Capacidade redutora e capacidade de desativar as ERO e ERN

Os ensaios foram realizados em um leitor de microplacas (Synergy Mx, Bio-Tek, Winooski, VT, USA) equipado com termostato e dois dispensadores para reagentes. Dois ensaios controle foram conduzidos em todas as microplacas, sendo um deles para verificar a interação entre a sonda e o extrato, sem adição do gerador radicalar ou da espécie reativa, e no outro, um controle de qualidade analítico (controle positivo), adicionando um composto com capacidade antioxidante conhecida para desativar a espécie reativa específica. Não foi observada nenhuma interação entre a sonda e o extrato, e durante os ensaios a variação nas respostas dos controles positivos foi menor que 15%. Cada ensaio correspondeu a três experimentos realizados em triplicata. Com exceção da capacidade redutora e da capacidade de desativar o ROO, os resultados foram expressos como valores de IC50 calculados através de análise de regressão não linear utilizando o software GraphPad Prism 5.03.

2.6.1 Capacidade redutora dos extratos hidrofílicos

A capacidade redutora do extrato hidrofílico foi determinada através do método colorimétrico Folin-Ciocalteau (Singleton & Rossi, 1965), o qual foi adaptado para análise em leitor de microplacas (Synergy Mx, Bio-Tek). A mistura reacional continha os seguintes reagentes (volume final de 300 L): extratos hidrofílicos (nas concentrações de 33 e 73

g/mL) dissolvidos em água, reagente de Folin-Ciocalteau (8,3%, v/v) e solução de carbonato de sódio (2,3%, m/v). O sinal de absorbância foi monitorado a 765 nm por 120 min (25°C). A quantificação foi realizada através de curva analítica do ácido gálico na faixa de 2-12,5 g/mL e os resultados estão expressos em miligrama de equivalente ao ácido gálico por grama de extrato (mg EAG/g).

2.6.2 Capacidade de extratos hidrofílicos de desativarem o radical peroxila

A capacidade de desativar o ROO foi medida pelo monitoramento do efeito dos extratos hidrofílicos no decaimento da fluorescência, devido à oxidação da fluoresceína induzida pelo ROO (Ou et al., 2001). O ROO foi gerado por decomposição térmica do AAPH a 37°C. A mistura reacional continha os seguintes reagentes dissolvidos em tampão fosfato 75 mM (pH 7,4) nas concentrações finais indicadas (volume final de 200 L): fluoresceína (61 nM), extratos hidrofílicos (5 concentrações, 0,5-5,2 g/mL) e AAPH (19 mM). A mistura foi pré-incubada no leitor de microplacas durante 10 min antes da adição do AAPH. O sinal de fluorescência (excitação a 485 ± 20 nm e emissão a 528 ± 20 nm) foi monitorado a cada minuto até atingir 0,5% da fluorescência inicial. A quantificação foi realizada através de uma curva analítica de trolox na faixa de 1-12 M e os resultados foram expressos em mol de equivalente ao trolox por grama de extrato (M ET/g).

2.6.3 Capacidade de extratos lipofílicos de desativarem o radical peroxila

A capacidade de desativar o ROO foi medida pelo monitoramento do efeito dos

extratos lipofílicos no decaimento da fluorescência, devido à oxidação do C11-BODIPY581/591 induzida pelo ROO (Rodrigues et al., 2012a). O ROO foi gerado por

decomposição térmica do AIBN a 41°C. A mistura reacional continha os seguintes reagentes nas concentrações finais indicadas (volume final de 225 L): C11-BODIPY581/591 (0,18 M) em DMSO, AIBN (195 mM) e extratos lipofílicos (nas concentrações de 309 e 717 g/mL) dissolvidos em DMSO/MTBE (10:1, v/v). O sinal de fluorescência (excitação a 540 ± 20 nm e emissão a 600 ± 20 nm) foi monitorado até atingir 0,5% da fluorescência inicial. A quantificação foi realizada através de curva analítica do trolox na faixa de 14-143

2.6.4 Capacidade de extratos hidrofílico e lipofílico de desativarem o peróxido de hidrogênio

A capacidade de desativar o H2O2 foi medida pelo monitoramento do efeito dos extratos hidrofílico e lipofílico no aumento da luminescência resultante da oxidação da lucigenina induzida pelo H2O2 (Rodrigues et al., 2012b). A mistura reacional continha os seguintes reagentes nas concentrações finais indicadas (volume final de 300 L): tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), solução de lucigenina (0,8 mM) em tampão Tris-HCl, extratos hidrofílicos (5 concentrações, 350-2400 g/mL) dissolvidos em tampão Tris-HCl ou extratos lipofílicos (20 g/mL) dissolvidos em DMSO e H2O2 1% (v/v). O sinal de quimiluminescência foi medido após 5 min de incubação a 37°C.

