ARYÁDINA MARA RIBEIRO DE SOUZA
ATIVIDADE DAS BACTERIOCINAS BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE O CRESCIMENTO E A RESISTÊNCIA TÉRMICA DE Alicyclobacillus
acidoterrestris EM SUCOS DE FRUTAS
VIÇOSA
MINAS GERAIS - BRASIL 2008
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola, para obtenção do título de Magister Scientiae.
Livros Grátis
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Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e Classificação da Biblioteca Central da UFV
T
Souza, Aryádina Mara Ribeiro de, 1972-
S729a Atividade das bacteriocinas bovicina HC5 e nisina sobre 2008 o crescimento e a resistência térmica de
Alicyclobacillus acidoterrestris em sucos de frutas / Aryádina Mara Ribeiro de Souza – Viçosa, MG, 2008. xiv, 64f.: il. (algumas col.) ; 29cm.
Orientador: Hilário Cuquetto Mantovani.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Viçosa. Referências bibliográficas: f. 53-64.
1. Alicyclobacillus acidoterrestris - Efeito de bovicina HC5. 2. Alicyclobacillus acidoterrestris - Efeito de nisina.
3. Suco de frutas - Deterioração. 4. Bacteriocinas. 5. Bactérias. 6. Microbiologia agrícola. I. Universidade Federal de Viçosa. II.Título.
ARYÁDINA MARA RIBEIRO DE SOUZA
ATIVIDADE DAS BACTERIOCINAS BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE O CRESCIMENTO E A RESISTÊNCIA TÉRMICA DE Alicyclobacillus
acidoterrestris EM SUCOS DE FRUTAS
APROVADA: 19 de Junho de 2008
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola, para obtenção do título de Magister Scientiae.
______________________________ Profª. Flávia Maria Lopes Passos ______________________________
Profª. Maria Cristina Dantas Vanetti (co-orientadora)
______________________________ Profº. Sukarno Olavo Ferreira ______________________________
Profª. Denise Mara Soares Bazzolli
______________________________ Profº. Hilário Cuquetto Mantovani
A Deus
Ao meu marido, Jorge
Aos meus pais, Agenor e Olinda Dedico esta vitória.
AGRADECIMENTOS
A Deus por estar presente em todos os momentos de minha vida e por mais uma vitória alcançada.
Ao meu marido, Jorge, pelo amor, carinho, compreensão e incentivo em todos os momentos.
Aos meus pais, Agenor e Olinda, pelo apoio, compreensão e orações.
Aos meus irmãos, Soraia, Patrícia, Bethânia, Agenor, Kelem e sobrinhos, Vinícius, Thaís, Priscila, Frederico, Déborah e Gustavo, pelo incentivo e carinho.
À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Microbiologia pela oportunidade de realizar o mestrado e pela excelente formação.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa.
Ao professor Hilário Cuquetto Mantovani pela orientação, confiança depositada em mim, disponibilidade e por toda dedicação, sempre zelando pelo melhor desenvolvimento dos trabalhos e contribuindo para o crescimento profissional de seus orientados.
À professora Maria Cristina Dantas Vanetti pelo exemplo profissional, conselhos, carinho e pela grande contribuição durante o mestrado.
À professora Célia Alencar de Moraes pela co-orientação e sugestões.
Ao professor Sukarno Olavo Ferreira por contribuir de forma tão significativa na execução dos trabalhos de microscopia, pela paciência e disponibilidade. Por participar da banca de defesa e sugestões.
Às professoras Denise Mara Soares Bazzolli e Flávia Maria Lopes Passos pela participação na banca de defesa e pelas sugestões.
A todos os professores do Departamento de Microbiologia que contribuíram para minha formação. Em especial ao professor Arnaldo Chaer pela atenção, ensinamentos e sugestões durante a conduta das aulas de Microbiologia Geral.
A Alexandra pela amizade, companheirismo e pela ajuda indispensável para a realização deste trabalho.
A Carol pela amizade e por compartilhar os momentos bons e ruins durante todo o curso.
Aos colegas do Laboratório de Microbiologia de Anaeróbios: Isabela, Juliana, Henrique, Marcelão, Aline, Marcelo, Claudinha, Ana Andréa e Janaína. Em especial a Fernanda pela amizade e ajuda nas extrações de bovicina.
Aos colegas do Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Patógenos: Adriana Ponce, Gardênia, Evandro, Renata, Simone e Wanessa pela ajuda e boa vontade.
A todos os Funcionários do Departamento de Microbiologia, em especial, Adriana, Pablo e José Carlos pela ajuda na realização desse trabalho. A Nilcéa, Laura e Rejane pelo auxílio.
Aos amigos do BIOAGRO, em especial a Talitinha, Mariana, Néia, Fabi, Maike, Péricles, Eliana, Thiago, Guilherme e Juline pela ajuda e momentos de descontração.
Luiz Fernando Veríssimo
“Não deixe que a saudade sufoque, que a rotina acomode, que o medo impeça de tentar. Desconfie do destino e acredite em você.
Gaste mais horas realizando que sonhando,
fazendo que planejando, vivendo que esperando
porque, embora
quem quase morre esteja vivo, quem quase vive já morreu.”
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ... viii
LISTA DE TABELAS ... x
RESUMO ... xi
ABSTRACT... xiii
INTRODUÇÃO... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 3
2.1.BACTÉRIAS ASSOCIADAS À DETERIORAÇÃO DE SUCOS DE FRUTAS... 3
2.2.ALICYCLOBACILLUS E A DETERIORAÇÃO DE SUCOS DE FRUTAS... 5
2.3.BACTERIOCINAS E MECANISMO DE AÇÃO... 13
2.4.NISINA... 15
2.5.BOVICINA HC5... 16
2.6.MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (AFM) UTILIZADA EM ANÁLISES DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS... 18
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 20
3.1.MICRORGANISMO E CONDIÇÕES DE CULTIVO... 20
3.3.DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA NISINA... 22
3.4.EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE O CRESCIMENTO DE A. ACIDOTERRESTRIS22
3.5. EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE A VIABILIDADE CELULAR DE A.
ACIDOTERRESTRIS EM TAMPÃO FOSFATO... 22
3.6. EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE A VIABILIDADE CELULAR DE A.
ACIDOTERRESTRIS EM DIFERENTES SUCOS DE FRUTAS... 23
3.7.PREPARO DA SUSPENSÃO DE ENDOSPOROS DE A. ACIDOTERRESTRIS... 25
3.8.DETERMINAÇÃO DO VALOR D DE ESPOROS DE A. ACIDOTERRESTRIS EM DIFERENTES SUCOS DE FRUTAS... 25
3.9. ANÁLISE DA MORFOLOGIA E DO ENVELOPE CELULAR DE A. ACIDOTERRESTRIS TRATADO COM BOVICINA HC5 E NISINA... 26
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 27
4.1. EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE O CRESCIMENTO DE A.
ACIDOTERRESTRIS... 27
4.2. EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE A VIABILIDADE CELULAR DE A.
ACIDOTERRESTRIS EM TAMPÃO FOSFATO... 30
4.3.EFEITO DE BOVICINA HC5 SOBRE A VIABILIDADE CELULAR DE A. ACIDOTERRESTRIS EM DIFERENTES SUCOS DE FRUTAS... 32
4.3.1.VIABILIDADE CELULAR DE A. ACIDOTERRESTRIS EM DIFERENTES SUCOS DE FRUTAS, CONTENDO DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE BOVICINA HC5 E NISINA... 37
4.4.DETERMINAÇÃO DO VALOR D DE ESPOROS DE A. ACIDOTERRESTRIS EM DIFERENTES SUCOS DE FRUTAS NA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE BACTERIOCINA... 42 4.5.CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS E DO ENVELOPE CELULAR DE A. ACIDOTERRESTRIS
TRATADO COM BOVICINA HC5 E NISINA... 45
5. CONCLUSÕES ... 53
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE BOVICINA HC5 E DE NISINA NO CRESCIMENTO DE A. ACIDOTERRESTRIS DSMZ2498 EM CALDO BAM...28 FIGURA 2. NÚMERO DE CÉLULAS VIÁVEIS DE A. ACIDOTERRESTRIS DSMZ 2498 INCUBADOS EM TAMPÃO FOSFATO COM BOVICINA HC5 E NISINA...31
FIGURA 3. EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE BOVICINA HC5 SOBRE A.
ACIDOTERRESTRIS DSMZ2498 INOCULADO EM SUCO DE ABACAXI...32
FIGURA 4. EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE BOVICINA HC5 SOBRE A.
ACIDOTERRESTRIS DSMZ2498 INOCULADO EM SUCO DE UVA...33
FIGURA 5. EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE BOVICINA HC5 SOBRE A.
ACIDOTERRESTRIS DSMZ2498 INOCULADO EM SUCO DE MANGA...33
FIGURA 6. EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE BOVICINA HC5 SOBRE A.
