LTSCO) and Farm Ouro Branco, Ceará. Five ejaculates were collected from Dorper ram, using artificial vagina. In each collection, the ejaculates with mass motility (≥ 3), progressive motility (≥ 80%) and vigor (≥ 3) were selected. Then the ejaculates were gathered in a pool and divided into four equal aliquots and diluted in one step in the following treatments: T1 (TRIS + 20% egg yolk + 7% Glycerol), T2 (ACP-102c + 20% egg yolk + 7% Glycerol), T3 (ACP-102c + 10% coconut oil + 7% glycerol) and T4 (ACP-102c + 20% coconut oil + 7% glycerol). The samples were packaged and submitted to a refrigeration curve (0.35 °C / min.), stabilized at 4 °C for 2 h, frozen in nitrogen vapor (-60 °C) and stored in liquid nitrogen (-196 °C). After thawing, the samples were evaluated for the following sperm quality parameters: total motility (MT), curvilinear velocity (VCL), linear velocity (VSL), mean velocity (VAP), sperm viability, DNA fragmentation, and mitochondrial activity. The results were expressed as mean ± standard deviation. The data were submitted to the Box-Cox test, Cramer-von Mises and the means compared by the Student-Newman-Keuls test (p < 0.05) using the software R-project 3.3.2 for Windows. The results showed that T2 was less than T1 only for total variable motility (p <0.05), and T3 was less than T1 and T2, only for motility, however, motility data for T3 above that proposed by CBRA. T4 was less than T1 for motility, viability and VCL (p <0.05). It can be concluded that the addition of 10% extra virgin coconut oil to ACP-102c is effective in maintaining cryopreserved ovine spermatozoa.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Velocidades e amplitude de deslocamento lateral da cabeça do Sperm Class Analyzer (SCA®, Microptics, S.L., Espanha)... 25
Figura 2 - Teste de dispersão da cromatina. Célula com DNA íntegro (halo) e célula com DNA fragmentado (sem halo)... 28
Figura 3 - Avaliação da atividade mitocondrial. Espermatozoide com alta (I), média (II) e baixa (III) atividade mitocondrial... 29
Figura 4 - Água de coco em pó (ACP)... 33
Quadro 1 - Valores preconizados pelo CBRA (2013) para análise do sêmen ovino fresco... 23
Quadro 2 - Valores preconizados pelo CBRA (2013) para análise do sêmen ovino descongelado... 23
Quadro 3 - Parâmetros de motilidade espermática obtidos através do Sperm Class Analyzer (SCA®, Microptics, S.L., Espanha)... 24
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Médias ± desvios padrões dos parâmetros cinéticos (MT, VCL, VSL, VAP) de sêmen ovino criopreservado nos meio tris- 20% gema de ovo (T1), ACP102c-20% gema de ovo (T2), ACP102c-10% óleo de coco (T3) e ACP102c-20%
óleo de coco (T4) avaliados pelo
SCA... 52
Tabela 2 - Médias ± desvios padrões da atividade mitocondrial (3,3’- diaminobenzidine) de sêmen ovino criopreservado nos meio tris-20% gema de ovo (T1), ACP102c-20% gema de ovo (T2), ACP102c-10% óleo de coco (T3) e ACP102c-20% óleo de coco (T4)... 52
Tabela 3 - Médias ± desvios padrões da viabilidade (eosina nigrosina) e do DNA íntegro (SCD test) de sêmen ovino criopreservado nos meio tris-20% gema de ovo (T1), ACP102c-20% gema de ovo (T2), ACP102c-10% óleo de
coco (T3) e ACP102c-20% óleo de coco
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACP Água de coco em pó ATP Adenosina Trifosfato
CASA Computer-assisted sperm analysis (Análise de Sêmen Auxiliada por Computador)
CBRA Colégio Brasileiro de Reprodução Animal CCO Citocromo C-Oxidase
DAB Diaminobenzidine
DNA Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucléico)
DNAi DNA íntegro
EN Eosina-nigrosina
EROs Espécies Reativas de Oxigênio FAVET Faculdade de Veterinária
G.O. Gema de Ovo
GPx Glutationa peroxidase GR Glutationa Redutase HCL Ácido Clorídrico
IFCE Instituto Federal do Ceará
LBRP Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes LDL Lipoproteína de baixa densidade
LRC Laboratório de Reprodução de Carnívoros
LRSTS Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen
LTDA Limitada
LTSCO Laboratório de Tecnologia do Sêmen de Caprinos e Ovinos MT Motilidade Total
NIB Núcleo Integrado de Biotecnologia O.C. Óleo de coco
PBS Phosphate Buffer Saline (Solução tampão fosfato)
PPGCV Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias RENORBIO Rede Nordeste de Biotecnologia
SCA Sperm Class Analyzer
SCD Sperm Chromatin Dispersion (Dispersão da cromatina
espermática)
SCGE Single-cell gel electrophoresis
SCSA Sperm Chromatin Structure Assay (Teste de avaliação da estrutura da cromatina espermática)
SPTZ Espermatozoide SOD Superóxido dismutase
UECE Universidade Estadual do Ceará UNIFOR Universidade Fortaleza
USA United States of America (Estados Unidos da América)
VAP Velocidade Média do Percurso VCL Velocidade Curvilinear
VSL Velocidade Linear
LISTA DE SÍMBOLOS % Percentagem ≥ Maior ou igual < Menor ± Mais ou menos 106 Milhões 109 Bilhões X Vezes °C Graus Celsius © Copyright µl Microlitro µm Micrometro cm³ Centímetro cúbico G Grama ml Mililitro mm³ Milímetro cúbico Mm Milimolar min. Minutos P Nível de significância pH Potencial Hidrogeniônico ® Marca Registrada S Segundos
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 18
2 REVISÃO DE LITERATURA... 20
2.1 OVINOCULTURA E BIOTECNOLOGIAS REPRODUTIVAS... 20
2.2 SÊMEN... 22 2.3 ANÁLISE ESPERMÁTICA... 22 2.3.1 Volume... 24 2.3.2 Turbilhonamento... 24 2.3.3 Cinética... 24 2.3.4 Concentração... 26 2.3.5 Viabilidade... 27 2.3.6 Dispersão da cromatina... 27 2.3.7 Atividade mitocondrial... 28 2.4 CONSERVAÇÃO SEMINAL... 29 2.4.1 Refrigeração... 29 2.4.2 Congelação... 30 2.5 DILUENTES SEMINAIS... 31 2.5.1 Água de coco em pó... 32 2.6 CRIOPROTETORES... 33 2.6.1 Glicerol... 34 2.6.2 Gema de ovo... 34 2.6.3 Óleos vegetais... 37 3 JUSTIFICATIVA... 41 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA... 42 5 OBJETIVOS... 43 5.1 GERAL... 43
5.2 ESPECÍFICOS... 43
6 CAPÍTULO I - Criopreservação de sêmen ovino em meio à base de água de coco em pó (acp-102c) adicionada de óleo de coco extra virgem... 44 7 CONCLUSÃO... 53 REFERÊNCIAS... 54 APÊNDICES... 62 APÊNDICE A... 63 APÊNDICE B... 64
18
1 INTRODUÇÃO
O papel da criopreservação seminal é fundamental para os programas de reprodução, as inseminações artificiais, produção in vivo e in vitro de embriões. Porém, as mudanças repentinas de temperatura, como choques a frio e calor, bem como a formação de gelo durante o processo de congelação e descongelação, afetam a integridade funcional e física das células espermáticas. Portanto, diferentes diluentes têm sido utilizados para minimizar esses danos.
