O capping de pré-mRNAs desempenha diversas funções celulares. No núcleo essa estrutura interage com o complexo CBP (cap-binding complex) e, através dessa interação, estimula processos subsequentes de maturação do pré-mRNA, como splicing e formação da estrutrura 3' (cauda poly-A). No citoplasma o cap é responsável pelo recrutamento de ribossomos, através de sua interação com o fator eIF4F. Além disso, também protege os mRNAs da degradação pela ação de 5'-3' exonucleases (Cougot et al., 2004).
O capping de pré-mRNAs celulares é específico para transcritos sintetizados pela RNA polimerase II. Essa especificidade é alcançada pela interação física de um ou mais componentes do aparato de capping ao CTD (C-terminal domain) fosforilado da subunidade maior da RNA polimerase II (Chiu et al., 2001). O CTD é um domínio único, encontrado apenas na RNA polimerase II e consiste de repetições do heptapeptídeo consenso Y1-S2-P3-T4-S5-P6-S7. O número de repetições depende da espécie, sendo 26 em leveduras e 52 em humanos. O CTD forma uma extensão em forma de cauda a partir do núcleo catalítico da polimerase, próximo ao poro de saída do RNA recém-sintetizado. A ligação de fatores de processamento específicos ao CTD depende do padrão de fosforilação do domínio, que se altera durante o ciclo de transcrição, coordenando eventos na biogênese de mRNAs. Embora haja cinco sítios de fosforilação potenciais, os sítios S2 e S5 são os alvos principais. A fosforilação de S5, catalisada pela quinase TFIIH e pelo complexo Mediator, é mais comum em regiões próximas a promotores, durante a iniciação da transcrição, e recruta enzimas de capping, enquanto que a fosforilação em resíduos S2, catalizada pela quinase P-TEFb, é mais frequente em regiões distais, durante a elongação da transcrição, levando ao recrutamento de enzimas da maquinaria de processamento 3' (Meinhart et al., 2005; Hirose e Ohkuma, 2007).
O processo de capping de mRNAs eucarióticos ocorre numa sequência de três reações enzimáticas, iniciadas pela clivagem da extremidade 5’-trifosfato do pré-mRNA pela ação de uma RNA trifosfatase. Durante o segundo passo, a RNA guanililtransferase inicialmente forma um complexo covalente enzima-GMP e em seguida transfere o GMP à extremidade difosfato do pré-mRNA, através de uma ligação 5'-5' trifosfato não-usual. O cap é então metilado na posição N7 da guanina por uma RNA (guanina-7) metiltransferase, dando origem à estrutura m7GpppN, conhecida também como cap0 (Figura 5). A enzima de capping de mamíferos, Mce1, é um
polipeptídio bifuncional com atividades de RNA trifosfatase (em seu N-terminal) e guanililtransferase (em seu C-terminal), e se liga apenas ao CTD fosforilado (Chiu et al., 2001). Em levedura três enzimas estão envolvidas na formação de cap, a guanililtransferase Ceg1p, a trifosfatase Cet1p e a metiltransferase Abd1p. Apenas Ceg1p e Abd1p interagem diretamente com o CTD fosforilado, sendo Cet1p recrutada por sua interação com Ceg1 (Cho et al., 1998).
Figura 5: Esquema da estrutura do cap de mRNA. Em preto estão os dois últimos ribonucleotídeos do mRNA. Em azul o cap de GMP, ligado ao mRNA através de uma ligação trifosfato 5'-5' não usual (em rosa). O cap de GMP é metilado na posição N7 da guanina. (Lodish et al., 1999).
As RNA guanililtransferases celulares e virais fazem parte de uma mesma superfamília da qual também fazem parte DNA ligases NAD+-dependentes e RNA ligases ATP-dependentes e a análise da estrutura de cinco dos seus membros permitiu a identificação de uma organização comum (Sawaya e Shuman, 2003), que consiste de um domínio N-terminal de nucleotidil transferase e um domínio C-terminal composto de um tipo estrutural especial chamado OB (um barril de cinco fitas beta anti-paralelas). O domínio N-terminal possui cinco sub-domínios (I, III, IIIa, IV e V), conservados em sua ordem, e que definem a superfamília de polinucleotídio ligase/enzimas de capping de mRNA, presente também em KIAA0082/ISG95. O domínio OB
das enzimas de capping de RNA e das RNA e DNA ligases possui também um sub-domínio, chamado VI. O sub-domínio I (KxDG) contém o nucleófilo lisina ao qual o GMP e o AMP se tornam covalentemente ligados no primeiro passo das reações de capping e ligação, respectivamente.
Durante a infecção viral, o RNA viral deve ser endereçado à maquinaria de tradução da célula hospedeira. Para isso, os vírus desenvolveram enzimas de capping ou proteínas que de alguma forma estimulam a formação do capping, catalisada pelas enzimas celulares no RNA viral. Tat é uma pequena proteína codificada pelo genoma do HIV que se liga especificamente a um elemento de RNA estruturado, o TAR, localizado na extremidade 5’ nascente dos transcritos virais (Chiu et al., 2001). Através de uma interação física direta, ela estimula atividades de guanililtransferase e trifosfatase de MceI, aumentando dessa forma a eficiência de formação de cap em RNAs definidos, nesse caso os resultantes da transcrição do genoma de HIV-I.