2.6.5 Capacidade de extratos hidrofílicos de desativarem o radical hidroxila

A capacidade de desativar o HO foi medida pelo monitoramento do efeito dos extratos hidrofílicos no aumento da luminescência resultante da oxidação do luminol induzida pelo HO (Rodrigues et al., 2012b). O HO foi gerado pela reação de Fenton (FeCl2-EDTA-H2O2). A mistura reacional continha os seguintes reagentes nas concentrações finais indicadas (volume final de 250 L): tampão carbonato 0,5 M (pH 10), extratos hidrofílicos dissolvidos em água ultrapura (5 concentrações, 0,4-8,0 g/mL), solução de luminol (20 M) em tampão carbonato, FeCl2-EDTA (25 M, 100 M) em água ultrapura e H2O2 (3,5 mM). O sinal de quimiluminescência foi medido após 5 min de incubação a 37°C.

2.6.6 Capacidade de extratos hidrofílico e lipofílico de desativarem o ácido hipocloroso A capacidade de desativar o HOCl foi medida pelo monitoramento do efeito dos extratos hidrofílico e lipofílico no aumento da fluorescência resultante da oxidação da DHR para a rodamina 123 induzida pelo HOCl (Rodrigues et al., 2012b). O HOCl foi preparado através do ajuste do pH de uma solução de NaOCl 1% (m/v) até 6,2 com H2SO4 10% (v/v). A concentração do HOCl foi determinada espectrofotometricamente a 235 nm usando o coeficiente de absortividade molar de 100 M-1 cm-1 e as demais diluições foram feitas em tampão fosfato 100 mM (pH 7,4). A mistura reacional continha os seguintes reagentes nas concentrações finais indicadas (volume final de 300 L): tampão fosfato 100 mM (pH 7,4),

extratos hidrofílicos (5 concentrações, 0,7-71 g/mL) dissolvidos em tampão fosfato ou extratos lipofílicos (20 g/mL) dissolvidos em etanol, DHR (5 M) e HOCl (5 M) dissolvidos em tampão fosfato. O sinal de fluorescência (excitação a 485 ± 20 nm e emissão a 528 ± 20 nm) foi medido imediatamente após a adição do HOCl a 37°C.

2.6.7 Capacidade de extratos hidrofílico e lipofílico de desativarem o óxido nítrico

A capacidade de desativar o NO foi medida pelo monitoramento do efeito dos extratos hidrofílico e lipofílico no aumento da fluorescência resultante da oxidação da 4,5-diaminofluoresceína (DAF-2) para a triazolofluoresceína induzida pelo NO (Gomes et al., 2007). O NO foi gerado pela termodecomposição do NOC-5. A mistura reacional continha os seguintes reagentes nas concentrações finais indicadas (volume final de 300

L): DAF-2 (5 M) em tampão fosfato 50 mM (pH 7,4), extratos hidrofílicos (5 concentrações, 0,7-85 g/mL) dissolvidos em tampão fosfato ou extratos lipofílicos

(20 g/mL) dissolvidos em DMSO e NOC-5 (60 M) dissolvido em tampão fosfato. O sinal de fluorescência (excitação a 485 ± 20 nm e emissão a 528 ± 20 nm) foi medido após 30 min de incubação a 37°C.

2.6.8 Capacidade de extratos hidrofílico e lipofílico de desativarem o ânion peroxinitrito A capacidade de desativar o ONOO- foi medida pelo monitoramento do efeito dos extratos hidrofílico e lipofílico no aumento da fluorescência resultante da oxidação da DHR para a rodamina 123 induzida pelo ONOO- (Rodrigues et al., 2012b). O ONOO- foi sintetizado como previamente descrito por Gomes et al. (2007). A mistura reacional continha os seguintes reagentes nas concentrações finais indicadas (volume final de 300

L): DHR (5 M) em tampão fosfato (90 mM NaCl, 50 mM Na3PO4, 5 mM KCl, pH 7,4), extratos hidrofílicos (5 concentrações, 0,3-35 g/mL) dissolvidos em tampão fosfato ou extratos lipofílicos (22 g/mL) dissolvidos em DMSO e ONOO- (600 nM). O sinal de fluorescência (excitação a 485 ± 20 nm e emissão a 528 ± 20 nm) foi medido após 5 min de incubação a 37°C. Paralelamente foi realizado um ensaio na presença de NaHCO3 25 mM com a finalidade de simular a concentração de CO2 fisiológica.