Os diluentes usados para a preservação espermática, de uma forma geral, devem ter pH adequado, capacidade de proteção e manutenção da viabilidade celular, osmolaridade adequada e, ainda, capacidade de proteger o espermatozoide de crioinjúrias. Nesse contexto, destacamos o uso do diluente à base de água de coco, que contém proteínas, sais, açúcares, fatores de crescimento e fosfolipídios (NUNES; SALGUEIRO, 1999).
Além disso, os meios de criopreservação necessitam da adição de substâncias crioprotetoras, dentre elas, a gema de ovo tem sido comumente utilizada nos diluentes de sêmen de mamíferos (LEBOEUF; RESTALL; SALAMON, 2000).
No entanto, nos últimos anos, a exigência em relação à substituição da gema de ovo como crioprotetor no diluente seminal se intensificou devido à preocupação da mesma aumentar o risco de contaminação microbiana, o que pode conduzir à produção de endotoxinas que podem reduzir o potencial fecundante dos espermatozoides e aumentar o risco de transmissão de doenças, dificultando a comercialização dessas doses criopreservadas (BOUSSEAU et
al., 1998).
Diante disso, a busca por diluentes livre de produtos de origem animal têm se intensificado. Diversos estudos com a utilização de óleo e produtos vegetais como óleo de argan, óleo de coco tem sido realizado (ALLAI et al, 2015; DEL VALLE et al., 2013; SANTOS, 2013).
O óleo de coco, obtido a partir da polpa do coco fresco maduro (Cocos
nucifera L.), é composto por ácidos graxos saturados e ácidos graxos
insaturados, sendo uma composição lipídica similar ao do plasma seminal dos ovinos, e tem apresentado potencial antioxidante (SILVA NETO et al., 2013). Desta forma, com todas essas propriedades benéficas, o óleo de coco parece
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ser um suplemento potencialmente desejável que possa ter ações benéficas semelhantes as da gema de ovo como crioprotetor.
20
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 OVINOCULTURA E BIOTECNIOLOGIAS REPRODUTIVAS
Os ovinos e caprinos estão espalhados em todos os continentes. No entanto, existe uma notável concentração dos ovinos localizados principalmente na Ásia, Oceania e Europa. China, União Europeia e Austrália concentram mais de 30% do rebanho ovino mundial e quase metade da produção de carne (BANCO DO BRASIL, 2010).
No Brasil, a ovinocultura tem sua importância econômico-social apresentando-se como alternativa na oferta de carne, leite e derivados, favorecendo o aspecto alimentar das populações rural e urbana. A expansão desse agronegócio em diversas regiões do Brasil vem transformando o cenário dos sistemas produtivos, tornando-se um atrativo de forma significativa para a fixação das populações no meio rural. Os mercados interno e externo dessa atividade vêm crescendo rapidamente e transformando-se, exigindo organização dos produtores, maior produção com qualidade e segurança alimentar (ALVES; HOLANDA JÚNIOR; LOPES, 2008).
Por muitos anos a ovinocultura na região Sul foi a mais dinâmica do País, porém devido a crise da Lã, em meados dos anos 90, a população de animais nesta região diminuiu drásticamente. De lá para cá, com o advento das raças deslanadas, o Nordeste expandiu o seu rebanho e tornou-se a região com o maior número de ovinos no Brasil. Entre 1975 a 2013, enquanto a região Sul diminuiu 55,9% do seu rebanho, passando de 11,7 milhões de cabeças para 5,2 milhões, a região Nordeste cresceu 75%, chegando a 9.774.436 cabeças de ovinos em 2013 (INSTITUTO AGROPÓLOS DO CEARÁ, 2015). Em 2015, o efetivo de ovinos foi de 18,41 milhões, com uma variação de 4,5% em relação a 2014 (IBGE, 2015).
A Região Nordeste se destaca na criação de ovinos e concentrou 60,6% do rebanho nacional no último ano. A Região Sul figura em seguida, representando 26,5% do efetivo da espécie, acompanhada pelas Regiões Centro-Oeste (5,6%), Sudeste (3,8%) e Norte (3,6%) (IBGE, 2015).
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No ano de 2015, Bahia (17,2%), Pernambuco (13,1%) e Ceará (12,5%) destacaram-se na criação de ovinos no Nordeste do Brasil, porém o Rio Grande do Sul ainda era o estado com o maior número de animais, representando 21,5% do total nacional (IBGE, 2015).
Vale ressaltar que na Região Nordeste a criação desses animais destina-se basicamente à produção de carne, enquanto na Região Sul tem-destina-se também a produção e a comercialização de lã (IBGE, 2015).
E mesmo não tendo grande relevância na economia regional nordestina em relação ao PIB agropecuário, a ovinocaprinoculturta apresenta importância socioeconômica ao nível de propriedade, distritos e municípios. No geral, essas atividades são exploradas de forma secundárias nas propriedades rurais, servindo como renda complementar aos produtores, além de serem importantes fontes de proteína animal, proporcionando maior segurança alimentar das famílias, sendo este um alimento de alto valor biológico (INSTITUTO AGROPÓLOS DO CEARÁ, 2015).
A criação de ovinos e caprinos no Ceará tem a seu favor a boa adaptabilidade dos animais ao clima semárido e um mercado de carne e pele com demanda não atendida e ainda em plena expansão. A existência de um centro de pesquisa como a Embrapa Caprinos em território cearense e a disponibilidade de material genético de qualidade das diversas raças no Estado são pontos positivos a serem mencionados (INSTITUTO AGROPÓLOS DO CEARÁ, 2015).
A utilização de tecnologias reprodutivas apresenta importante ferramenta na melhoria do potencial produtivo dos rebanhos ovinos e dentre as biotécnicas da reprodução, a inseminação artificial (I.A.) é aquela que propicia maior amplitude de resultados nos programas de melhoramento genético do rebanho, uma vez que, acelera o melhoramento genético, viabiliza a obtenção de produtos de reprodutores alojados em outros países ou até mesmo que já morreram, evita a transmissão de doenças venéreas e facilita a realização de testes de progênie além de possibilitar que machos subférteis produzam filhos (GOMES et al., 2010). Todavia, Hafez (2004) salienta que diferentemente de bovinos, a I.A. de ovelhas e cabras tem sido limitada, devido ao alto custo do trabalho, à dificuldade de identificar acuradamente reprodutores superiores e aos baixos índices de concepção, especialmente com sêmen congelado.
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Desta forma, os avanços da fronteira do conhecimento na área da biotecnologia associadas à reprodução de caprinos e ovinos apresentou aumento significativo nas últimas décadas graças ao uso de técnicas consagradas como a laparoscopia e ultrassonografia em tempo real e ao aumento de interesse pela reprodução destes animais (FONSECA et al., 2014).
A laparoscopia tem sido a técnica mais eficiente para a utilização de sêmen ovino congelado. Cada vez mais otimizada em rebanhos de animais puros de origem ou de elite, pela possibilidade de aquisição de sêmen congelado de reprodutores nacionais localizados em regiões distantes a do rebanho, e também por viabilizar a importação de material genético de importantes criatórios internacionais localizados em outros países ou continentes. As taxas de concepção normalmente são mais elevadas em relação a outras técnicas de inseminação em razão do local onde é depositado o sêmen, podendo variar de: 75% a 85% para sêmen puro; 60% a 65% para sêmen diluído refrigerado; 50% a 75% para sêmen congelado (FERNÁNDEZ et al., 1998).