ACIDOTERRESTRIS DSMZ2498 INOCULADO EM SUCO DE MAMÃO...35
FIGURA 7. EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE BOVICINA HC5 SOBRE A.
ACIDOTERRESTRIS DSMZ2498 INOCULADO EM SUCO DE LARANJA...35
FIGURA 8. EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE BOVICINA HC5 SOBRE A.
FIGURA 9. EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE A. ACIDOTERRESTRIS DSMZ 2498 INOCULADO EM SUCO DE ABACAXI...38
FIGURA 10.EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE A. ACIDOTERRESTRIS DSMZ2498 INOCULADO EM SUCO DE LARANJA...39
FIGURA 11.EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE A. ACIDOTERRESTRIS DSMZ2498 INOCULADO EM SUCO DE UVA......39
FIGURA 12.EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE A. ACIDOTERRESTRIS DSMZ2498 INOCULADO EM SUCO DE MAMÃO...41
FIGURA 13.EFEITO DE BOVICINA HC5 E NISINA SOBRE A. ACIDOTERRESTRIS DSMZ2498 INOCULADO EM SUCO DE MANGA...41
FIGURA 14. EFEITO DE BOVICINA HC5 SOBRE A. ACIDOTERRESTRIS DSMZ 2498 INOCULADO EM SUCO DE MAÇÃ...42
FIGURA 15.IMAGENS TRIDIMENCIONAIS TOPOGRÁFICAS COM O MODO INTERMITENTE DE MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (NT-MDT), DA SUPERFÍCIE CELULAR DE A.
ACIDOTERRESTRIS DMSZ2498 TRATADAS COM BOVICINA HC5...47
FIGURA 16.IMAGENS TRIDIMENCIONAIS TOPOGRÁFICAS COM O MODO INTERMITENTE DE MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (NT-MDT), DA MORFOLOGIA CELULAR DE
A. ACIDOTERRESTRIS DMSZ2498 TRATADAS COM BOVICINA HC5...48
FIGURA 17.IMAGENS TRIDIMENCIONAIS TOPOGRÁFICAS COM O MODO INTERMITENTE DE MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (NT-MDT), DA REDUÇÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS VEGETATIVAS E ESPORULAÇÃO DE A. ACIDOTERRESTRIS DMSZ2498 TRATADAS COM BOVICINA HC5...49
FIGURA 18.IMAGENS TRIDIMENCIONAIS TOPOGRÁFICAS COM O MODO INTERMITENTE DE MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (NT-MDT), DA SUPERFÍCIE CELULAR DE A.
ACIDOTERRESTRIS DMSZ2498 TRATADAS COM NISINA...50
FIGURA 19.IMAGENS TRIDIMENCIONAIS TOPOGRÁFICAS COM O MODO INTERMITENTE DE MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (NT-MDT), DA MORFOLOGIA CELULAR DE
A. ACIDOTERRESTRIS DMSZ2498 TRATADAS COM NISINA...51
FIGURA 20.IMAGENS TRIDIMENCIONAIS TOPOGRÁFICAS COM O MODO INTERMITENTE DE MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (NT-MDT), DA REDUÇÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS VEGETATIVAS DE A. ACIDOTERRESTRIS DMSZ2498 TRATADAS COM NISINA...52
LISTA DE TABELAS
TABELA 1.CARACTERÍSTICAS DOS SUCOS UTILIZADOS NESTE ESTUDO...24
TABELA 2. EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE BOVICINA HC5 E NISINA
SOBRE O CRESCIMENTO DE A. ACIDOTERRESTRIS EM CALDO BAM...29
TABELA 3. DOSE BACTERICIDA MÍNIMA (DBM) DE BOVICINA HC5 E NISINA CONTRA
A. ACIDOTERRETRIS INOCULADO EM DIFERENTES SUCOS DE FRUTAS...38
TABELA 4.TEMPO DE REDUÇÃO DECIMAL (D90 ºC) DE ESPOROS DE A. ACIDOTERRESTRIS
EM DIFERENTES SUCOS DE FRUTAS CONTENDO 80 UA/ML DE BOVICINA
RESUMO
SOUZA, Aryádina Mara Ribeiro, M. Sc., Universidade Federal de Viçosa, junho de 2008. Atividade das bacteriocinas bovicina HC5 e nisina sobre o crescimento e a resistência térmica de Alicyclobacillus acidoterrestris em sucos de frutas Orientador: Hilário Cuquetto Mantovani. Co-orientadores Maria Cristina Dantas Vanetti e Célia Alencar de Morais.
Alicyclobacillus acidoterrestris é uma bactéria termoacidófila, esporogênica, que tem sido relacionada com a deterioração de sucos de frutas pasteurizados. A prevenção da deterioração dos sucos ácidos por A. acidoterrestris é considerado um desafio para a indústria de sucos de frutas e novas alternativas são necessárias para o controle deste microrganismo. O uso de bacteriocinas de bactérias do ácido láctico tais como a nisina, pode ser uma alternativa interessante para o controle de bactérias deterioradoras termoacidófilas. Entretanto, outros peptídeos apresentam estrutura e função que conferem potencial para aplicação na preservação de alimentos. Neste estudo, foi avaliado o efeito de bovicina HC5 e nisina sobre o crescimento e a resistência térmica de A. acidoterrestris DSMZ 2498 inoculado em diferentes sucos de frutas. A adição de bacteriocinas ao meio de cultura reduziu a velocidade específica de crescimento e a densidade óptica (DO) máxima mensurada. Quando bovicina HC5 foi utilizada nas concentrações de 10 e 20 UA/mL o crescimento de A. acidoterrestris foi completamente inibido. Resultados semelhantes foram obtidos quando as culturas foram tratadas com nisina. Ambas bacteriocinas apresentaram efeito bactericida contra células vegetativas de A. acidoterrestris inoculadas em tampão fosfato pH 4,0. Doses de 10 e 25 UA/mL de bovicina HC5 e nisina
adicionadas aos sucos de abacaxi, uva e manga reduziram a viabilidade celular de A. acidoterrestris. Entretanto, esse efeito não foi observado quando as bacteriocinas foram adicionadas aos sucos de mamão, laranja e maçã. Esses resultados sugerem que a composição do suco de fruta afeta a atividade ou a estabilidade da bacteriocina. A dose bactericida mínima (DBM) de bovicina HC5 e de nisina contra A. acidoterrestris inoculado em diferentes sucos de frutas foi de 66,6 e 60,0 UA/mL, respectivamente. Também avaliou-se o efeito de bovicina HC5 e nisina na redução térmica de A. acidoterrestris. A adição de bovicina HC5 ou nisina na concentração de 80 UA/mL nos sucos de frutas reduziu a resistência térmica dos esporos de A. acidoterrestris a 90 oC (D90°C) em quase 30 vezes. A observação de células
vegetativas de A. acidoterrestris DSMZ 2498 tratadas com bovicina HC5 ou nisina por meio de microscopia de força atômica revelou mudanças severas no envelope celular e na morfologia de células vegetativas de A. acidoterrestris. Considerando os resultados obtidos neste trabalho, bovicina HC5 e nisina demonstraram serem efetivas contra A. acidoterrestris e apresentam potencial para reduzir a deterioração de sucos de frutas por bactérias termoacidófilas.
ABSTRACT
SOUZA, Aryádina Mara Ribeiro, M. Sc., Federal University of Viçosa, June, 2008. Activity of the bacteriocins bovicin HC5and nisin on the growth and the thermal resistance of Alicyclobacillus acidoterrestris in fruit juices. Advisor: Hilário Cuquetto Mantovani. Co-advisors: Maria Cristina Dantas Vanetti and Célia Alencar de Morais.
Alicyclobacillus acidoterrestris is a thermoacidophilic sporogenic bacterium which has been related to the deterioration of pasteurized fruit juices. The prevention of acid juice deterioration by A. acidoterrestris is considered a challenge by the fruit juice industry, and new alternatives are needed to control this microorganism. The use of bacteriocins from lactic acid bacteria such as nisin, can be an interesting alternative for the control of thermoacidophilic deteriorative bacteria. However, other peptides present structure and function that confer potential for their application in food preservation. In this study, the effect of bovicin HC5 and nisin was evaluated on the growth and thermal resistance of A. acidoterrestris DSMZ 2498 inoculated in different fruit juices. The addition of bacteriocins to the culture media reduced the specific growth rate and the maximum optical density (OD). When bovicin HC5 was used in concentrations of 10 and 20 UA/mL, the growth of A. acidoterrestris was completely inhibited. Similar results were obtained when the cultures were treated with nisin. Both bacteriocins presented bactericidal effects against vegetative cells of A. acidoterrestris inoculated in phosphate buffer at pH 4.0. Doses of 10 and 25 UA/mL of bovicin HC5 and nisin respectively, added to pineapple juices, grape
juices, and mango juices reduced the cellular viability of A. acidoterrestris. However, this effect was not observed when the bacteriocins were added to papaya juice, orange juice and apple juice. These results suggest that the composition of fruit juice affects bacteriocin activity or stability. The minimum bactericidal dose (MBD) of bovicin HC5 and nisin against A. acidoterrestris inoculated in different fruit juices was 66.6 and 60.0 UA/mL, respectively. The effect of bovicin HC5 and nisin in the thermal reduction of A. acidoterrestris was also evaluated. The addition of bovicin HC5 or nisin at the concentration of 80 UA/mL in fruit juices reduced the thermal resistance of A. acidoterrestris spores at 90 oC (D90°C) almost 30 times. The
observation of A. acidoterrestris DSMZ 2498 vegetative cells treated with bovicin HC5 or nisin through atomic force microscopy revealed severe changes in the cellular envelope and in the A. acidoterrestris vegetative cells morphology. Considering the results obtained in this study, bovicin HC5 and nisin demonstrated effectiveness against A. acidoterrestris, and present potential to reduce the deterioration of fruit juices by thermoacidophilic bacteria.
