Capacidade de desativar as ERO e ERN

Os ensaios foram realizados em um leitor de microplacas (Synergy Mx, Bio-Tek) equipado com termostato ajustado a 37°C e dois dispensadores para reagentes. Dois ensaios controle foram conduzidos em todas as microplacas, sendo um deles para verificar a interação entre a sonda e as bebidas de café, sem adição do gerador radicalar ou da espécie reativa, e no outro, um controle de qualidade analítico (controle positivo), adicionando um composto com capacidade antioxidante conhecida para desativar a espécie reativa específica. Não foi observada nenhuma interação entre a sonda e as bebidas de café, e durante os ensaios a variação nas respostas dos controles positivos foi menor que 15%. Cada ensaio correspondeu a três experimentos realizados em triplicata. Os resultados dos ensaios de desativação das ERO e ERN avaliadas, com exceção do ROO, foram expressos como valores de IC50, expressos como g do extrato seco da bebida de café por mL (g/mL) e calculados através de análise de regressão não linear utilizando o software GraphPad Prism 5.03.

2.4.1 Capacidade de desativar o radical peroxila

A capacidade de desativar o ROO foi medida pelo monitoramento do efeito das bebidas de café no decaimento da fluorescência, devido à oxidação da fluoresceína induzida pelo ROO (Ou, Hampsch-Woodill & Prior, 2001). O ROO foi gerado por decomposição térmica do AAPH. A mistura reacional continha os seguintes reagentes dissolvidos em tampão fosfato 75 mM (pH 7,4) nas concentrações finais indicadas (volume final de 200 L): fluoresceína (61 nM), 3 concentrações de bebidas de café (0,7-5,0 g/mL) ou de padrões (ácido cafeico e ácido p-cumárico foram dissolvidos em acetona:água (50:50,

v/v) e diluídos em tampão fosfato, os demais padrões foram dissolvidos em água ultrapura e

diluídos em tampão fosfato) e AAPH (19 mM). A mistura foi pré-incubada no leitor de microplacas durante 10 min antes da adição do AAPH. O sinal de fluorescência (excitação

a 485 ± 20 nm e emissão a 528 ± 20 nm) foi monitorado a cada minuto até atingir 0,5% da fluorescência inicial. A quantificação foi realizada através de uma curva analítica de trolox na faixa de 1-12 M e os resultados estão expressos em mol de equivalente ao trolox por grama de extrato seco da bebida de café (M ET/g ES). A quercetina foi usada como controle positivo (28032 ± 2025 M ET/g).

2.4.2 Capacidade de desativar o peróxido de hidrogênio

A capacidade de desativar o H2O2 foi medida pelo monitoramento da oxidação da lucigenina induzida pelo H2O2 (Rodrigues et al., 2012). A mistura reacional continha os seguintes reagentes nas concentrações finais indicadas (volume final de 300 L): tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), solução de lucigenina (0,8 mM) em tampão Tris-HCl, 5 concentrações de bebidas de café (50-4000 g/mL em tampão Tris-HCl) ou de padrões (ácido cafeico e ácido p-cumárico foram dissolvidos e diluídos em DMSO, os demais padrões foram dissolvidos em água ultrapura e diluídos em tampão Tris-HCl) e H2O2 1% (v/v). O sinal de quimiluminescência foi medido após 5 min de incubação. O ácido ascórbico foi usado como controle positivo (IC50= 155 ± 18 g/mL).