A múltipla ovulação e transferência de embriões em pequenos ruminantes também já é uma realidade, devido à grande demanda por intensificação dos programas de melhoramento genético e sistemas produtivos nessas espécies. Todas essas ferramentas de controle, manipulação e potencialização da reprodução, se adequadamente orientadas, prestar-se-ão a inúmeras finalidades, desde a simples multiplicação em massa, passando pela preservação das espécies e raças e, chegando a obtenção, em escala, de fármacos com potencial de uso humano (FONSECA et al., 2014).
2.2 SÊMEN
O sêmen é uma suspensão celular líquida contendo espermatozoides e secreções do trato genital masculino. Os espermatozoides são produzidos nos testículos e a porção fluida (plasma seminal) desta suspensão é produzida pelas glândulas acessórias no momento da ejaculação. O plasma seminal é um componente essencial na cobertura natural, que serve como carreador e protetor dos espermatozoides (HAFEZ; HAFEZ, 2004).
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2.3 ANÁLISE ESPERMÁTICA
As avaliações espermáticas são realizadas conforme as normas do Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA, 2013), presentes no Quadro 1 e 2. Os ejaculados são avaliados quanto ao volume (ml), cor (branca ou amarelo-marfim para espécie ovina), odor (sui generis), aspecto (cremoso, leitoso ou aquoso), turbilhonamento (0-5), vigor (0-5), motilidade total (0-100%), viabilidade, morfologia e a concentração espermática, sendo esta, mensurada em câmara de Neubauer (espermatozoides/mm3) (CBRA, 2013).
Quadro 1 - Valores preconizados pelo CBRA (2013) para análise do sêmen ovino fresco
Parâmetros Valores
Volume (ml) 0,5 – 3,0
Cor Branca ou amarelo-marfim
Turbilhonamento (0-5) ≥ 3 Concentração (109 sptz/ml) 1 – 3 Motilidade (%) ≥ 80 Vigor (0-5) ≥ 3 Anormalidades (%) < 20 Fonte: CBRA (2013).
Quadro 2 - Valores preconizados pelo CBRA (2013) para análise do sêmen ovino descongelado Parâmetros Valores Concentração (106 sptz/ml) 400 Motilidade (%) ≥ 30 Vigor (0-5) ≥ 3 Fonte: CBRA (2013).
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2.3.1 Volume
O volume do ejaculado pode ser afetado pela idade do animal, estação, frequência de coletas (coletas com curtos intervalos reduzem o volume) ou tipos de equipamento utilizados nas coletas, como o eletroejaculador que tende a aumentar o volume do ejaculado pelo estímulo das glândulas sexuais acessórias. A mensuração do volume é determinada pela observação direta no recipiente coletor graduado (HAFEZ; HAFEZ, 2004). O volume do ejaculado pode variar de 0,5-3,0 ml em carneiros adultos (CBRA, 2013).
2.3.2. Turbilhonamento
O turbilhonamento é o movimento da massa em forma de ondas observado em uma alíquota de sêmen recém colhido em decorrência da interação da motilidade, do vigor e da concentração espermática. Para avaliação deste parâmetro coloca-se uma gota de sêmen sobre uma lâmina pré-aquecida a 37 °C e avalia-se em microscopia com um aumento de 100x. A análise é expressa em uma escala de 0 a 5, onde o zero significa a ausência de turbilhonamento, e o cinco significa o valor máximo dado a um acentuado movimento de massa (CBRA, 2013).
2.3.3 Cinética
A motilidade espermática é fundamental para que os espermatozoides alcancem o ambiente uterino e o local de fertilização, sendo uma das mais importantes características para a avaliação do potencial de fertilidade da célula espermática. Entretanto, os resultados das avaliações microscópicas dependem de diversos fatores, tais como: meio utilizado na diluição seminal, taxas de diluição, temperatura e tempo de realização durante a avaliação. Na avaliação convencional, a motilidade espermática é estimada visualmente em microscopia óptica e com análise de uma gota de sêmen diluído entre lâmina e lamínula (CAVALCANTE et al., 2005).
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Os sistemas de análises computadorizadas têm substituído a avaliação de sêmen por microscopia de luz convencional, uma vez que proporcionam informações mais detalhadas e objetivas sobre várias características da motilidade e da morfometria, além de imprimir maior repetibilidade às observações do que a habilidade do técnico em identificar padrões de motilidade espermática (CAVALCANTE et al., 2005).
Atualmente, vários sistemas de análises computadorizadas das células espermáticas (CASA) estão disponíveis comercialmente, como Hamilton
Thorn (Hamilton Thorn Research, Bervely, USA); IMAGESP® (Vimas
IMAGESP®, Barcelona, Espanha); Hobson Sperm Tracker (Hobson Tracking Systems Ltda., Sheffield, Inglaterra) e Sperm Class Analyzer® (Microptic SL,
Barcelona, Espanha), SM-CMATM (MTM Medical Technologies, Montreaux,
Suíça), QualiSpermTM, 1.3 (Biophos, Pfäffikon, Suíça), entre outros. No entanto, apesar de serem mais recomendados, ainda possuem uma grande desvantagem quanto ao uso prático na rotina veterinária, principalmente devido ao alto custo dos equipamentos (ARRUDA et al., 2011).
Os principais parâmetros da cinética espermática avaliados pelo sistema CASA estão demonstrados no quadro 3. Os três parâmetros de velocidade (VCL, VAP, VSL) (Fig. 1), são comumente utilizados para descrição geral do movimento do espermatozoide (MORTIMER, 2000).
Figura 1 – Velocidades e amplitude de deslocamento lateral da cabeça do Sperm
Class Analyzer (SCA®, Microptics, S.L., Barcelona, Espanha)
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Quadro 3 - Parâmetros de motilidade espermática obtidos através do Sperm
Class Analyzer (SCA®, Microptics, S.L., Barcelona, Espanha)
Parâmetro Sigla Unid. Descrição
Motilidade total MT % Percentual de células móveis na concentração espermática total Motilidade
progressiva MP %
Percentual de células móveis com movimento progressivo na
concentração espermática total Velocidade
curvilinear VCL µm/s
Velocidade da trajetória real do espermatozoide
Velocidade média da trajetória
VAP µm /s Velocidade da trajetória média do espermatozoide
Velocidade
linear VSL µm /s
Velocidade em função da linha reta estabelecida entre o primeiro e último ponto da trajetória do espermatozoide
Fonte: MORTIMER (2000).
2.3.4 Concentração
A concentração espermática representa o número de espermatozoide por milímetro cúbico (mm³) ou centímetro cúbico (cm³). Ela é determinada por hemocitômetro ou Câmara de Neubauer, uma lâmina microscópica com câmaras traçadas com precisão, onde conta-se o número de espermatozoide manualmente. Uma determinação acurada do número de espermatozoides e do volume do ejaculado pode determinar quantas fêmeas podem ser inseminadas (HAFEZ; HAFEZ, 2004).
De acordo com o CBRA (2013), o número de espermatozoides desejáveis por palhetas para o sêmen ovino criopreservado é de 100x106 para
via cervical, já a dose inseminante para via transcervical é de 150 a 200x106 e
para via laparoscópica de 40x106.
2.3.5 Viabilidade
A viabilidade espermática está relacionada com a integridade da membrana plasmática. Esta pode ser avaliada através de colorações vitais, onde
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os espermatozoides que possuem integridade de membrana, não são corados (viáveis) e os que não possuem, permitem a entrada do corante no citoplasma (não viáveis). Dentre os corantes utilizados podem ser citados, além da eosina nigrosina, o azul de tripan, o Giemsa e o azul de bromofenol (CHEMINEAU et
al., 1991; DERIVAUX, 1980).