INTRODUÇÃO
O Brasil é um dos grandes exportadores de sucos de frutas e essa atividade econômica contribui, significativamente, para a balança comercial do país. Além disso, as atividades de cultivo e processamento de frutas geram grande número de empregos e renda nas regiões produtoras. A qualidade da matéria-prima e do produto processado é fundamental para o crescimento contínuo do setor e da competitividade do Brasil no cenário internacional. Entretanto, a deterioração de sucos de frutas causada por microrganismos acarreta prejuízos para a indústria assim como para o país.
Os sucos concentrados possuem características que contribuem para a qualidade microbiológica do produto e dificultam ou impedem o crescimento de microrganismos. Apesar disso, é considerado um alimento passível de deterioração após serem reconstituídos. Quando o suco reconstituído é pasteurizado, esporos de bactérias resistentes a esse processo, encontram ambiente favorável para a germinação e crescimento, podendo deteriorar o produto. Um importante grupo de bactérias associadas à deterioração de sucos de frutas são as termoacidófilas que, freqüentemente, produzem esporos com elevada resistência térmica.
Atualmente, um dos microrganismos termoacidófilos de interesse na industria de sucos é Alicyclobacillus acidoterrestris. A importância dessa bactéria reside no elevado potencial deteriorador pela produção de “off-flavor” e pela resistência térmica de seus esporos, o que dificulta sua eventual inativação durante o processamento dos sucos. Os esporos de A. acidoterrestris estão presentes no solo e
podem contaminar frutos, materiais e equipamentos utilizados durante o processamento da matéria-prima.
A prevenção da deterioração dos sucos ácidos por A. acidoterrestris, bem como a estabilidade dos sucos de frutas durante a estocagem são considerados desafios para a indústria de sucos, já que o processo térmico requerido para inativar esporos desta bactéria também produz mudanças sensoriais indesejáveis nesses produtos para o consumo. Assim, tem ocorrido aumento no interesse pelo estudo de alternativas mais eficientes na prevenção do crescimento desse microrganismo. Dentro deste contexto, o uso de bacteriocinas de bactérias do ácido láctico pode ser uma alternativa interessante para o controle de bactérias deterioradoras termoacidófilas. Esses peptídeos possuem efeito bactericida ou bacteriostático e tem ação principalmente contra bactérias gram-positivas. Várias bacteriocinas de bactérias lácticas já foram purificadas e caracterizadas, sendo que a nisina é a única bacteriocina aprovada para ser utilizada na conservação de alimentos.
Entretanto, outros peptídeos apresentam estrutura e função que conferem potencial para aplicação na preservação de alimentos. Neste trabalho, avaliou-se a efetividade da bacteriocina bovicina HC5 contra A. acidoterrestris, devido ao amplo espectro antimicrobiano e estabilidade térmica e ao pH do peptídeo produzido por Streptococcus bovis HC5. Considerando que as bacteriocinas agem como coadjuvantes no tratamento térmico para reduzir a resistência ao calor dos esporos e atuam como componente de um sistema de múltiplas barreiras (pH, temperatura, concentração de sólidos solúveis, etc) para evitar o desenvolvimento de A. acidoterrestris, neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de bovicina HC5 e nisina sobre o crescimento e a resistência térmica de A. acidoterrestris inoculado em diferentes sucos de frutas. Visto que, observações prévias resultaram na hipótese de que bovicina HC5 possui efeito bactericida sobre células vegetativas de A. acidoterrestris e de que sua atividade poderia ser afetada pelas características intrínsecas dos alimentos.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Bactérias associadas à deterioração de sucos de frutas
A qualidade dos sucos de frutas é influenciada basicamente por fatores microbiológicos, enzimáticos, químicos e físicos, que comprometem suas características sensoriais e nutricionais (CORRÊA NETO e FARIA, 1999).
As características físico-químicas dos sucos concentrados, tais como: pH entre 3,5 e 4,0; atividade de água menor que 0,9, alta concentração de matéria sólida dissolvida (65 ºBrix), redução da capacidade de aeração e oxigênio dissolvido, em adição ao tratamento térmico durante o processo de concentração e armazenamento sob refrigeração, inibem o crescimento de microrganismos deterioradores e, ou patogênicos (EGUCHI et al., 1999).
Entretanto, os sucos de frutas são substratos apropriados para o desenvolvimento de alguns microrganismos deterioradores, tais como bactérias esporulantes e fungos, capazes de sobreviver ao tratamento térmico aplicado, podendo crescer a baixos valores de pH. Estes microrganismos podem deteriorar o produto ao promoverem a alteração de alguns de seus componentes como carboidratos, proteínas e vitaminas, produzindo odores e sabores indesejáveis e mudanças na cor, pH e textura do produto final (EGUCHI et al., 2001).
Porém, depois de reconstituídos com água, que reduz o Brix para cerca de 11º, o produto fica mais susceptível à ação de microrganismos deterioradores. Quando o
suco reconstituído é pasteurizado, a maioria das formas vegetativas de microrganismos é eliminada. Porém, os esporos de algumas bactérias são resistentes ao processo de pasteurização. No suco, essas bactérias encontram ambiente favorável para a germinação e crescimento, podendo deteriorar o produto (EGUCHI et al., 1999).
No final da década de 80 o crescimento de microrganismos em sucos ácidos já havia sido bem documentado, sendo frequentemente associado com a produção de “off-flavor” e outros produtos do metabolismo microbiano (PARISH, 1991). A microbiota de sucos de frutas é constituída por bactérias acidotolerantes, leveduras e bolores, sendo que a maioria das bactérias acidotolerantes encontradas são Lactobacillus e Leuconostoc (PARISH e HIGGINS, 1988). Deste modo, os sucos de frutas foram considerados durante muito tempo, como produtos passíveis de deterioração causada por leveduras, bolores e bactérias lácticas. No entanto, hoje sabe-se que os sucos de frutas são substratos adequados para o desenvolvimento de bactérias termoacidófilas formadoras de esporos, capazes de sobreviver a tratamentos térmicos de pasteurização e de crescer em baixo pH (EIROA, 1999).
As espécies de bactérias deterioradoras freqüentemente associadas a sucos de frutas processados (pH < 4.5) inclui microrganismos do gênero Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Leuconostoc, e bactérias acetogênicas. Também tem sido encontrados Streptococcus e espécies de Pediococcus com menor freqüência em suco de frutas processado (KUSANO et al., 1997).
Formas esporuladas têm papel importante na deterioração de alimentos ácidos. Sendo este envolvimento associado à alta resistência térmica dos esporos, que em algumas espécies, ainda são viáveis mesmo depois de tratamentos térmicos como a pasteurização. Porém, devido ao baixo pH dos sucos ácidos, as espécies que podem crescer em tais substratos são, principalmente, dos gêneros Clostridium, Bacillus e Alicyclobacillus (EGUCHI et al., 1999).
Bactérias do gênero Clostridium que apresentam metabolismo fermentativo e formam esporos resistentes ao calor representam um grupo de organismos potencialmente deterioradores e também algumas espécies são de risco para a saúde pública (EIROA, 1999). Espécies associadas a alimentos ácidos incluem Clostridium pasteurianum que cresce a pH 3,8 a 5,0 e Clostridium butyricum que cresce a pH 3,8 a 4,0 (PIRES, 2006).
Espécies anaeróbias facultativas pertinentes a alimentos ácidos incluem: Bacillus coagulans, B. licheniformes, B. mascerans, B. polymyxa (EGUCHI et al., 1999). No gênero Bacillus, as espécies de maior importância são B. stearothermophilus (termófilas e deterioradoras de alimentos de baixa acidez) e B. coagulans (termófilas e cresce em alimentos com valores mínimos de pH entre 4,0 e 5,0) que freqüentemente acidificam produtos a base de tomate (suco, pasta) e frutas enlatadas por meio de fermentação chamada “flat sour” (PIRES, 2006).