2.4.3 Capacidade de desativar o radical hidroxila

A capacidade de desativar o HO foi medida pelo monitoramento da oxidação do luminol induzida pelo HO (Rodrigues et al., 2012). O HO foi gerado pela reação de Fenton (FeCl2-EDTA-H2O2). A mistura reacional continha os seguintes reagentes nas concentrações finais indicadas (volume final de 250 L): tampão carbonato 0,5 M (pH 10), 5 concentrações de bebidas de café (0,8-16 g/mL) ou de padrões em água ultrapura, solução de luminol (20 M) em tampão carbonato, FeCl2-EDTA (25 M, 100 M) em água ultrapura e H2O2 (3,5 mM). O sinal de quimiluminescência foi medido após 5 min de incubação. O ácido gálico foi usado como controle positivo (IC50= 0,16 ± 0,01 g/mL). 2.4.4 Capacidade de desativar o ácido hipocloroso

A capacidade de desativar o HOCl foi medida pelo monitoramento da oxidação da DHR para a rodamina 123 induzida pelo HOCl (Rodrigues et al., 2012). O HOCl foi preparado através do ajuste do pH de uma solução de NaOCl 1% (m/v) até 6,2 com H2SO4

10% (v/v). A concentração do HOCl foi determinada espectrofotometricamente a 235 nm usando o coeficiente de absortividade molar de 100 M-1 cm-1 e as demais diluições foram feitas em tampão fosfato 100 mM (pH 7,4). A mistura reacional continha os seguintes reagentes nas concentrações finais indicadas (volume final de 300 L): tampão fosfato 100 mM (pH 7,4), 5 concentrações de bebidas de café (0,9-34 g/mL em tampão fosfato) ou de padrões (ácido cafeico e ácido p-cumárico foram dissolvidos e diluídos em etanol, os demais padrões foram dissolvidos em água ultrapura e diluídos em tampão fosfato), DHR (5 M) e HOCl (5 M) dissolvidos em tampão fosfato. O sinal de fluorescência (excitação a 485 ± 20 nm e emissão a 528 ± 20 nm) foi medido imediatamente após a adição do HOCl. A cisteína foi usada como controle positivo (IC50= 66,46 ± 6,37 g/mL).

2.4.5 Capacidade de desativar o óxido nítrico

A capacidade de desativar o NO foi medida pelo monitoramento da oxidação da 4,5-diaminofluoresceína (DAF-2) para a triazolofluoresceína induzida pelo NO (Gomes et al., 2007). O NO foi gerado pela termodecomposição do NOC-5. A mistura reacional continha os seguintes reagentes nas concentrações finais indicadas (volume final de 300

L): DAF-2 (5 M) em tampão fosfato 50 mM (pH 7,4), 5 concentrações de bebidas de café (0,9-27 g/mL em tampão fosfato) ou de padrões (ácido cafeico e ácido p-cumárico foram dissolvidos e diluídos em DMSO, os demais padrões foram dissolvidos em água ultrapura e diluídos em tampão fosfato) e NOC-5 (60 M) dissolvido em tampão fosfato. O sinal de fluorescência (excitação a 485 ± 20 nm e emissão a 528 ± 20 nm) foi medido após 30 min de incubação. A rutina foi usada como controle positivo (IC50= 0,78 ± 0,05 g/mL).

2.4.6 Capacidade de desativar o peroxinitrito

A capacidade de desativar o ONOO- foi medida pelo monitoramento da oxidação da DHR para a rodamina 123 induzida pelo ONOO- (Rodrigues et al., 2012). O ONOO- foi sintetizado como previamente descrito por Gomes et al. (2007). A mistura reacional continha os seguintes reagentes nas concentrações finais indicadas (volume final de 300

L): DHR (5 M) em tampão fosfato (90 mM NaCl, 50 mM Na3PO4, 5 mM KCl, pH 7,4), 5 concentrações de bebidas de café (0,2-27 g/mL em tampão fosfato) ou de padrões (ácido

foram dissolvidos em água ultrapura e diluídos em tampão) e ONOO- (600 nM). O sinal de fluorescência (excitação a 485 ± 20 nm e emissão a 528 ± 20 nm) foi medido após 5 min de incubação. Paralelamente foi realizado um ensaio na presença de NaHCO3 25 mM com a finalidade de simular a concentração de CO2 fisiológica. O trolox foi usado como controle positivo (IC50= 0,20 ± 0,005 g/mL e 0,20 ± 0,01 g/mL na ausência e presença de NaHCO3, respectivamente).