Para análise da viabilidade são confeccionados esfregaços em lâmina pré-aquecida a 37 ºC utilizando 5 μl do corante eosina nigrosina (eosina 1 g, nigrosina 2 g, citrato de sódio 3,57 g e água destilada q.s.p. 100 ml - BARIL et
al., 1993), adicionado a 5 μl do sêmen rediluído.
2.3.6 Dispersão da cromatina (SCD Teste)
A integridade do DNA espermático é essencial para a correta transmissão da informação genética. Sua estrutura é altamente compacta e complexa. Sendo assim, qualquer forma de anormalidades na cromatina ou danos ao DNA pode resultar em infertilidade masculina (SOUSA; SANTOS; SANTOS, 2010).
A biologia molecular voltada à área da reprodução tem resultado em inúmeras técnicas para a avaliação da qualidade da cromatina espermática e para a determinação da fragmentação do DNA espermático. Atualmente, as tecnologias utilizadas são as que medem a capacidade da cromatina e do DNA em sofrer desnaturação diante de vários tratamentos [técnicas: SCSA (Sperm
Chromatin Structure Assay); COMETA (Single-cell gel electrophoresis-SCGE); e
o SCD test (teste de Dispersão da Cromatina Espermática)] (SERGERIE et al., 2005).
O teste de Dispersão da Cromatina Espermática (SCD) verifica a fragmentação de DNA, de maneira direta, é um teste simples, prático, rápido, preciso e que apresenta alta reprodutibilidade. A metodologia do SCD consiste na utilização de uma solução ácida, geralmente ácido clorídrico e, posteriormente, as amostras são colocadas em solução de lise contendo detergentes, além de conter um agente redutor capaz de clivar pontes de enxofre e de desnaturar as ribonucleases (FERNÁNDEZ et al., 2005).
No teste de Dispersão da Cromatina Espermática (SCD test), visualizam-se dois morfonucleotipos diferentes: 1- compacto ou com pequeno
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halo (DNA fragmentado); 2-com largo ou moderado halo (DNA intacto), sendo considerado aceitável as amostras que apresentam mais de 70% das células espermáticas com o DNA íntegro (Fig. 2) (FERNÁNDEZ et al., 2005).
Figura 2 - Teste de dispersão da cromatina. Célula com DNA íntegro (halo) e célula com DNA fragmentado (sem halo)
Fonte: Elaborada pela própria autora.
2.3.7 Atividade mitocondrial (3,3’- diaminobenzidine - DAB)
A mitocôndria está localizada na peça intermediária do espermatozoide, e possui um importante papel no metabolismo celular, produzindo energia necessária para a movimentação do flagelo, sendo fundamental para a motilidade espermática e de suma importância para o transporte do material genético atingir o sítio de fertilização (CELEGHINI, 2005). Além disso, atividade mitocondrial está relacionada com a produção das espécies reativas de oxigênio (EROs), e com o estresse oxidativo, podendo este ser letal às células espermáticas. Estudos vêm demonstrando correlações negativas tanto entre o estresse oxidativo e a integridade de DNA quanto com a atividade mitocondrial, indicando a ocorrência de uma interação, formando possivelmente um único mecanismo patogênico (BLUMER et al., 2012).
Com base nessa correlação da atividade mitocondrial e a motilidade espermática, Hrudka (1987) propôs uma técnica citoquímica que detecta a atividade mitocondrial. Esta técnica é baseada na oxidação da 3,3'-diaminobenzidine (DAB) pelo Complexo Citocromo C, o que inclui a enzima Citocromo C-Oxidase (CCO), através de uma reação em cadeia na qual o
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reagente é polimerizado e se deposita nos locais onde ocorre a reação, ou seja, se restringe à mitocôndria (Fig. 3). Esta deposição pode ser identificada através de microscopia convencional ou contraste de fase pela sua coloração marrom. Sendo considerado satisfatório quando amostras apresentam o percentual de alta e média atividade mitocondrial superior a 50%. Desta maneira, é possível descrever o declínio espontâneo da CCO ocasionado por tratamentos físicos e/ou químicos aos que os espermatozoides são submetidos (HRUDKA, 1987).
Figura 3 – Avaliação da atividade mitocondrial. Espermatozoide com alta (I), média (II) e baixa (III) atividade mitocondrial
Fonte: Elaborada pela própria autora.
2.4 CONSERVAÇÃO SEMINAL
2.4.1 Refrigeração
Diversos fatores podem influenciar no metabolismo aeróbio da célula espermática, podendo ser citados principalmente a temperatura e o pH. Diante disso, tem sido estudado procedimentos tecnológicos visando prolongar a vida dos espermatozoides, uma vez que temperaturas mais baixas e a acidez podem modificar as ligações entre as enzimas que atuam sobre o ATP e as proteínas responsáveis pela contração. Desta forma, reduzida a motilidade, a célula espermática diminui seu gasto de energia, prolongando a viabilidade espermática (MIES FILHO, 1987).
I- Alta II- Média III- Baixa
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Entre as principais vantagens da refrigeração seminal, está a manutenção da viabilidade espermática por um período prolongado, com a minimização da redução da capacidade fertilizante dos espermatozoides. Outra característica importante é a possibilidade de diminuir o estresse imposto aos reprodutores pelo número excessivo de cópulas diárias durante a estação reprodutiva, podendo prejudicar os índices reprodutivos do rebanho (BISPO, 2005).
A refrigeração é caracterizada pela redução da temperatura que inicialmente encontra-se em torno de 37 °C e decresce a temperaturas próximas a 0 °C. Para promover essa queda na temperatura, recomenda-se o uso de equipamentos convencionais como refrigerador, garrafas térmicas ou caixas isotérmicas com gelo, ou ainda, equipamentos automatizados (CÂMARA; GUERRA, 2011).
O processo de refrigeração do sêmen, de 30 °C a 0 °C deve ser realizado de maneira constante e homogênea, evitando variações bruscas que ocasionem o choque térmico e a redução da viabilidade espermática. Quando realizado de forma abrupta pode ocasionar um estresse letal às células espermáticas, e quando realizado lentamente ocasionará uma tensão na membrana celular dos espermatozoides (WATSON, 2000).
2.4.2 Congelação
Uma vez que se tem conhecimento da necessidade de se maximizar o potencial biológico da espécie ovina a fim de aumentar os índices de produtividade, a inseminação artificial associada à congelação seminal tem sido instrumentos importantes para o melhoramento genético dos rebanhos e para um incremento de produtividade dos mesmos (LEBOEUF et al., 1998).
A possibilidade de armazenar doses de sêmen por um período indefinido para posterior utilização é uma das maiores vantagens da congelação seminal nos programas de inseminação artificial na maioria das espécies domésticas. Outras vantagens são a redução de custos com a aquisição e transporte de reprodutores e favorecimento da rápida difusão de material genético entre regiões, países e continentes.
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Entretanto, o sucesso da criopreservação de sêmen é apenas parcial, uma vez que a viabilidade espermática do sêmen congelado/descongelado em geral é menor quando comparada ao sêmen refrigerado, devido ao grande número de espermatozoides que são destruídos e danificados durante o processo (WATSON, 2000).
Esses danos têm sido atribuídos às mudanças de temperaturas, à formação de cristais de gelo, aos estresses oxidativos e o gradiente osmótico, ocasionando uma série de alterações estruturais, resultando em danos à membrana plasmática e acrossomal, bem como a outras estruturas espermáticas (WATSON, 2000).