Outro importante microrganismo termoacidófilo formador de esporos é o Alicyclobacillus que está associado com a deterioração de sucos de frutas ácidas, conservas, refrigerantes e bebidas isotônicas (YAMAZAKI et al., 1996). Atualmente, este gênero envolve várias espécies: A. acidoterrestris, A. acidocaldarius, A. cyclohepetanicus, A. hesperidium, A. sendaiensis, A. acidiphilus, A. mali, A.vulcanalis, A. pomorum, A. herbarius. A. acidoterrestris tem sido considerado indicador microbiológico da qualidade de sucos de frutas. (PEÑA, 2005).
2.2. Alicyclobacillus e a deterioração de sucos de frutas
A deterioração de sucos de frutas devido a produção de “off-flavor” e mudanças na coloração por A. acidoterrestris e A. acidocaldarius foi descrita por Chen et al. (2006). A primeira ocorrência de deterioração de suco de fruta causada por um microrganismo acidófilo formador de esporo foi relatada em suco de maçã (pH 3,15), envasado assepticamente na Alemanha em 1982 (CERNY et al., 1984). O microrganismo deteriorador foi inicialmente classificado como Bacillus acidoterrestris, mas, posteriormente, a bactéria foi reclassificada no gênero Alicyclobacillus (WISOTZKEY et al., 1992).
Em 1994, Splittstoesser e colaboradores isolaram estirpes de Bacillus acidófilos em suco de maçã industrializado e envasado a quente. Os sucos apresentaram “off-flavor”, leve turbidez e ausência de formação de gás. Mcintyre et al. (1995) isolaram Bacillus acidófilos esporulados de suco reconstituído e envasado a quente, sendo estas bactérias isoladas da água utilizada no preparo dos sucos. Previdi et al. (1995) caracterizaram, na Itália, estirpes de bactéria esporulada acidófila isolada de suco de laranja não deteriorado, que mostraram características similares com as de A.
acidoterrestris. No Brasil, Pinhatti et al. (1997) enumeraram até 1,8 x 102 UFC/mL de Alicyclobacillus em amostras de concentrado de laranja. Eiroa et al. (1999) detectaram ocorrência de 14,7% de Alicyclobacillus em suco concentrado de laranja em um total de 75 amostras analisadas. Recentemente, Mcknight (2003) indicou a presença de esporos de A. acidoterrestris em 28% das 57 amostras de suco de maracujá comercial analisadas, sendo que a contaminação variou de 1,1 a maior do que 23 NMP/100 mL. Esse mesmo autor não verificou a presença desta bactéria em suco de abacaxi.
Segundo Chang e Kang (2004), o conteúdo de sólidos solúveis em sucos de frutas é um importante fator para o crescimento de Alicyclobacillus. O crescimento é inibido quando o conteúdo de açúcar nas amostras excede 18 °Brix. Além disso, Splittstoesser et al. (1998) observaram que compostos fenólicos inibem o crescimento desse microrganismo, uma vez que sucos de uva vermelha apresentaram-se mais inibitórios que os sucos de uva branca. O crescimento de Alicyclobacillus é inibido quando a concentração de etanol excede 6%. Esse fato evita que os vinhos de mesa sejam deteriorados, embora determinadas cidras possam ser susceptíveis à formação de “off-flavor” (SPLITTSTOESSER et al., 1998).
A deterioração de sucos a base de frutas por Alicyclobacillus tem sido caracterizada pelo desenvolvimento de odor descrito como anticéptico, desinfetante ou medicinal, embora muitas vezes o odor produzido pela deterioração seja pouco perceptível (EGUCHI et al., 2001; MURRAY et al., 2007). As características típicas de deterioração por esta bactéria geralmente são relatadas como sabor desagradável, eventual aumento na turbidez do suco e presença ou não de sedimentos no interior da embalagem (YAMAZAKI et al., 1996; JENSEN et al., 2001).
A principal substância responsável pelo odor característico de deterioração por Alicyclobacillus foi identificada como guaiacol (2-metoxifenol) (SPLITTSTOESSER et al., 1998), podendo ser produzida a partir do aminoácido vanilina (YAMAZAKI et al,, 1996) ou do aminoácido tirosina (JENSEN et al., 2001). Segundo Niwa e Kuriyama (2003), o guaiacol se forma a partir de ácido ferúlico em sucos de frutas, via vanilina e ácido vanílico.
Segundo Pettipher et al. (1997) e Orr et al. (2000), concentrações de 2 ng/mL de guaiacol podem ser detectadas por medições sensoriais em suco de frutas. Em suco de maçã e laranja a presença de guaiacol foi detectada quando
aproximadamente 105 UFC/mL de A. acidoterrestris estavam presentes no suco. EGUCHI et al. (2001) demonstraram, por meio de análise sensorial, pequena diferença em relação ao odor para concentrações de 102 esporos/mL quando comparado com suco não inoculado, sendo o odor mais intenso para concentrações de 103 esporos/mL de Alicyclobacillus.
Outra substância a qual também é atribuída à formação de odor desagradável nos sucos deteriorados por Alicyclobacillus é o 2,6 dibromofenol. Jensen (1999) detectou a presença desta substância em sucos de frutas contaminados por Alicyclobacillus. No entanto, até então, a detecção de halofenóis em sucos tinha sido atribuída à contaminação por agentes sanificantes e não havia sido relacionada com uma contaminação microbiana.
Sucos de frutas não são os únicos alimentos deteriorados que apresentam concentrações detectáveis de guaiacol e a presença deste composto também é determinada em vinhos (ÀLVAREZ-RODRÍGUEZ et al, 2003), em leites achocolatados, iogurtes e sorvetes deteriorados (JENSEN et al., 2001).
Álvarez-Rodriguez et al. (2003), em estudo com microrganismos isolados de cortiça utilizada para o engarrafamento de vinho, observou a produção de guaiacol por quatro diferentes espécies bacterianas, sendo um isolado de Bacillus subtilis e três isolados de Streptomyces. Essa pesquisa demonstrou que outros microrganismos, além de A. acidoterrestris, produzem guaiacol. Recentemente, foi comprovada a produção de guaiacol por outra espécie de Alicyclobacillus, A. acidiphilus, indicando que os estudos sobre a deterioração de produtos ácidos devem ser direcionados a outras espécies de Alicyclobacillus (CHANG e KANG, 2004).
Segundo Matsubara (2002), o gênero Alicyclobacillus spp. abrange microrganismos heterotróficos isolados de diferentes ambientes, incluindo locais geotérmicos, solo e alimentos processados termicamente. Até 1994, as espécies de Alicyclobacillus foram classificadas no gênero Bacillus e foram denominadas Bacillus acidocaldarius (DARLAND e BROCK, 1971), Bacillus acidoterrestris (DEINHARD et al., 1987a) e Bacillus cycloheptanicus (DEINHARD et al., 1987b). No entanto, análises comparativas do rDNA 16S e do perfil de ácidos graxos de membrana demonstraram que estas espécies eram suficientemente diferentes de outras espécies de Bacillus, justificando a reclassificação em um novo gênero (WISOTZKEY et al., 1992).
As espécies mais estudadas desse gênero são: A. acidocaldarius que se caracteriza por bastonetes aeróbios, gram-positivos, formadores de endosporos, com 2 a 3 µm de comprimento e 0,7 a 0,8 µm de largura. Os endosporos são terminais ou subterminais, possuindo elevada resistência ao calor. As colônias são planas com bordas irregulares não pigmentadas. O ácido graxo predominante na membrana é o ω-cyclohexil, sendo que o undecanoico (C:17) e o ω-cyclohexil-tridecanoico (C:19) contribuem com o 50% do total de ácidos graxos da membrana. A faixa de temperatura para o crescimento varia de 45 a 70 ºC, e o pH ótimo de crescimento varia de 2,0 a 7,0 (DARLAND e BROCK, 1971).
A espécie A. cycloheptanicus é caracterizada por apresentar bastonetes aeróbios gram-positivos e formar endosporos subterminais. O tamanho da célula é de 2,5 a 4,5 µm de comprimento e 0,35 a 0,55 µm de largura. Os esporos são ovais e as colônias são circulares e pequenas. As células requerem fatores para o crescimento tais como metionina, isoleucina e vitamina B12. O principal ácido graxo da membrana celular é o ácido graxo ω-undecanoico, ω- cycloheptil-tridecanoico e o ácido ω-cycloheptil-a-hidroxi-undecanoico. A faixa de temperatura para o crescimento varia de 40 a 53 ºC, e o pH ótimo de crescimento varia de 3,0 a 5,5 (DEINHARD et al., 1987b).
A. acidoterrestris são bastonetes aeróbios gram-positivos, formadores de endosporos terminais ou subterminais, cujo tamanho varia de 2,9 a 4,3 µm de comprimento e 0,6 a 0,8 µm de largura. Os esporos são ovais e as colônias são circulares, de coloração creme-clara, opacas a translúcidas. Não requerem nenhum fator de crescimento (DARLAND e BROCK, 1971; DEINHARD et al., 1987; YAMAZAKI et al., 1996). A temperatura ótima de crescimento está em torno de 42 a 53 ºC, porém, algumas estirpes podem crescer em temperaturas ótimas de aproximadamente 37ºC.