Há diversos estudos sobre as proteínas de capping codificadas por vírus. No caso do vírus vaccinia (Yu et al., 1997), os três passos da formação de capping nos mRNAs virais são catalisados por um heterodímero codificado pelo genoma viral, composto de subunidades de 95 kDa (codificada pelo gene D1) e 33 kDa (codificada por D12). A região aminoterminal da subunidade D1 catalisa as reações de trifosfatase e guanililtransferase. A reação de metiltransferase é catalisada por um domínio que consiste da porção C-terminal de D1 juntamente com D12.
Em reovírus, todas as enzimas necessárias para a formação de cap são codificadas pelo genoma viral já que se demonstrou que o core é capaz de gerar RNAs com cap in vitro. O cap gerado é do tipo 1 e para sua síntese são necessárias duas atividades de metiltransferase, a de (guanosina-7N)-metiltransferase e a de (guanosina-2’-O)-metiltransferase, que ao final do processo dão origem à estrutura m7GpppGm2′OpC(pN)n-OH. Com base em análise de sequência primária, estudos de UV-crosslinking, de mutagênense sítio-dirigida e da resolução da estrutura tridimensional do core de reovirus, identificou-se dois domínios com similaridade a metiltransferases, embora a proteína purificada não demonstre a atividade de metiltransferase prevista, o que se atribui a uma falha na determinação de sua estrutura quaternária (Bujnicki e Rychlewski, 2001).
O vírus da hepatite E (HEV) possui como material genético RNA de polaridade positiva, com um cap m7GTP em sua extremidade 5'. A análise da seqüência da ORF1 do vírus revelou em sua região N-terminal a presença de um domínio com similaridade a metiltransferases, dentre outros. O fragmento codificado pelo N-terminal da ORF1, chamado P110, expresso em células de inseto, catalisa uma reação de adição de cap distinta das normalmente realizadas nas células eucarióticas (Magden et al., 2001). A P110 de HEV, assim como a nsP1 de TMV (tobacco mosaic virus), a P126 de BMV (brome mosaic virus) e a proteína 1a de BaMV (bamboo mosaic virus), todos alphavírus, ao invés de metilar o mRNA já contendo o cap, metila o GTP, gerando m7GTP, que então reage com a enzima para gerar o intermediário covalentemente ligado m7GTP- enzima. Assim, a enzima viral é específica para pequenos substratos aceptores, ao contrário da enzima celular, que metila apenas oligonucleotídios longos contendo o cap GpppN.
O vírus influenza utiliza uma via única para a formação de mRNAs virais com cap (Lamb e Krug, 2001). A RNA polimerase viral, constituída de três subunidades (PA, PB1 e PB2) se liga ao cap dos mRNAs celulares através da subunidade PB2. Em seguida, através de sua atividade endonuclease associada à subunidade PB1, cliva o mRNA celular liberando oligonucleotídeos (9- 15 nts) contendo cap. Esses oligonucleotídios com cap são então utilizados como primers para a iniciação da transcrição viral. As moléculas de mRNA viral carregam então o cap e uma curta seqüência derivada do hospedeiro em sua extremidade 5’, o que garante eficiente exportação nuclear, iniciação da tradução e síntese da proteína viral no citoplasma. Assim, a atividade endonuclease cap dependente é essencial para a replicação do vírus, e a ligação de PB2 ao cap de mRNAs celulares constitui o primeiro passo na síntese de mRNAs virais. Em 2003 Hooker e colaboradores compararam as propriedades de ligação ao cap da proteína PB2, codificada pelo vírus influenza, e de eIF4E, um fator de tradução humano no intuito de desenvolver um inibidor específico de PB2. Eles observaram que a contribuição dos grupos fosfato na afinidade de ligação difere entre essas duas proteínas. A remoção de grupos fosfato, originando m7GDP e m7GMP, causou uma perda de afinidade de ligação maior para eIF4E que para PB2. A perda da carga negativa na guanina, que ocorre em GTP em comparação a m7GTP, teve um efeito menor na afinidade de ligação de PB2 em comparação a eIF4E. Adicionalmente a substituição da ribose por um açúcar acíclico na estrutura da guanina aumentou a afinidade por PB2. Assim, a ausência de carga negativa gerou uma maior seletividade por PB2 e a substituição da ribose por um açúcar
acíclico aumentou a potência e a seletividade da interação com PB2. Com base nesses dados foi possível desenvolver um composto, chamado RO0794238, que inibe especificamente a ligação de PB2 ao cap (Hooker et al., 2003).
Todos esses estudos sobre proteínas de capping virais demonstram que esse é um processo celular extremamente importante e que os vírus desenvolveram diversos mecanismos para promover a formação do cap em seus mRNAs. O fato de KIAA0082/ISG95 ser superexpressa em resposta à infecção e ao tratamento com IFNs e de possuir domínios de ligação à RNA, de metiltransferase e de proteínas da família capping/DNA ligase, gerou a hipótese de que, dentro da da função geral proposta para KIAA0082/ISG95, relacionada ao processamento de pré-mRNAs, sua atividade poderia estar associada especificamente ao capping de pré-mRNAs. Assim, essa foi uma das hipóteses desenvolvidas para determinação da função biológica de KIAA0082/ISG95.