A. acidoterrestris são bastonetes aeróbios gram-positivos, formadores de endosporos terminais ou subterminais, cujo tamanho varia de 2,9 a 4,3 µm de
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.5. Características morfológicas e do envelope celular de A acidoterrestris tratado com bovicina HC5 e nisina
A observação de células vegetativas de A. acidoterrestris DSMZ 2498 tratado com bovicina HC5 ou nisina por microscopia de força atômica revelou severas mudança estruturais comparadas com as células que não foram expostas a ação da bacteriocina. A adição de 10 UA/mL de bovicina HC5 causou danos na superfície celular (Figura 15). Com a adição dessa bacteriocina, também foi possível observar mudanças na morfologia celular (Figura 16), a redução no número de células vegetativas viáveis e esporulação da cultura foi observado nos tempos de 0, 2, 4, 8 e 24 horas (Figura 17), foram feitos controles sem adição de bacteriocina com 24 horas de incubação.
A observação das células tratadas com nisina foi apenas nos tempos de 2 e 8 horas de incubação. Nesta situação também foi possível observar danos no envelope celular (Figura 18) e na morfologia das células vegetativas viáveis de A. acidoterrestris (Figura 19). Os resultados foram semelhantes quando adicionado bovicina HC5, porém a nisina demonstrou agir rapidamente sobre a células, apenas com 2 horas foi possível observar uma diminuição considerável no número de células, com 8 horas de incubação foram observadas poucas células vegetativas viáveis, porém não foi observado a esporulação da cultura (Figura 20). Os resultados obtidos com a nisina sugerem a necessidade de se fazer observações em tempos menores de incubação.
A ação de bovicina HC5 e nisina sobre o envelope celular de A. acidoterrestris foi similar. Esses resultados sugerem que essas bacteriocinas podem se ligar a receptores semelhantes na célula alvo. O modo de ação da nisina em bactérias sensíveis é duplo, pois, o peptídeo se liga ao lipídeo II, que transporta as subunidades de N-acetilglicosamina e ácido N-acetilmurâmico do citoplasma para a parede celular, interrompendo a síntese de peptideoglicano (WIEDEMANN, 2001). Além disso, a nisina pode usar o lipídeo II como molécula “âncora” para iniciar o processo de inserção na membrana e conseqüente formação do poro, que ocasiona uma rápida morte celular devido à perda dos gradientes iônicos vitais e a concomitante dissipação da força próton motora na bactéria (MONTVILLE e CHEN, 1998; WIEDEMANN, 2001; COTTER, 2005).
A observação topográfica da superfície celular de A.acidoterrestris tratada com bovicina HC5 (Figura 15) ou nisina (Figura 18) indica possíveis pontos de extrusão do citoplasma possivelmente causados pela ação das bacteriocinas sobre o envelope celular. Esse efeito pode ser devido à ação direta ou indireta das bacteriocinas sobre a síntese de peptideoglicano. Entretanto, estudos posteriores serão necessários para determinar se a bovicina HC5 também interage com o lipídeo II das bactérias sensíveis. Estudos têm demonstrado que outras bacteriocinas de bactérias lácticas, a exemplo da enterocina AS-48, também podem causar mudanças estruturais nas células de A. acidoterrestris (GRANDE et. al., 2005).
Figura 15. Imagens tridimencionais topográficas com o modo intermitente de microscopia
de força atômica (NT-MDT), de células vegetativas de A. acidoterrestris DMSZ 2498 tratadas com bovicina HC5. A suspensão de células (108 UFC/mL) foi
incubada por 24 horas em tampão fosfato com pH 4,0 a 43 ºC e 120 rpm. Foram feitas observações da cultura controle sem adição de bovicina HC5, com 24 horas de incubação (a) e após 2 horas (b), 4 horas (c), 8 horas (d) e 24 horas (e) de incubação com 10 UA/mL de bovicina HC5. A superfície celular de células representativas foi analisada com varredura de 1 µm.