As crioinjúrias podem ser minimizadas quando se adiciona crioprotetores penetrantes e não penetrantes ao diluente, a fim de evitar a formação dos cristais de gelo. Na espécie ovina o crioprotetor penetrante mais utilizado é o glicerol e o não penetrante é a gema de ovo (PURDY, 2006).
Após o processo de diluição, o sêmen ovino pode ser armazenado em palhetas francesas de 0,25 ml ou 0,5 ml. Bezerra (2009) avaliou a influência do volume das palhetas de 0,25 e 0,5 ml sobre a qualidade do sêmen caprino descongelado e concluiu que o envase nesta última promove maiores resultados de motilidade progressiva após a descongelação, sendo esta, portanto, a mais recomendada para nesta espécie.
2.5 DILUENTES SEMINAIS
Os diluentes permitem o aumento do volume total do ejaculado, facilitando sua divisão em doses inseminantes e proporcionando um meio favorável para a sobrevivência dos espermatozoides in vitro, uma vez que, os espermatozoides não sobrevivem por muito tempo no sêmen in natura (DERIVAUX, 1980).
Na conservação seminal, em geral, um bom diluente deve apresentar as seguintes características: pressão osmótica compatível com a espécie, balanço mineral apropriado, combinação ajustada de nutrientes, capacidade de neutralizar produtos tóxicos originados do metabolismo espermático, proteção contra os danos causados por ação das mudanças de temperatura, bem como
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proporcionar a estabilidade dos sistemas enzimáticos e a integridade da membrana plasmática (AMANN; PICKETT, 1987).
2.5.1 Água de coco em pó
A água de coco (Cocos nucifera L.) é uma solução natural, ácida e estéril, composta de sais, proteínas, carboidratos, vitaminas, gorduras neutras e uma pequena quantidade de fosfolipídios além de indutores da divisão celular e eletrólitos diversos, que apresenta ausência de toxicidade, osmolaridade semelhante ao do sêmen, pH favorável a sobrevivência e viabilidade das células espermáticas (SALGUEIRO et al., 2002).
Desta forma, estudos tem apresentado resultados positivos da água de coco na manutenção da viabilidade e poder fecundante dos espermatozoides em experimentos in vitro e in vivo, sendo possível sua utilização em processos biotecnológicos, como a inseminação artificial, sem os custos elevados com diluentes importados (NUNES, 1998).
A água de coco tem sido utilizada na biotecnologia da reprodução animal obtendo-se bons resultados na preservação do sêmen de animais domésticos como caprinos (MELO, 2010), ovinos (CAVALCANTE et al., 2008), suínos (TONIOLLI; MESQUITA, 1990) e canídeos (UCHOA, 2004).
A água de coco recomendada para o uso em diluentes seminais é a proveniente de frutos com quatro a seis meses de maturação, composta principalmente por carboidratos, aminoácidos, vitaminas e minerais. Além desta composição, estudos cromatográficos realizados visando isolar a fração da água de coco que atua sobre o espermatozoide, identificaram a presença do ácido 3-indol-acético, substância com ação hormonal estimuladora do crescimento de vegetais, a qual demonstrou atividade sobre o metabolismo dos espermatozoides (NUNES; COMBARNOUS, 1995).
Com o intuito de simplificar a utilização da água de coco como diluente padronizaram na forma de pó (Fig. 4), recebendo a denominação de ACP, permitindo a conservação de suas características benéficas e facilitando o seu uso em regiões onde não se dispõe do fruto (NUNES; SALGUEIRO, 2011).
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Figura 4. Água de coco em pó (ACP)
Fonte: ACP Biotecnologia
2.6 CRIOPROTETORES
Para o sucesso na criopreservação dos espermatozoides é necessário observar uma série de fatores, visando à redução dos danos causados às células espermáticas, assegurando a longevidade in vitro e in vivo. Dentre esses fatores podemos citar: a taxa de diluição, os diluentes, os crioprotetores, a taxa de refrigeração e a manutenção da temperatura (FARSTAD, 1996).
Em relação ao crioprotetor não-penetrante, este não consegue atravessar a membrana plasmática e age extracelularmente. Assim, ele pode atuar como um soluto e reduzir a temperatura de congelação do meio. Já os crioprotetores penetrantes, são permeáveis à membrana plasmática e agem intra e extracelularmente. Como são solúveis, causam a desidratação do espermatozoide devido ao fluxo de água osmoticamente direcionado. Após curtos períodos de tempo, o crioprotetor e a água se equilibram, resultando em iguais concentrações extra e intracelulares (BEZERRA, 2010). Muitos crioprotetores penetrantes (glicerol, dimetilsulfóxido, dimetilformarmida, etilenoglicol, propilenoglicol) e suas combinações têm sido testadas, todavia, o crioprotetor penetrante mais frequentemente utilizado continua sendo o glicerol, apresentando-se com os melhores resultados (BEZERRA, 2009).
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Quando o sêmen é submetido a temperaturas de 4 a 5 °C, as células espermáticas necessitam de uma proteção contra as lesões na membrana plasmática. Desta maneira, substâncias ricas em lipoproteínas, como o leite, e principalmente, a gema de ovo tem sido amplamente utilizada como crioprotetores externos para criopreservação de sêmen ovino.
2.6.1 Glicerol
Um dos crioprotetores internos mais utilizados é o glicerol, um composto orgânico, pertencente à função álcool, liquido na temperatura ambiente, inodoro, incolor, viscoso (FERNANDES et al., 2002). Este tem a capacidade de penetrar na célula espermática através de difusão passiva, permanecendo na membrana e no citoplasma, isso faz com que o meio fique hipertônico, e promove a desidratação da célula, prevenindo a formação de cristais de gelo dentro da célula (PURDY, 2006).
A adição de glicerol pode ser feita em dois momentos: na diluição inicial (One step), quando o sêmen ainda está em temperatura ambiente ou após a refrigeração do sêmen a 4 °C (Two steps), com o intuito de reduzir o efeito tóxico do glicerol (SILVA; GUERRA, 2011).
Apesar de o glicerol ser o crioprotetor mais utilizado nos diluidores de congelação do sêmen ovino, alguns autores observaram efeitos deletérios aos espermatozoides como: estresse osmótico, mudanças na organização, fluidez e permeabilidade da membrana plasmática, assim como desorganização da sua composição lipídica (WATSON, 1995).
Devido a esses efeitos negativos, alguns estudos têm dado preferência à adição do glicerol somente após a refrigeração do sêmen à temperatura de 5 ºC (FISER; FAIRFULL, 1989), realizando a diluição em duas etapas. Porém, nos dias atuais, a diluição em uma etapa é preferencialmente utilizada, com bons resultados, e não há nenhuma evidência convincente que suporte a necessidade da utilização do procedimento mais trabalhoso (SALAMON; MAXWELL, 2000).
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O esclarecimento do papel de lipídeos e proteínas presentes na gema de ovo sobre a proteção da membrana espermática pode, indiretamente, evidenciar a natureza das mudanças de membrana que ocorrem durante a refrigeração e a congelação (FARSTAD, 1996). Com base nisso, fosfolipídios, fosfatidilcolina, frações lipoproteicas e lipoproteínas específicas passaram a ser estudados, a fim de se entender os mecanismos de crioproteção da gema de ovo.
A principal função protetora da gema de ovo é estabilizar as membranas biológicas, minimizando os efeitos negativos do choque térmico. Entretanto, existem diversas teorias quanto ao mecanismo de ação da gema de ovo na célula espermática durante a criopreservação seminal (HOLT, 2000).