A. acidoterrestris é uma bactéria termoacidófila, formadora de esporos, não patogênica, isolada de diferentes ambientes. Estirpes de A. acidoterrestris tem sido isoladas geralmente de solos de fazendas, florestas, jardins e sucos de frutas deteriorados (MATSUBARA et al., 2002). A espécie A. acidoterrestris possui como componente principal da membrana celular ácidos graxos ω-ciclohexano (DARLAND e BROCK, 1971; DEINHARD et al., 1987; YAMAZAKI et al., 1996; TERRANO et al., 2005). A presença destes ácidos graxos parece estar relacionada
com a resistência às condições ácidas e às altas temperaturas, o que contribui para a sobrevivência das células sob condições extremas (CHANG e CANG, 2004; TERRANO et al., 2005). Outra característica importante desse microrganismo é que a MK-7 é a principal menaquinona envolvida na cadeia transportadora de elétrons, porém, a presença de MK-6 também já foi descrita (DEINHARD et al., 1987a). A parede celular contém o ácido meso-diaminopimélico como principal diaminoácido. Os resultados da análise de similaridade do rDNA 16S na estirpe DSM 3922 (=ATCC 4380) indicaram relação filogenética próxima com A. acidocaldarius e o conteúdo G + C entre 51,6 e 53,3 mol% (determinado pelo método da desnaturação térmica) (DARLAND e BROCK, 1971; YAMAZAKI,et al., 1996). Em relação às características bioquímicas, destaca-se a não produção de indol e dihidroxiacetona e a reação de Voges-Proskauer negativa ou variável. Também foi observado que A. acidoterrestris não cresce na presença de 5% de NaCl (CHANG e KANG, 2004).
Os esporos do A. acidoterrestris apresentam alta resistência a meios ácidos e temperaturas de pasteurização comumente aplicados durante o processamento de sucos de frutas e vegetais, sucos concentrados e purês, chá, xarope de açúcar e produtos com baixo pH (MURRAY, 2007). Trabalhos anteriores indicaram que A. acidoterrestris é capaz de crescer em valores de pH que variam de 2,2 a 6,0 (CERNY et al., 1984, DEINHARD et al., 1987a, YAMAZAKI, 1996, TERRANO et al., 2005) com faixa ótima entre 3,5 a 5,0 (PINHATTI et al., 1997).
A extrema resistência aos tratamentos térmicos por endosporos bacterianos é de grande interesse para a conservação de alimentos. Os esporos são metabolicamente dormentes e resistentes a condições ambientais extremas de calor, frio, dessecação, escassez de nutrientes, radiação e exposição a agentes químicos tóxicos (SETLOW, 2003). A resistência térmica de esporos bacterianos depende da espécie, do meio e da temperatura na qual o esporo foi produzido. Esta resistência ao calor tem sido associada com a desidratação do núcleo do esporo, a mineralização das camadas que formam a parede do esporo e a adaptação térmica (SPINELLI, 2006).
O ácido dipicolínico (DPA), que não é encontrado na célula vegetativa, foi associado com a elevada resistência térmica dos esporos bacterianos, especialmente na forma do complexo cálcio-dipicolinato. Por outro lado, a liberação de DPA e de cálcio durante a germinação dos esporos coincide com a perda da resistência térmica (SPINELLI, 2006). Além disso, pequenas proteínas ácidos solúveis (SASP) do tipo
a/b são encontradas nos esporos associadas com o DNA. Essas proteínas previnem a desnaturação dos ácidos nucléicos e contribuem para a resistência ao calor (NAKASHIO e GERHARDT, 1985).
As SASP estão localizadas no citoplasma do núcleo do esporo, o qual apresenta conteúdo de água reduzido em relação à célula vegetativa. A desidratação do núcleo do esporo é o principal fator que contribui para a elevada resistência térmica dos endosporos (NAKASHIO e GERHARDT, 1985). Além disso, a mineralização do núcleo do endosporo com cátions divalentes, como magnésio (Mg+2), manganês (Mn+2) ou cálcio (Ca+2), aumenta a resistência dos esporos ao calor, enquanto a desmineralização dos mesmos causa redução da resistência térmica (CHANG e KANG, 2004). Entretanto, quando Yamazaki et al. (1997) estudaram a influência do meio de esporulação e íons divalentes na resistência térmica de esporos de A. acidoterrestris, não houve diferença na resistência térmica de esporos submetidos a desmineralização seguida da remineralização com cálcio. Além disso, o conteúdo de Ca2+ e Mn2+ dos esporos foi pouco alterado, o que indicou que a presença dos íons divalentes contribui para resistência térmica elevada.
Estudos de condutividade mostraram que os cátions divalentes encontram-se imobilizados no esporo dormente (CARSTENSEN, MARQUES, GERHARDT, 1971). Assim, a manipulação da carga de cátions pode alterar a resistência do esporo. Depois de uma prolongada incubação a baixo pH os cátions são progressivamente eliminados do esporo, resultando em redução da resistência térmica; porém este fenômeno pode ser reversível com a restauração parcial ou completa da resistência dos esporos por meio de uma incubação prolongada com elevada concentração de sais e em pH alcalino (GOMBAS, 1987).
O valor D (tempo necessário para reduzir a população de esporos viáveis em 90% a uma dada temperatura) dos esporos é geralmente baixo quando estes são aquecidos sob condições ácidas, possivelmente por danos causados no DNA (SAKO et al., 1981). A resistência térmica dos esporos pode ser afetada por tratamentos como a sonicação (GOMBAS, 1983) ou radiação ionizante e acidificação, quando aplicados antes ou simultaneamente com o processo térmico. Doses moderadas de radiação ionizante podem causar diminuição no valor D, enquanto o tratamento combinado com radiação e calor pode resultar na inativação sinergística dos esporos (GOMBAS; 1983).
A resistência térmica de A. acidoterrestris pode está relacionada à presença do ácido graxo com radical ω-ciclohexil na membrana celular desta bactéria, o que contribui para sua sobrevivência a baixos valores de pH e altas temperaturas (MCKNIGHT, 2003). Silva et al. (1999) avaliaram a influência do pH (2,5 a 6,0), dos elementos sólidos solúveis (5 a 60 ºBrix) e da temperatura (85 ºC a 97 ºC) na resistência térmica de esporos de A. acidoterrestris e notaram aumento do valor D quando concentração de sólidos solúveis (°Brix) aumentou. A resistência ao calor de A. acidoterrestris foi afetada principalmente pela temperatura, seguida pelo Brix e pelo pH. Os valores D decresceram com o aumento da temperatura e a diminuição do Brix e do pH. Tais resultados indicaram que a inativação dos esporos em suco concentrado (alto Brix) é mais difícil do que em suco pronto para beber (baixo Brix).
Eiroa et al. (1999) determinaram a resistência térmica de esporos de A. acidoterrestris em suco de laranja. Os autores demonstraram que a melhor combinação tempo e temperatura usada para ativar os esporos foi de 70 ºC por 20 minutos. Os esporos demonstraram alta resistência ao calor com valores D variando de 60,8 a 94,5 min a 85 ºC, 10 a 20,6 min a 90 ºC e 2,5 a 8,7 min a 95 ºC. A elevada resistência ao calor dos esporos indica que estes representam risco para a deterioração de sucos pasteurizados, envasados a quente e UHT (Ultra High Temperature).
A pasteurização aplicada aos sucos de frutas, geralmente na faixa de 85 a 95 °C é um processo que previne o crescimento de microrganismos deterioradores e elimina grande parte dos patogênicos (PONTIUS et al., 1998). Contudo, os sucos de frutas são susceptíveis a bactérias esporuladas acidofilicas como o A. acidoterrestris (EIROA et al., 1999). Assim, seriam necessárias temperaturas de 102,1 ºC por 36 segundos reduzir três ciclos logarítmicos de A. acidoterrestris (MCKNIGHT, 2003). No entanto, os fatores de qualidade como: cor, sabor, textura e nutrientes são mais termossensíveis do que os próprios microrganismos, o que dificulta a utilização de métodos de processamento térmico mais drásticos. Neste caso, torna-se necessário aliar ao tratamento térmico mais brando, outros processos de controle da deterioração causada por esse microrganismo (SILVA et al., 2003).
Examinando o efeito de alguns ácidos orgânicos no crescimento de A. acidoterrestris, Yamazaki et al. (1997) constataram que o ácido láctico e o ácido succínico foram inicialmente inibitórios. Porém, após 36 horas, cessou a inibição e a
população bacteriana voltou a crescer, tornando-se semelhante à população alcançada no cultivo controle, ou seja, na ausência de ácido láctico e ácido succínico. A maior inibição do crescimento de A. acidoterrestris foi observada com 0,1% de ácido acético. Os resultados indicaram que os produtos contendo ácido acético, a exemplo de molhos de saladas, não são facilmente deterioradas por esta bactéria. No entanto, produtos à base de outros ácidos podem ser ineficazes na prevenção do crescimento de A. acidoterrestris.