Figura 16. Imagens tridimencionais topográficas com o modo intermitente de microscopia
de força atômica (NT-MDT), de células vegetativas de A. acidoterrestris DMSZ 2498 tratadas com bovicina HC5. A suspensão de células (108 UFC/mL) foi
incubada por 24 horas em tampão fosfato com pH 4,0 a 43 ºC e 120 rpm. Foram feitas observações da cultura com 24 horas de incubação sem adição de bovicina HC5, após com 2 horas (b), 4 horas (c), 8 horas (d) e 24 horas (e) de incubação com 10 UA/mL de bovicina HC5. A morfologia celular de células representativas foi analisada com varredura de 3 µm.
Figura 17. Imagens tridimencionais topográficas com o modo intermitente de microscopia
de força atômica (NT-MDT), de células vegetativas de A. acidoterrestris DMSZ 2498 tratadas com bovicina HC5. A suspensão de células (108 UFC/mL) foi
incubada por 24 horas em tampão fosfato com pH 4,0 a 43 ºC e 120 rpm. Foram feitas observações da cultura com 24 horas de incubação sem adição de bovicina HC5, após com 2 horas (b), 4 horas (c), 8 horas (d) e 24 horas (e) de incubação com 10 UA/mL de bovicina HC5. A redução do número de células vegetativas e esporulação foi analizada com varredura de 40 µm.
Figura 18. Imagens tridimencionais topográficas com o modo intermitente de microscopia
de força atômica (NT-MDT), de células vegetativas de A. acidoterrestris DMSZ 2498 tratadas com nisina. A suspensão de células (108 UFC/mL) foi incubada
por 24 horas em tampão fosfato com pH 4,0 a 43 ºC e 120 rpm. Foram feitas observações da cultura controle sem adição de nisina, com 24 horas de incubação (a), 2 horas (b) e 8 horas (c), de incubação com 10 UA/mL de bovicina HC5. A superfície celular de células representativas foi analisada com varredura de 1 µm.
Figura 19. Imagens tridimencionais topográficas com o modo intermitente de microscopia
de força atômica (NT-MDT), de células vegetativas de A. acidoterrestris DMSZ 2498 tratadas com nisina. A suspensão de células (108 UFC/mL) foi incubada
por 24 horas em tampão fosfato com pH 4,0 a 43 ºC e 120 rpm. Foram feitas observações da cultura controle sem adição de nisina, com 24 horas de incubação (a), 2 horas (b) e 8 horas (c), de incubação com 10 UA/mL de bovicina HC5. A superfície celular de células representativas foi analisada com varredura de 3 µm.
Figura 20. Imagens tridimencionais topográficas com o modo intermitente de microscopia
de força atômica (NT-MDT), de células vegetativas de A. acidoterrestris DMSZ 2498 tratadas com nisina. A suspensão de células (108 UFC/mL) foi incubada
por 24 horas em tampão fosfato com pH 4,0 a 43 ºC e 120 rpm. Foram feitas observações da cultura controle sem adição de nisina, com 24 horas de incubação (a), 2 horas (b) e 8 horas (c) de incubação com 10 UA/mL de nisina. A redução no número de células vegetativas foi analizada com varredura de 40 µm.
5. CONCLUSÕES
Bovicina HC5 e nisina inibiram o crescimento e reduziram a viabilidade celular de A. acidoterrestris em diferentes sucos de frutas.
Bovicina HC5 e nisina reduziram a resistência térmica de esporos de A. acidoterrestris inoculados em diferentes sucos de frutas.
Bovicina e nisina afetaram a morfologia e o invelope celular de A. acidoterrestris.
Bovicina HC5 e nisina apresentaram doses bactericidas mínimas contra A. acidoterrestris.
A bovicina HC5 foi tão efetiva quanto a nisina contra A. acidoterrestris inoculado em diferentes sucos de frutas.
As bacteriocinas permaneceram estáveis nas condições de incubação e tratamento térmico avaliados neste trabalho.