Em 1974, Pace e Graham tentaram purificar e estabelecer a fração da gema responsável pela proteção dos espermatozoides bovinos congelados separando a gema nas seguintes frações: a granular, a fração solúvel crua e a de baixa densidade crua. Nenhum componente protetor foi encontrado nas frações solúvel crua e granular, diferentemente do observado na fração de baixa densidade crua, que protegeu tão bem quanto a gema de ovo total (PACE; GRAHAM, 1974).
Sugere-se que sua ação seja devido à presença de lipoproteínas de baixa densidade, que atuariam na membrana plasmática do espermatozoide, restaurando a perda de fosfolipídios e aparentemente induzindo uma alteração transitória de sua composição, consequentemente, prevenindo a ruptura da membrana plasmática (FARSTAD, 1996).
Foulkes (1977) propôs que os componentes da gema se ligariam firmemente às membranas espermáticas bovinas, exercendo papel protetor ao estabilizarem a membrana durante a refrigeração, ou ao conseguirem manter a pressão coloidal do meio externo.
Outros estudos sugerem que os fosfolipídios presentes nas lipoproteínas de baixa densidade protegem os espermatozoides pela formação de um filme protetor na superfície celular durante a congelação (QUINN; CHOW; WHITE, 1980).
Apesar dos efeitos benéficos da gema de ovo, as desvantagens dos diluentes que a utilizam são atribuídas aos seguintes fatores: opacidade óptica, causada pelos grânulos formados, que dificultam o exame imediato através da
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avaliação microscópica; prejuízo causado à respiração espermática; diminuição da motilidade. Além disso, podem transportar micro-organismos patogênicos (BOUSSEAU et al., 1998).
A contaminação do ovo é decorrente de sua estrutura, uma vez que a casca do ovo é porosa, sua a cutícula não sela completamente os poros da casca do ovo, cerca de 1% permanecem abertos. Através destes poros com medidas de 5 a 35 µm de diâmetro que ocorrem as trocas gasosas por difusão com os vasos sanguíneos da membrana e o meio externo, e permitindo também a entrada de bacilos Gram-negativos e leveduras, como o Saccharomyces. O período de eficiência da cutícula é de aproximadamente quatro a 5 dias, quando ocorre o desprendimento da superfície dos ovos e um numero maior de microorganismos conseguem penetrar no interior do ovo (DE REU et al., 2006).
No entanto, a estrutura glicoproteíca denominada cutícula, que recobre a totalidade da superfície externa da casca, possui um aspecto similar ao de uma esponja, o que facilita a entrada de ar, mas impede a entrada de microrganismos. A casca e cutícula intactas previnem a entrada dos microrganismos no interior do ovo, pelo que é necessário tomar certas medidas de modo a garantir a manutenção da integridade e segurança dos ovos. A lavagem, a abrasão, os golpes, o envelhecimento, entre outros fatores, podem ocasionar a perda da integridade protetora física natural do ovo. E mesmo que a cutícula do ovo se mantenha intacta, a casca pode estar contaminada, proporcionando um risco adicional, uma vez que ao tocar na casca com as mãos, nas superfícies e ao partir os ovos, os microrganismos podem ser inoculados (CERVI, 2012).
Os microorganismos mais comuns que podem ser encontrados em ovos são: vírus (Reoviridae, Retrovirídae, Picornaviridae, Ortomyxoviridae, Adenovírus, Oncovirinae e Circoviridae); Bactérias (Streptococci, Salmonella spp., Escherichia colli, Staphylococci, Campylobacter, Mycobacterium Clamydophila psittaci e Chlamydia); Mycoplasmas (M. synoviae, M. gallisepticum) e Fungos (Aspergillus) (JORDAN; PATTISON, 1998).
Devido essas características do ovo, foram realizados trabalhos avaliando a contaminação, tanto das gemas de ovos puras como dos diluentes à base de gema de ovo, observando sistematicamente a contaminação por bactérias, independentemente da sua fonte inicial. Além disso, os preparativos,
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incluindo as gemas de ovos de uma fonte industrial (em pó ou líquido), apresentaram os maiores níveis de contaminação, enquanto que nenhuma diferença óbvia pode ser detectada entre reparações, incluindo ovos de fazenda e de mercado. E mesmo quando adicionado antibióticos aos diluentes, as duas preparações finais de diluentes à base de gema de ovo (Triladyl) e leite (Laiciphos) foram contaminadas com bactérias, sendo uma possível fonte de endotoxinas capaz de danificar a capacidade fertilizante dos espermatozoides. Em contraste, nenhum dos 6 lotes de Biociphos plus (lecitina de soja) mostrou qualquer vestígio de contaminação (BOUSSEAU et al., 1998).
Como consequência direta, a maioria dos países temem o risco de introduzir doenças através do transporte de produtos à base de leite ou de ovos Um inventário internacional das numerosas causas de contaminação do sêmen processado resultou na identificação de etapas críticas e uma abordagem semelhante à que está em uso para outros produtos, como alimentos, conhecidos como Análise de Perigos e Controle de Pontos críticos, a qual tem sido utilizada na França e na Holanda (THIBIER; GUERIN, 2000).
Desta forma, a indústria de IA não é totalmente livre de microorganismos patogênicos e consequentemente pode causar riscos biológicos, como por exemplo, a doença da vaca louca detectada no Canadá. Além disso, a detecção do vírus da gripe aviária (H2N1) nas aves domésticas que também afetou consideravelmente a indústria. Então, a inclusão de suplementos de origem animal ao diluente de sêmen oferece risco mínimo, mas potencial, a transmissão de patógenos. É por isso que alguns centro de pesquisa desenvolvem atualmente diluentes sintéticos que não contêm suplementos de proteína animal, mas sim várias fracções lipídicas de plantas (BLONDIN, 2006).
2.5.3 Óleos vegetais
O óleo de palma é um óleo vegetal extraído da fruta encontrada nas palmeiras (Elaesis guineensis). É constituído por ácidos graxos, sendo 50% de ácidos graxos saturados, 40% de ácidos graxos monoinsaturados e 10% de ácidos graxos poli-insaturados, tendo em sua composição: ácido palmítico, ácido esteárico, ácido mirístico e ácido láurico de cadeia média. Além disso, o óleo de
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palma é rico em antioxidantes conhecidos como carotenóides, incluindo beta-caroteno (HIPERTROFIA, 2017).
Atualmente, o óleo de palma tem sido estudo em diversas áreas, principalmente em relação aos benefícios à saúde humana, como por exemplo: protetor contra as doenças coronarianas, antioxidante biológico contra arteriosclerose, anticancerígeno no câncer mamário. Além disso, também é utilizado na indústria cosmética, produção de sabões, velas etc (MANOEL NETO, 2008).
Outro óleo que tem sido estudado é o óleo de coco, obtido a partir da polpa do coco fresco maduro (Cocos nucifera L.), o qual é composto por duas frações, a "fração lipídica" que contém ácidos graxos saturados (mais de 80%) e ácidos graxos monoinsaturados com 5%, e ácidos graxos poli-insaturados de 2%. A "fração não lipídica" ainda não é elucidada; no entanto, sugere-se que a fração não lipídica contém compostos fenólicos tais como os antioxidantes (HETTIARACHCHI; JEEWANDARA, 2011).