Cerny et al. (2000) estudaram a influência da temperatura do potencial de oxido redução e do conteúdo de oxigênio no crescimento de A. acidoterrestris em suco de frutas. A 46 ºC o crescimento foi mais rápido do que a 35 ºC. A 30 ºC observou-se uma longa fase lag, prolongando-se quando estocados sob refrigeração por várias semanas. O efeito do potencial redox foi avaliado pela adição de ácido ascórbico, testado a 35 ºC. Com a adição de 10 mg de ácido ascórbico o crescimento foi estimulado, entretanto, quando se utilizou concentrações de 15 mg o crescimento foi inibido. Em suco de laranja, 0,1% de oxigênio residual na embalagem foi suficiente para permitir o crescimento da bactéria, sendo que o mesmo não ocorreu em condições anaeróbias; já em suco de maçã, concentrações de oxigênio residual de 3 a 7% permitiram crescimento rápido, similar ao observado na presença de 21% de oxigênio.
Doyle (1999) reportou o efeito de vários desinfetantes sobre esporos de A. acidoterrestris expostos a 23 ºC durante 10 minutos, observando-se reduções logarítmicas de 2,4 a 0,4 quando utilizou-se 1% de H2O2, 200 ppm Cl2, e 500 ppm de
cloreto de sódio acidificado, sendo menos efetiva a exposição da bactéria em 8% de fosfato trisódico e 80 ppm de H2O2 em ácido peracético. Quando foram utilizados
500 ppm de Cl2 e 1200 ppm de cloreto de sódio acidificado em superfícies de maçãs
contendo esporos de A. acidoterrestris, observou-se redução de menos de um ciclo logarítmico na viabilidade celular. O tratamento com 2% H2O2 foi ineficiente para
inativar esporos remanescentes da superfície das maçãs. A inativação de células vegetativas de A. acidoterrestris por tratamento com alta pressão foi realizada por Alpas, Alma e Bozoglu (2003), obtendo-se redução superior a quatro ciclos log em suco de maçã, laranja e tomate, quando aplicado 350 MPa a 50 ºC por 20 minutos.
Outro importante método de controle que é utilizado para prevenir a deterioração de alimentos por A. acidoterrestris são as bacteriocinas. Bactérias do
ácido láctico produzem bacteriocinas que compreendem um amplo e diverso grupo de peptídeos antimicrobianos sintetizados ribossomicamente. Estas possuem efeito bactericida ou bacteriostático, agindo principalmente sobre bactérias gram-positivas (LÜCKE, 2000; CLEVELAND et al., 2001). Segundo Yamazaki et al. (2000), a capacidade da nisina em inibir o crescimento de células vegetativas e, os esporos de A. acidoterrestris, aumentou com a diminuição do pH. O uso de nisina na prevenção da germinação dos esporos e na redução da resistência térmica de A. acidoterrestris em bebidas ácidas indica o potencial de aplicação das bacteriocinas no controle desta bactéria.
2.3. Bacteriocinas e Mecanismo de ação
Segundo Bruno e Montville (1994) e Eijsink et al. (1996), as bacteriocinas são peptídeos biologicamente ativos e exibem propriedades antimicrobianas contra espécies intimamente relacionadas com o organismo produtor. Podem apresentar efeito bactericida ou bacteriostático, dependendo da concentração e apresentam pequeno ou amplo espectro de ação. Têm sua produção mediada por genes localizados em plasmídeos ou no cromossomo e o peptídeo ativo pode interagir com sítios de ligação específicos ou inespecíficos localizados na membrana da bactéria sensível. Em geral, atuam sobre a membrana plasmática, causando dissipação do gradiente eletroquímico em células sensíveis.
Bactérias lácticas caracterizam-se como cocos ou bastonetes gram-positivos, não esporulantes que produzem ácido láctico como produto principal da fermentação de carboidratos (ABEE, 1995). Muitas espécies de bactérias lácticas (Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc), utilizadas na produção de alimentos fermentados, têm apresentado antagonismo contra outras bactérias filogeneticamente relacionadas e contra patógenos (MCMULLEN & STILES, 1996).
Segundo Klaenhammer (1993), as bacteriocinas de bactérias lácticas podem ser divididas em quatro classes, de acordo com as propriedades estruturais e físico-químicas. As bacteriocinas da classe I e II, as mais conhecidas, apresentam massa molecular inferior a 10 kDa e termoestabilidade. As das classes III e IV não são bem conhecidas, mas apresentam massa molecular superior a 30 kDa; são termolábeis e
podem ser proteínas hidrofílicas ou complexos formados por proteínas, fosfolipídios e/ou carboidratos.
Atualmente, uma nova classificação proposta por Cotter et al. (2005) divide as bacteriocinas em duas categorias distintas. A classe I inclui os peptídeos que contêm anéis de lantionina em sua estrutura (lantibióticos), enquanto a classe II abrange as bacteriocinas que não passam por modificação pós-traducional. As bacteriolisinas (agrupadas na classe III) formam um grupo à parte devido ao mecanismo de ação distinto das demais classes, o qual envolve a hidrólise da parede celular bacteriana.
Os estudos sobre o mecanismo de alguns lantibióticos e pequenos peptídeos termoestáveis revelam que a ação das bacteriocinas ocorre na membrana citoplasmática (MONTVILLE & CHEN, 1998, DELVES-BROUGHTON, 2005). Dependendo de sua concentração, as bacteriocinas são bactericidas ou bacteriostáticas e atuam permeabilizando as membranas de células sensíveis por meio da formação de poros, o que resulta no efluxo de íons, dissipação da força próton-motiva (PMF), hidrólise de ATP e eventual perda de viabilidade e lise celular (BRUNO & MONTVILLE, 1994; ENNAHAR et al., 2000).
A primeira fase na formação de poros pela bacteriocina envolve interações eletrostáticas entre as cargas positivas e os grupos polares dos resíduos de aminoácidos da bacteriocina com os fosfolipídios aniônicos presentes na membrana citoplasmática da célula alvo. Nesta fase, a bacteriocina é sensível à ação de enzimas proteolíticas. A segunda fase é irreversível e envolve mudanças letais na membrana das estirpes sensíveis à bacteriocina (CHIKINDAS et al., 1993; ABEE et al., 1995, ENNAHAR et al., 2000).
De acordo com Lücke (2000), as bactérias gram-negativas são menos suscetíveis à ação de bacteriocinas das bactérias do ácido láctico devido à presença da membrana externa que limita o acesso dos peptídeos ao sítio alvo. O tratamento de culturas gram-negativas com agentes quelantes que permeabilizam a membrana externa, o aquecimento ou congelamento em níveis subletais ou o uso de alta pressão pode sensibilizar bactérias gram-negativas, como Salmonella, à ação de bacteriocinas. Além disso, as bactérias gram-negativas são mais sensíveis aos ácidos orgânicos produzidos pelas bactérias lácticas em comparação com as bactérias gram-positivas (ENNAHAR et al., 2000).
Segundo Cotter et al. (2005), apenas a nisina e a pediocina PA-1 são comercialmente produzidas, apesar de existirem várias outras bacteriocinas com potencial para serem utilizadas na preservação de alimentos. A nisina era a única bacteriocina testada na preservação de sucos de frutas e bebidas contendo esporos de Alicyclobacillus. Estudos recentes demonstraram que outras bacteriocinas, além da nisina, podem ser utilizadas na preservação de alimentos ácidos. Por exemplo, enterocina AS-48, produzida por Enterococcus faecalis, mostrou-se capaz de inativar endosporos de A. acidoterrestris em diferentes sucos de frutas (GRANDE et al., 2005).
Outra bacteriocina considerada para este propósito é a bovicina HC5, uma bacteriocina produzida por Streptococcus bovis, mostrou ser efetiva em inibir bactérias deterioradoras de polpa de fruta e que apresentou atividade esporicida contra endosporo de A. acidoterrestris inoculados em polpa de manga (De Carvalho et al., 2008). Além disso, a atividade inibitória de bovicina HC5 já foi demonstrada contra diversos microrganismos, tais como Clostridium aminophilum (MANTOVANI e RUSSELL, 2002) Clostridium sporogenes (FLYTHE e RUSSELL, 2004) e Listeria monocytogenes (MANTOVANI e RUSSELL, 2003).
2.4. Nisina
A bacteriocina mais estudada e empregada na preservação de alimentos é a nisina, produzida por certas estirpes de Lactococcus lactis ssp lactis, e reconhecida pelo FDA (Food and Drug Administration) desde 1989 como substância GRAS (Generally Recognized as Safe) para utilização em alimentos. Estudos toxicológicos realizados com nisina demonstraram que a ingestão da bacteriocina não apresentou efeitos tóxicos para o organismo humano (CARR et al., 2002; DELVES-BROUGHTON, 2005).
