Capacidade Invasiva das Linhagens com Expressão Modulada de RECKA e

Para avaliar os efeitos de RECKA e de RECKB no processo invasivo de células de melanoma, as linhagens derivadas de 1205Lu que expressam RNAi contra

estes transcritos foram submetidas ao ensaio de invasão através de matrigel®. Os resultados são mostrados na FIGURA 30.

FIGURA 30 – ANÁLISE DA INVASÃO EM MATRIGEL® POR CÉLULAS COM SILENCIAMENTO DE RECKA OU RECKB

FONTE: O Autor

NOTA: Resultados do ensaio de invasão por Matrigel ®. A, micrografias representativas da superfície inferior do inserto do Transwell ®, após remoção das células da superfície superior e coloração com cristal violeta em três experimentos independentes realizados em duplicata. As barras de escala representam 200 μm. B, Quantificação de células invasivas, através da leitura da absorbância do cristal violeta, eluído dos insertos com metanol, em 540 nm. Os valores são representados em relação à linhagem controle (shScramble). As barras representam as médias e os desvios padrão de três experimentos independentes, feitos em duplicata. As diferenças foram testadas utilizando ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Não foram encontradas diferenças significativas entre as linhagens.

Como se pode observar, não houve diferenças significativas entre as capacidades invasivas da linhagem transduzida com o shRNA de sequência controle e as transduzidas com shRECKA ou shRECKB. Da mesma forma, não foram observadas diferenças entre a linhagem derivada de 1205Lu que superexpressa RECKB^orf e a linhagem controle respectiva, como mostrado na FIGURA 31. Além disto, os ensaios realizados com as derivadas de WM35 que superexpressam RECKB não foram capazes de invadir o matrigel® dentro das 48h de incubação (dados não mostrados).

FIGURA 31 – ANÁLISE DA INVASÃO EM MATRIGEL® POR CÉLULAS QUE SUPEREXPRESSAM RECKB^orf

FONTE: O Autor

NOTA: Resultados do ensaio de invasão por Matrigel ®. A, micrografias representativas da superfície inferior do inserto do Transwell ®, após remoção das células da superfície superior e coloração com cristal violeta em três experimentos independentes realizados em duplicata. As barras de escala representam 200 μm. B, Quantificação de células invasivas, através da leitura da absorbância do cristal violeta, eluído dos insertos com metanol, em 540 nm. Os valores são representados em relação à linhagem controle (shScramble). As barras representam as médias e os desvios padrão de três experimentos independentes, feitos em duplicata. As diferenças foram testadas utilizando ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Não foram encontradas diferenças significativas entre as linhagens.

Pode-se concluir, portanto, que a capacidade invasiva da linhagem 1205Lu não é afetada de forma detectável pela modulação dos níveis de RECKA ou RECKB.

Além disto a expressão de RECKB^orf em células da linhagem WM35 não as tornou capazes de invadir o matrigel®.

6.2.7 Efeito dos Transcritos do Gene RECK na Capacidade de Proliferação Livre de Adesão

Células não-tumorais, em geral, necessitam aderir a um substrato para a proliferação. A ausência da ancoragem à proteínas de matriz extracelular normalmente acarreta no fenômeno conhecido por anoikis, ou morte celular devido à falta de adesão. Células tumorais frequentemente são resistentes ao anoikis, e a capacidade de proliferar em substrato semissólido é uma forma de mensurar a agressividade de um tumor (FREEDMAN e SHIN, 1974). Sendo assim, as linhagens derivadas de 1205Lu nas quais a expressão de RECKA ou de RECKB foi silenciada, ou nas quais RECKB^orf foi superexpressa, foram plaqueadas em suspensão de agarose e o número de colônias formadas após 21 dias foi contado. Os resultados são apresentados na FIGURA 32, e mostram que as células com expressão modulada

de RECKA ou RECKB não proliferam de forma significativamente diferente das linhagens controle.

FIGURA 32 – CAPACIDADE DE FORMAÇÃO DE COLÔNIAS EM AGAROSE POR LINHAGENS DERIVADAS DE 1205Lu

FONTE: O Autor

NOTA: Resultados da quantificação das colônias formadas em agarose pelas linhagens com expressão modulada dos transcritos do gene RECK. A e C, imagens representativas da densidade de colônias nos campos fotografados correspondentes às linhagens derivadas de 1205Lu com expressão de RECKA ou RECKB silenciados (A) ou com superexpressão de RECKB^orf (C). As barras de escala representam 100 μm.

B e D, quantificação de colônias nas linhagens com expressão de RECKA ou RECKB silenciadas (B) ou com RECKB^orf superexpresso (D). As barras indicam a média e o desvio padrão de três experimentos independentes, feitos em duplicatas. Não foram encontradas diferenças significativas entre as médias em B ou em C, de acordo com ANOVA seguida por teste de Tukey.

Também foi testada a alteração da capacidade de formar colônias em agarose promovida pela superexpressão de RECKB^orf na linhagem WM35, como mostra a FIGURA 33. O que se observa é que, também nesta linhagem, RECKB^orf não altera a capacidade das células de proliferar sem adesão.

Como conclusão, a alteração da expressão de RECKA ou de RECKB não apresentam efeito sobre a capacidade das células das linhagens 1205Lu e WM35 de proliferar e formar colônias em substrato semissólido, uma vez que as suas derivadas com expressão modulada dos transcritos de RECK formaram tantas colônias quanto as linhagens controle.

FIGURA 33 – CAPACIDADE DE FORMAÇÃO DE COLÔNIAS EM AGAROSE POR LINHAGENS DERIVADAS DE WM35

FONTE: O Autor

NOTA: Resultados da quantificação das colônias formadas em agarose pelas linhagens com superexpressão de RECKB^orf. A, imagens representativas da densidade de colônias nos campos fotografados correspondentes à linhagem derivada de WM35 com que superexpressa RECKB^orf. As barras de escala representam 100 μm. B, quantificação de colônias da linhagem que superexpressa RECKB^orf. As barras indicam a média e o desvio padrão de dois experimentos independentes, feitos em duplicatas.

Não foram encontradas diferenças significativas entre as médias, de acordo com ANOVA seguido por teste de Tukey.