Os ácidos graxos saturados presentes no óleo de coco são: capróico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico e esteárico e os insaturados são: oleico e linoleico. O óleo de coco é rico em ácido láurico, com concentração acima de 40%. As gorduras láuricas, caso do óleo de coco, são resistentes à oxidação não enzimática e ao contrário de outros óleos e gorduras apresentam temperatura de fusão baixa e bem definida (24,4 - 25,6 ºC) (SILVA NETO et al., 2013).
Atualmente, o óleo de coco tem sido estudado em diversas áreas, principalmente em relação aos benefícios à saúde humana, como por exemplo: redução da diabetes, melhoria no quadro de pacientes com Alzheimer, perda de peso, controle do colesterol e prevenção de diversas doenças cardiovasculares através de seu efeito hipolipidêmico. Esses benefícios estão relacionados à sua atividade antioxidante e sua composição lipídica (HETTIARACHCHI; JEEWANDARA, 2011).
Estudos tem demonstrado também que dieta enriquecida com óleo de coco virgem em ratos melhora a capacidade antioxidante, aumenta às atividades de catalase, superóxido dismutase, glutationa peroxidase e glutationa redutase no fígado, coração e rins. O óleo de coco virgem também preveniu o estresse
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oxidativo, indicado pela diminuição da formação de peroxidação lipídica e oxidação de proteínas (ARUNIMA; RAJAMOHAN, 2013).
Del Valle et al. (2013) estudando a função dos espermatozoides ovinos congelados, utilizaram diluentes complementados com caseína e óleos vegetais (palma e coco), e observaram que nenhum dos meios quimicamente definidos utilizados no estudo pós-descongelação obtiveram resultados melhores quando comparados ao diluente contendo gema de ovo. No entanto, eles concluíram que apesar de não ter sido demonstrado efeito superior desses óleos na qualidade seminal pós-descongelação, são ainda necessárias mais pesquisas sobre assunto.
Andreev et al. (2008), ao avaliarem o efeito de lipídios na formação de cristais de gelos durante a congelação de células espermáticas de Truta, observaram que eles são capazes de impedir o crescimento dessas estruturas de cristais de gelo, e recomendam a sua utilização como aditivos para melhorar as propriedades crioprotetoras do meio diluente utilizado.
Santos (2013) avaliando o efeito da adição de óleo de coco em meio de conservação à base de água de coco em pó (ACP-101c) em sêmen caprino criopreservado nas concentrações de 2,5%, 4%, 10% e 20%, não obteve resultados superiores ao meio de conservação contendo a gema de ovo como crioprotetor. Entretanto, observou que o óleo apresentou um possível potencial crioprotetor quando adicionadas concentrações 2,5 e 4%, sugerindo mais estudos.
O óleo de coco extra virgem orgânico de origem comercial do grupo empresarial FidBō, possui o certificado de produtos orgânico do Brasil, garantindo ausência de contaminantes, padronização e confiabilidade das amostras (DR.ORGÂNICO, 2017) (quadro 4).
Quadro 4. Composição do óleo de coco extra virgem orgânico
NUTRIENTES UNID. 100g
Energia Kcal 867
Proteína g 0.00
40 Carboidratos g 0.00 Fibra total g 0.00 Açúcar total g 0.00 MINERAIS Sódio (Na) mg 0.00 LIPÍDIOS
Ác. Graxos saturados totais g 86.670
Ác. Graxos monoinsaturados totais g 3.330 Ác. Graxos poliinsaturados totais g 3.330
Ác. Graxos trans totais g 0.00
Colesterol mg 0.00
Fonte: USDA, 2017.
Estudos previamente realizados pelo laboratório de Tecnologia do sêmen de Caprinos e Ovinos da Universidade Estadual do Ceará, avaliando a adição de 2,5%, 5%, 10% e 20% de óleo de coco extra virgem ao meio de conservação à base de água de coco em pó (ACP-102c) em sêmen ovino criopreservado, observou possível ação crioprotetora quando adicionadas as concentrações de 10 e 20%.
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3 JUSTIFICATIVA
Os meios de conservação existentes para o sêmen ovino, em sua quase totalidade, possuem em sua composição substâncias de origem animal como a gema de ovo ou o leite desnatado, o que implica em risco biológico potencial, comprometendo o comércio internacional de doses de sêmen e, ocasionando uma redução na difusão de material genético de alto valor.
Desta forma, o presente estudo se justifica pela necessidade mundial do desenvolvimento de meios de conservação seminal que sejam livres de produtos de origem animal.
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4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
O meio de criopreservação seminal à base água de coco em pó adicionado de óleo de coco extra virgem mantém a qualidade espermática do sêmen ovino pós-descongelação.
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5 OBJETIVOS
5.1 GERAL
Avaliar o efeito do diluente à base de água de coco em pó (ACP-102c) adicionada de óleo de coco extra virgem na criopreservação de sêmen ovino.
5.2 ESPECÍFICOS
- Determinar a concentração ideal de óleo de coco extra virgem a ser adicionada ao meio de criopreservação à base de água de coco em pó (ACP-102c) do sêmen ovino;
- Avaliar os efeitos do diluente à base de água de coco em pó e do crioprotetor de origem vegetal nas células espermáticas comparado ao diluente TRIS adicionado de gema de ovo após a descongelação através da avaliação da:
(a) cinética espermática: motilidade total, VCL, VSL e VAP; (b) atividade mitocondrial;
(c) integridade do DNA; (d) viabilidade espermática.
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6 CAPÍTULO I
Criopreservação de sêmen ovino em meio à base de água de coco em pó (ACP-102c) adicionada de óleo de coco extra virgem
Cryopreservation of ram sperm in extender based on powered coconut water (ACP-102c) added with extra virgin coconut oil
Periódico: Pesquisa Veterinária Brasileira (Submetido em 19 de junho de 2017)
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Criopreservação de sêmen ovino em meio à base de água de coco em pó (ACP-102c) adicionada de óleo de coco extra virgem1
Bruna F. Brito2*, Bárbara M. B. Santos3, Leonardo A. R. Cabral², Thalles G.P. Nunes 2, Francisco J. R. Silveira Jr.4, Annice A. Cortez 2, Cristiane C. M. Salgueiro3, José F. Nunes²
ABSTRACT.- Bruna F. Brito²*, Bárbara M. B. Santos³, Leonardo A. R. Cabral², Thalles G.P. Nunes 2, Francisco J. R. Silveira Jr. 4, Annice A. Cortez 2, Cristiane C. M. Salgueiro3 & José F. Nunes. 2017. [Cryopreservation of ram sperm in extender based on powdered coconut water (ACP-102c) added with extra virgin coconut oil] Criopreservação de sêmen ovino em meio à base de água de coco em pó (ACP-102c) adicionada de óleo de coco extra virgem. Pesquisa Veterinária Brasileira 00(0):00-00. Universidade Estadual do Ceará, Avenida Silas Munguba,1700, Campus Itaperi,
Fortaleza, Ceará, 60.714-903, Brasil. *Autor para correspondência: britobf@live.com
The objective of this study was to evaluate the effect of the extender based on powdered coconut water (ACP-102c) added with extra virgin coconut oil on the cryopreservation of ovine sperm. The experiment was carried out at the Laboratory of the Goat and Sheep Sperm Technology (LTSCO) and Fazenda Ouro Branco, Ceará, Brazil. The sperm of five Dorper rams was collected with the aid of an artificial vagina; then assembled in a pool, divided into four equal aliquots and diluted in one step in the extenders: T1 (TRIS + 20% egg yolk), T2 (ACP-102c + 20% egg yolk + 7% glycerol), T3 (ACP-102c + 10% coconut oil + 7% glycerol), and T4 (ACP-102c + 20% coconut oil + 7% glycerol). The samples were packaged and submitted to a refrigeration curve (0.35 °C / min.), stabilized at 4 °C for 2 h, frozen in nitrogen vapor (-60 °C) and stored in liquid nitrogen (-196 °C). After thawing, the samples were evaluated for the following sperm quality parameters: total motility (MT), curvilinear velocity (VCL), linear velocity (VSL), mean velocity (VAP), sperm viability, DNA fragmentation, and mitochondrial activity (p < 0.05). According to the results, T3 differed from control treatments only for MT; however, this remained within the values recommended by the Manual of the Brazilian College of Animal Reproduction. Thus, it can be concluded that ACP-102c extender added with 10% coconut oil is efficient in maintaining the quality of cryopreserved ovine spermatozoa.
