Teste da Atividade do Promotor do gene ISG95

Para confirmar a hipótese de que ISG95 teria sua expressão induzida por IFN-α foram construídos quatro plasmídeos recombinantes, com diferentes extensões do promotor de ISG95 controlando a expressão do gene repórter SEAP (secreted alkaline phosphatase).

Através do alinhamento de ISG95 e seus ortólogos executado pelo programa mVISTA foi possível determinar as regiões mais conservadas no promotor de ISG95. No alinhamento com o ortólogo de chimpanzé foram identificadas duas regiões, chamadas CNS1 e CNS2. Dentro da região CNS2, uma pequena sequência de 185 pb upstream ao primeiro exon de ISG95 demonstrou ser conservada também em camundongos e ratos, além de chimpanzés (Fig 14A). Essa região foi chamada de região mínima e foi a menor sequência utilizada para o ensaio de atividade. Além dela foram utilizados fragmentos de 500 pb, 1100 pb e 1551 pb upstream ao sítio de início da transcrição, clonados de forma a controlar a expressão do repórter SEAP para os ensaios de atividade promotora. O fragmento maior, de 1551 pb engloba também a região conservada CNS2. Como controle positivo utilizou-se a sequência ISRE (interferon-stimulated response element) do promotor de ISG15, cuja ativação em resposta a IFN ja foi demonstrada (Reich et al., 1987) e como controle negativo utilizou-se a sequência MARE, sítio de ligação para fatores de transcrição da família MafB, não relacionada à resposta a IFN (Petersen et al., 2004). A figura 14B apresenta uma representação esquemática dos clones utilizados no ensaio de atividade promotora. No ensaio de atividade (Figura 14C), obtém-se uma medida indireta da quantidade de proteína repórter sintetizada na amostra em análise através da intensidade de fluorescência do produto gerado. O ensaio foi realizado em triplicatas em células Vero.

Figura 14: A) Gráfico mostrando a análise da região promotora do gene ISG95 e seus ortólogos em chimpanzé (Ch), camundongo (Ca), rato (Ra), D. melanogaster (DM) e C. elegans (CE). As regiões conservadas CNS1, CNS2 e mínima estão destacadas por barras.

B) Construções utilizadas para o ensaio de atividade do promotor de ISG95. pMARE-SEAP

foi usado como controle negativo, já que possui a sequência reconhecida pelo fator de transcrição MafB, não relacionada a resposta a IFN controlando a expressão do repórter SEAP. p185-SEAP, p500-SEAP, p1100-SEAP e p1551-SEAP referem-se às contruções em teste, com diferentes extensões do promotor de ISG95 controlando a expressão do repórter. pISG15-SEAP foi utilizado como controle positivo e possui a sequência ISRE do promotor de ISG15 controlando a expressão do repórter SEAP. C) Ensaio de ativação do promotor de ISG95 em resposta a IFN-α. Houve ativação da expressão do gene repórter SEAP após o tratamento com todas as extensões do promotor de ISG95, indicando que na região mínima escolhida, de 185 pares de bases, se encontra o elemento de resposta a IFN-α. O controle positivo escolhido, a região ISRE da ISG15, obteve o mesmo nível de resposta ao tratamento. O controle negativo não apresenta indução da expressão do gene repórter após o tratamento, apresentando nível de expressão do repórter semelhante aos das amostras não induzidas.

Os resultados obtidos no ensaio comprovam a ativação do promotor de ISG95 em resposta ao tratamento com IFN-α (Figura 14C). Todas as extensões do promotor utilizadas obtiveram níveis semelhantes de expressão do gene repórter após o tratamento, o que é demonstrado pelos níveis de fluorescência obtidos, e indica que o elemento de resposta a IFN-α está localizado dentro da região mínima escolhida, de 185 pares de bases. Nível de fluorescência semelhante foi obtido, após o tratamento, no clone contendo a ISRE de ISG15, o que reforça e valida os resultados obtidos com as construções do promotor de ISG95. As amostras não tratadas se mantêm com níveis de fluorescência basais, demonstrando que a expressão do gene repórter foi especificamente obtida após o tratamento com IFN-α. Além disso, a fluorescência observada após o tratamento na construção contendo a sequência MARE também se manteve em níveis basais, o que confirma a especificidade da resposta ao tratamento com IFN-α pelos demais clones.

A região mínima do promotor de ISG95 que já é capaz de responder à estimulação por IFN-α foi submetida à análise pelo programa TFSearch (http://www.cbrc.jp/research/db/TF SEARCH.htmL) para identificação de possíveis sítios de reconhecimento para fatores de transcrição. O programa identificou diversos possíveis sítios, dentre eles os reconhecidos pelos fatores CREB, CBP/p300, GATA-1, c-Rel e AML-1a (Quadro 3). Dentre esses fatores estão alguns com alvos bastante amplos, como Sp1, e outros, como o fator AML-1a, cuja função é relacionada à hematopoiese, e que em muitos casos o gene que o codifica encontra-se alterado

em indivíduos leucêmicos. Já o fator cREL possui função relacionada à resposta imunológica e a processos inflamatórios. Uma primeira análise das funções desses fatores aponta para vias comuns àquelas identificadas para indução da expressão de ISG95, como a hematopoiese e leucemias (relacionando-se com a expressão de ISG95 no cluster gênico em indivíduos com LLA) e a resposta imunológica (relacionando-se com a expressão de ISG95 em resposta a interferon e infecção viral).

Quadro 3: Sítios reconhecidos por diferentes fatores de transcrição identificados na região mínima do promotor de ISG95 (185 pb) e suas respectivas pontuações relativas, sem valor estatístico.

4.2. Análise da localização sub-celular de ISG95

Para a determinação da localização sub-celular de ISG95 esta foi fusionada à GFP (green fluorescent protein) e transfectada em células HeLa. A expressão da proteína de fusão e do controle negativo expressando apenas GFP foi analisada 24 horas após a transfecção em microscópio óptico de fluorescência (Figura 15A). Os resultados demonstram localização nuclear para a proteína de fusão GFP-ISG95, possivelmente com exclusão do nucléolo, o que se deduz das regiões escuras dentro do núcleo, que coincidem com os nucléolos observados em contraste de fase. A localização nuclear de ISG95 condiz com o sinal de localização nuclear identificado na análise de sua sequência primária (aminoácidos de 3 a 18). Para confirmar os resultados obtidos por fluorescência, realizou-se um immunoblot com anticorpo para KIAA0082

após o fracionamento celular de HeLa. Os extratos nuclear e citoplasmático foram analisados quanto à presença de ISG95 e de dois controles, a RNA polimerase II (de localização nuclear) e a actina (presente em frações nucleares e citoplasmáticas) (Vartiainen, 2008). Como se observa na figura 15B o immunoblot confirma a localização nuclear de ISG95 (assim como a localização esperada dos controles).

Figura 15: Ensaio de localização sub-celular. A) A fusão GFP-ISG95 demonstra localização nuclear, aparentemente sendo exluída do nucléolo. O controle negativo expressando apenas GFP apresenta a localização difusa, conforme esperado. B) Immunoblot com anticorpo para ISG95 e para os controles RNA polimerase II e actina nos extratos nuclear (NE) e citoplasmático (S100) de HeLa confirmando a localização nuclear de ISG95. C) Membrana submetida ao immunoblot corada com azul de coomassie para visualização do conteúdo protéico de cada um dos extratos nuclear (NE) e citoplasmático (S100).

4.3. Expressão e purificação de ISG95 e de seus domínios em Escherichia coli