INDEX TERMS: Ovine, sperm, freezing, coconut water, coconut oil.
RESUMO.- Objetivou-se avaliar o efeito do diluente à base de água de coco em pó (ACP-102c)
adicionado de óleo de coco extra virgem na criopreservação de sêmen ovino. O experimento foi realizado no Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino (LTSCO) e na Fazenda Ouro Branco, Ceará, Brasil. O sêmen de cinco ovinos da raça Dorper foi coletado com o auxílio de vagina artificial; em seguida, reunidos em um pool, dividido em quatro alíquotas iguais e diluídas em um step nos diluentes: T1 (TRIS + 20% gema de ovo), T2 (ACP-102c + 20% gema de ovo + 7% glicerol), T3 (ACP-102c + 10% óleo coco + 7% glicerol) e T4 (ACP-102c + 20% óleo de coco + 7% glicerol). As amostras foram envasadas e submetidas a uma curva de refrigeração (0,35 °C/min.), estabilizadas a 4 °C por 2h, congeladas em vapor de nitrogênio (-60 °C) e armazenadas em nitrogênio líquido (-196 °C). Após a descongelação, as amostras foram avaliadas quanto aos seguintes parâmetros de qualidade espermática: motilidade total (MT), velocidade curvilinear (VCL), velocidade linear (VSL), velocidade média do percurso (VAP), viabilidade espermática, fragmentação do DNA, e atividade mitocondrial (p < 0,05). De acordo com os resultados, o T3 foi inferior aos tratamentos controle apenas quanto à MT (p<0.05); no entanto, este se manteve dentro dos valores preconizados pelo Manual do Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. Desta forma, pode-se concluir que o meio
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2 Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), Universidade Estadual do Ceará
(UECE), Av. Dr. Silas Munguba,1700, Campus Itaperi, Fortaleza, Ceará, 60.714-903, Brasil. Pesquisa de Mestrado com o apoio FUNCAP/CAPES/CNPq.*Autor para correspondência: britobf@live.com,
leocabral1991@gmail.com, thalles_gothardo@hotmail.com, annicevet@gmail.com,
nunesuece@gmail.com.
3 Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO), UECE, Av. Dr. Silas Munguba,1700, Campus Itaperi,
Fortaleza, Ceará, 60.714-903, Brasil. barbarabandeiras@hotmail.com, crismelloacp@gmail.com.
4 Faculdade Tecnológica do Nordeste,Rua Coronel Correia, 1119, Soledade, Caucaia, Ceará,
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102c adicionado de 10% óleo de coco é eficiente na manutenção da qualidade dos espermatozoides ovinos criopreservados.
TERMOS DE INDEXAÇÃO: Ovino, sêmen, congelação, água de coco, óleo de coco.
INTRODUÇÃO
As biotecnologias de conservação de sêmen ovino são de fundamental importância, uma vez que possibilitam a preservação do material genético, permitem a implantação das mesmas em diversas regiões, devido à facilidade de transporte do material genético e, consequentemente, uma melhoria nos rebanhos.
Dentre as biotecnologias de conservação seminal recomenda-se a criopreservação, uma vez que os espermatozoides não sobrevivem por muito tempo no sêmen in natura, tornando-se necessário a adição de diluentes para otimizar o meio que o envolve e manter a sua sobrevivência. Esses diluentes fornecem proteção contra os produtos do metabolismo espermático e as mudanças de temperatura, principalmente, nos processos de criopreservação.
Um bom diluente deve apresentar ausência de toxicidade, osmolaridade semelhante ao do sêmen, pH favorável e ser de preparação simples e de baixo custo. Características essas que estão presentes no diluente à base de água de coco, promovendo a sobrevivência e viabilidade dos gametas masculinos (Nunes 1998).
A água de coco tem apresentado resultados positivos na manutenção da viabilidade e poder fecundante dos espermatozoides em experimentos in vitro e in vivo, sendo possível sua utilização em processos biotecnológicos, como a inseminação artificial, sem os custos elevados com diluentes importados (Nunes 1998). Devido aos excelentes resultados obtidos nos primeiros estudos com água de coco in natura, foi desenvolvido um meio de conservação seminal à base de água de coco em pó (ACP), caracterizado pela padronização e estabilização, permitindo a conservação de suas características benéficas e facilitando o seu uso em regiões onde não se dispõe do fruto (Nunes & Salgueiro 2011).
O componente responsável pela proteção contra o choque térmico é denominado crioprotetor não-penetrante, sendo a gema de ovo a substância mais utilizada. Porém, por ser um produto cru e de origem animal, apresenta a possibilidade de contaminação biológica do diluente e, subsequente produção de endotoxinas capazes de prejudicar a capacidade de fecundação dos espermatozoides (Aires et al. 2003, Gil et al. 2003). Outras desvantagens referentes à utilização da gema de ovo, são atribuídas à opacidade óptica, causada pelos grânulos formados, que dificultam o exame imediato através da avaliação microscópica, o prejuízo causado à respiração do espermatozoide e a diminuição da motilidade (Bousseau et al. 1998, Martin 2005).
Estudos avaliando a qualidade dos espermatozoides ovinos congelados com diluentes suplementados com caseína e óleos vegetais, observaram que nenhum dos meios utilizados no presente estudo pós-descongelação obtiveram resultados superiores quando comparados ao diluente contendo gema de ovo. No entanto, concluíram que apesar de não ter sido demonstrado efeito superior desses óleos na qualidade seminal pós-descongelação, são ainda necessárias mais pesquisas sobre assunto (Del Valle et al. 2013).
O óleo de coco, obtido a partir da polpa do coco fresco maduro (Cocos nucifera L.), é composto por ácidos graxos saturados (mais de 80%) e ácidos graxos insaturados. Os ácidos graxos saturados presentes no óleo de coco são: capróico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico e esteárico, e os insaturados são: oléico e linoléico. Esses ácidos graxos são os mesmo observados no plasma seminal de pequenos ruminantes (Cardoso et al. 2011).
Em um recente estudo, avaliando a qualidade de espermatozoide caprinos criopreservados em meio à base de água de coco em pó adicionanda de óleo de coco, foi observado a ação crioprotetora do óleo de coco, entretanto, os dados obtidos foram inferiores ao preconizado pelo CBRA (Santos 2013).
Diante disso, objetivou-se avaliar o efeito do diluente à base de água de coco em pó adicionada de óleo de coco extra virgem na criopreservação de espermatozoides ovinos.
MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho está em conformidade com o projeto aprovado pela Comissão de Ética para o Uso de Animais da Universidade Estadual do Ceará (UECE) com o número de protocolo: 1845940/2016 e foi executado no Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino (LTSCO), inserido no Núcleo Integrado de Biotecnologia (NIB) da UECE, juntamente a Fazenda Ouro Branco. O