O uso da nisina é permitido em queijos pasteurizados para prevenir o crescimento indesejável de Clostridium botulinum, sendo também utilizada em leites não fermentados, frutas enlatadas, vegetais, carnes, pescado e cerveja, na proporção de 500 a 10.000 IU por grama de alimento. Nisina tem sido indicada para preservar o aroma dos alimentos e prevenir a fermentação maloláctica precoce em vinhos quando a fermentação alcoólica ainda não está encerrada, inibindo o crescimento de bactérias
lácticas contaminantes que interferem no equilíbrio de sabor, aroma e características estéticas do vinho. A aplicação mais difundida da nisina é para o controle de esporos, porém os mecanismos bioquímicos desta atividade ainda não foram claramente elucidados. Seu efeito é normalmente esporostático, sendo que a atividade é maior sob condições ácidas ou se os esporos forem previamente tratados pelo calor (CARR et al., 2002).
Komitoupolou et al. (1999) reportaram que a nisina inibe a germinação dos esporos. Os autores observaram que a 44 °C, o crescimento de A. acidoterrestris ocorreu de forma lenta e poucos esporos germinaram. Quando a concentração de nisina utilizada foi de 100 IU/mL, a germinação dos esporos foi totalmente inibida. De acordo com Davis et al. (1998) a estabilidade da nisina não é afetada pelas temperaturas de pasteurização, aplicadas aos sucos de frutas com pH na faixa de 3 a 4. Yamazaki et al. (2000) monitoraram a sensibilidade de A. acidoterrestris frente a diferentes concentrações de nisina e observaram redução de, aproximadamente, 75% no valor de D90ºC dos esporos.
Peña (2005) estudou o efeito da nisina na resistência térmica de esporos de A. acidoterrestris CRA7152 em suco concentrado de laranja (64 º Brix). Avaliou-se a adição de 0, 50, 75 e 100 IU de nisina/mL de suco sob temperaturas de 95 e observou-se que os valores D sem adição de nisina foram de 12,9 min. Quando nisina foi adicionada nas concentrações de 30, 50, 75 e 100 IU/mL ao suco de fruta processado a 95ºC houve diminuição da termoresistência dos esporos e os valores D foram de 12,3, 11,3, 10,4, e 9,4 minutos, respectivamente. Esses resultados indicam que a nisina pode ser considerada uma opção como coadjuvante do tratamento térmico na redução da resistência térmica dos endosporos bacterianos.
2.5. Bovicina HC5
S. bovis HC5 é uma bactéria ruminal gram-positiva, que produz uma bacteriocina (bovicina HC5) com amplo espectro de ação. Bovicina HC5 possui massa molecular de aproximadamente 2440 Da, e seqüência amino terminal e mecanismo de ação que a agrupam com os lantibióticos (MANTOVANI et al, 2002). Bovicina HC5 possui estabilidade térmica (1210C por 20 min) e mostrou-se
resistente a tratamentos com alfa-quimiotripsina e proteinase K, além de ser estável na presença de oxigênio.
A maior parte da bacteriocina produzida por S. bovis HC5 fica associada às células, podendo ser liberada por tratamento com solução ácida de cloreto de sódio (HOULIHAN et al, 2004). Bovicina HC5 age sobre a membrana plasmática das bactérias sensíveis formando poros que causam a perda de potássio intracelular de células energizadas com glicose (MANTOVANI et al., 2002; HOULIHAN et al., 2004). Estas características, aliadas à similaridade com a nisina em relação ao espectro e mecanismo de ação fazem desta bacteriocina um candidato potencial para o controle de patógenos e bactérias deterioradoras de alimentos.
Mantovani e Russell (2003) demonstraram efeito bactericida de bovicina HC5 contra L. monocytogenes, com diminuição de 5 a 7 ciclos log no número de células viáveis após 2 h de exposição à bacteriocina. Bovicina HC5 causou efluxo de potássio intracelular de L. monocytogenes em apenas 15 min, quando o pH do meio foi menor do que 6,0. Esse mesmo efeito não foi observado quando o pH do meio era maior do que 6,0. Células de L. monocytogenes adaptadas ao ácido (pH final 4,6) apresentaram sensibilidade à bovicina HC5 similar àquelas que não eram ácido-adaptadas (pH final 6,3). Estes resultados sustentam a idéia de que bovicina HC5 é efetiva no controle de L. monocytogenes .
De Carvalho et al. (2008) demonstraram atividade bactericida de bovicina HC5 contra células vegetativas de A. acidoterrestris em diferentes valores de pH e atividade esporicida contra esporos desta bactéria inoculados em polpa de manga ou tampão fosfato. Quando esporos de A. acidoterrestris foram tratados termicamente na presença de bovicina HC5, os valores de D diminuíram de 77 a 95% quando comparados aos controles em temperaturas variando de 80 0C a 95 0C. Esses resultados indicam que essa bacteriocina possui potencial para reduzir a resistência térmica dos esporos de A. acidoterrestris. Também foi reportado o efeito bactericida desta bacteriocina contra células de B. cereus, B. thuringiensis e C. tyrobutyricum (DE CARVALHO et al., 2007a; DE CARVALHO et al., 2007b). Esses resultados indicam que bovicina HC5 tem potencial para prevenir a germinação de esporos de bactérias termoacidófilas formadoras de endosporos em sucos de frutas.
2.6. Microscopia de Força Atômica (AFM) utilizada em análises de amostras biológicas
A microscopia de força atômica (AFM) é uma técnica que foi desenvolvida por Binning, Quate e Gerber em 1986, como resultado de uma colaboração entre a IBM e a Universidade de Stanford. Essa técnica permite obter imagens reais, em três dimensões, da topografia das superfícies, com uma resolução espacial, tanto lateral como vertical, e visualização de superfícies em nível atômico de diferentes naturezas tais como: metais, películas orgânicas, polímeros, amostras biológicas em sistemas condutores e isolantes e em diversos meios, incluindo vácuo, pressão atmosférica e meios líquidos (OHNESORGE e BINNING, 1993). O microscópio de força atômica possibilita a observação direta da arquitetura da superfície de células e tem sido utilizado para avaliar características da superfície de diversas moléculas biológicas (STRAUSSER e HEATEON, 1994).
O princípio de funcionamento do AFM baseia-se na varredura da superfície da amostra por uma ponta piramidal (ponteira) de alguns micrômetros de comprimento (100 a 200 µm) e geralmente com menos de 20 nanômetros de diâmetro, integrada em um cantilever (braço) flexível. À medida que a sonda (ponta + cantilever) se aproxima da superfície, os átomos da ponta interagem com os átomos das moléculas da superfície do material, causando a deflexão do cantilever e essa deflexão é proporcional à força de interação. Esta deflexão do braço do AFM é medida por meio da mudança de direção (angular) de um feixe laser emitido por um diodo de estado sólido e refletido pelo braço de AFM, sendo o feixe laser refletido captado por um fotodetector. A sonda do AFM segue os contornos da superfície. Durante o deslocamento da ponta pela superfície o computador analisa, em cada posição na superfície, a força de interação entre a ponta de AFM e a amostra e traça o diagrama das alturas, construindo a topografia do material analisado. A força mais comumente associada com AFM na deflexão do cantilever é a força de van der Waals (STRAUSSER e HEATEON, 1994).
A técnica de AFM pode ser operada em três modos diferentes: contato, não-contato e não-contato intermitente ("tapping"). O modo não-contato intermitente é o mais utilizado em amostras biológicas devido ao fato de que as superfícies são menos modificadas. No modo intermitente o cantilever é mantido bem próximo da superfície da amostra e a força interatômica entre a ponta e a amostra é atrativa.
Neste caso a ponta oscila em alta frequência (100 kHz a 1 MHz), a poucos nanômetros acima da superfície e a força total entre a ponta e a amostra é muito baixa, geralmente em torno de 10-12 N. Esta oscilação aumenta consideravelmente a sensibilidade do microscópio, o que faz com que forças de van der Waals e forças eletrostáticas possam ser detectadas (BEECH et al., 2002; STRAUSSER e HEATEON, 1994)
Os estudos com microscopia de força atômica têm trazido notáveis contribuições à ciência, em especial à biologia, física, ciência dos materiais e microeletrônica. Em sistemas biológicos incluindo células, bactérias, vírus e biomoléculas, isso possibilita a compreensão dos fenômenos biofísicos e químicos, constituindo-se em mais uma ferramenta auxiliar de análise.
Beech et al. (2002) através de imagens topográficas, utilizando o modo intermitente, investigou a formação de biofilmes bacterianos de superfícies metálicas em sistemas industriais. Ferreira (2002), empregou a AFM, no modo intermitente, para obter imagens topográficas de imunoglobulinas de coelho (Ag) e o respectivo complexo com o anticorpo (anti-IgG de coelho) imobilizado em superfície de mica atomicamente plana. Paquim e Brett (2003), utilizaram AFM no estudo dos processos de adsorção de moléculas de DNA na superfície de eletrodos de grafite pirolítica altamente orientada (HOPG). Neste trabalho, a técnica de AFM foi utilizada para avaliar a morfologia e o envelope celular de células de A. acidoterrestris expostas a bovicina HC5 e nisina.
3. MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Microbiologia de Anaeróbios do Departamento de Microbiologia, da Universidade Federal de Viçosa.
3.1. Microrganismo e condições de cultivo
Alicyclobacillus acidoterrestres DSMZ 2498 foi cultivado em condições aeróbias, a 43 0C, em meio BAM - modificado por Silva et al. (1999) - composto por
três soluções: (A) CaCl2.7H2O, 0,25 g; MgSO4.7H2O, 0,5 g; (NH4)2SO4, 0,2 g;
extrato de levedura, 2,0 g; glicose, 5,0 g; KH2PO4, 3,0 g; 1 L de água destilada, o pH
do meio foi ajustado para 4,0 com HCl 1N ou NaOH 1N; (B) Solução de elementos traço SL-6 (1 mL) (ZnSO4.7H2O, 0,1 g; MnCl2.4H2O, 0,03 g; H3BO3, 0,3 g; CoCl2.6
H2O, 0,2 g; CuCl2.2 H2O, 0,01 g; NiCl2.6H2O, 0.02 g; NaMoO4.2H2O, 0,03 g; 1 L
de água destilada. (C) solução de agar 1,5%.
A solução B foi esterilizada por filtração, em membrana de poro 0,22 µm (Milipore 67120 Molsheim, GV, França) e armazenada sob refrigeração, à 4 oC, em garrafas de vidro de 1000 mL. Todas as soluções foram preparadas separadamente. As soluções A e C foram esterilizadas a 121 oC por 15 min. Posteriormente, 1 mL/L da solução B foi misturada a solução A. Para o preparo do meio acrescido de agar, a solução A foi preparada em concentração dupla, adicionada com a solução B e, quando necessário, da solução C.
Para constatar a pureza da cultura estoque de A. acidoterrestris DSMZ 2498 uma alçada do estoque da cultura foi retirada e estriada em placas de petri contendo meio BAM. As placas foram incubadas por 48 horas a 43 oC. Posteriormente, colônias isoladas foram transferidas com alça de repicagem para caldo BAM e incubado em agitador (New Brunswick Scientific, C24, Edison, NJ,U.S.A.) por 24 horas a 43 oC, sob agitação de 120 rpm. Foram realizadas observações culturais das colônias (forma, cor, tamanho), coloração diferencial de Gram e testes de catalase e indol. As culturas puras foram mantidas congeladas a -20 oC no meio de crescimento com 20% de glicerol. Desses estoques foram retiradas alíquotas utilizadas em todo o experimento. Antes de cada experimento, foi feita coloração de Gram para confirmar a pureza da cultura.
3.2. Extração e determinação da atividade de bovicina HC5
O procedimento para extração de bovicina HC5 foi realizado conforme Mantovani et al. (2002). Culturas de S. bovis foram cultivadas em meio basal até atingir a fase estacionária e o pH foi ajustado para 7,0 com NaOH (1 N). Em seguida, a cultura foi aquecida a 70 ºC por 30 min e as células foram centrifugadas à 1742 g, 15 min, 5 ºC (Sorvall® RT 6000 D, GMI, Minnesota, EUA). Após o descarte do sobrenadante, o material centrifugado foi lavado com 50 mL de tampão fosfato de sódio (5 mM, pH 6,7). As células foram ressuspendidas no mesmo volume de cloreto de sódio (100 mM) com pH ajustado para 2,0 utilizando-se HCl (1 N). Em seguida, a suspensão de células foi incubada por 2 h a temperatura ambiente em agitador magnético.A suspensão de células foi então centrifugada (1742 g, 15 min, 5 ºC) e o sobrenadante liofilizado e ressuspenso em 10 mL de tampão fosfato (5 mM, pH 2,0) foi estocado em geladeira até se utilizado.
A atividade antimicrobiana do extrato foi analisada pelo método de difusão em meio sólido descrito por HOOVER e HARLANDER (1993). A. acidoterrestris DSMZ 2498 foi utilizado como microrganismo indicador. Diluições seriadas do extrato foram realizadas em tampão fosfato de sódio pH 2,0 e alíquotas de 25 µL de cada diluição foram aplicadas em orifícios de 5 mm de diâmetro feitos em meio BAM contendo aproximadamente, 107 UFC/mL de A. acidoterrestris. As placas foram incubadas por 24 horas a 43 oC. A atividade de bovicina HC5 foi calculada a
partir do recíproco da maior diluição onde foi possível a visualização dos halos de inibição com diâmetro maior ou igual a 5 mm (a partir da borda do orifício), sendo expressa em unidades arbitrárias por mL (UA/mL).
3.3. Determinação da atividade da nisina
A solução de nisina (Chrisin C; CHL Hansen; 1000 UI/mg) foi preparada diluindo-se 1 g de nisina em 10 mL de solução de 0,02 M e 0,75% de NaCl pH 2,0, conforme descrito por Mazzotta (1997). A solução foi centrifugada a 1742 g por 10 min e o centrifugado descartado. A atividade da bacteriocina foi determinada pelo método de diluição em meio sólido conforme descrito para a bovicina HC5 no item 3.2.
3.4. Efeito de bovicina HC5 e nisina sobre o crescimento de A. acidoterrestris
A cultura de A. acidoterrestris DSMZ 2498 foi ativada em caldo BAM, incubado a 43 oC por 24 horas a 120 rpm. Após incubação, foram transferidos 1,25 mL do inóculo para 50 mL de caldo BAM em frascos erlenmeyer tipo side-arms (250 mL) acrescido de 0,01; 0,1; 1; 10 e 20 UA/mL do extrato de bovicina HC5, obtido como descrito no item 3.2, além do controle, sem adição da bacteriocina. O crescimento foi monitorado pela leitura da densidade óptica (DO) a 600 nm (Spectronic 20D+, Thermo, U.S.A.) durante 12 horas. Foi determinada a velocidade específica de crescimento (µ,h-1), a duração da fase lag (h) e a densidade óptica final
(DO600nm) das culturas na presença das diferentes concentrações de bovicina HC5 e
nisina. Os experimentos foram realizados em triplicata e o mesmo procedimento foi utilizado com a nisina. Os resultados apresentados representaram a média das repetições.
3.5. Efeito de bovicina HC5 e nisina sobre a viabilidade celular de A. acidoterrestris em tampão fosfato
A cultura de A. acidoterrestris DSMZ 2498 foi ativada em caldo BAM e incubada a 43 oC por 24 horas sob agitação de 120 rpm. Foram transferidos 107 UFC/mL para erlenmeyer (125 mL) contendo 50 mL de tampão fosfato 5 mM e pH
4,0 acrescido de 0,1; 1 e 10 UA/mL do extrato de bovicina HC5 ou nisina. Os frascos foram incubados a 43 ºC por 24 horas a 120 rpm e nos tempos 0, 0,25, 0,50, 1, 2, 4, 8, 12 e 24 horas de incubação, alíquotas de 100 µL foram colhidas, diluídas sucessivamente de 10-1 a 10-7. O plaqueamento das diluições foi realizado em triplicata, utilizando a técnica de microgotas (MORTON, 2001) onde 20 µL foram depositados em meio BAM e incubadas a 43 0C por 24 horas. O tratamento controle consistiu na ausência da bacteriocina no tampão fosfato. O experimento foi realizado duas vezes em triplicata e os resultados obtidos representam as médias das repetições.
3.6. Efeito de bovicina HC5 e nisina sobre a viabilidade celular de A. acidoterrestris em diferentes sucos de frutas
Os sucos utilizados neste estudo foram adquiridos em estabelecimento comercial do Município de Viçosa e suas características descritas na Tabela 1. Para avaliar a microbiota presente nos sucos foram inoculadas alíquotas 1% (v/v) em tubos de ensaio contendo 5 mL de caldo BHI e em tubos contendo 5 mL de caldo BAM e incubados por 48 horas a 43 ºC e 120 rpm. O experimento foi realizado em triplicata para cada tipo de suco, sendo o mesmo lote comercial para cada tipo de suco. Foram determinados os seguintes parâmetros para cada suco antes da inoculação e a cada tempo de colheita de amostra, atividade de água (Aw) (“Aqua Lab”, modelo Cx2- Decagon), potencial de hidrogênio (pH) (Tecnal, phmetro digital TEC-2mp) e sólidos solúveis ( Brix) (“Hand-Held Refractometer”, modelo 137531L0/ Leica).
Inicialmente, foi avaliado o efeito do tempo de incubação com bovicina HC5 sobre a viabilidade celular de A. acidoterrestris DSMZ 2498, a cultura foi ativada em caldo BAM e incubada a 43 oC por 24 horas sob agitação de 120 rpm. Foram
transferidos 107 UFC/mL para cada erlenmeyer (125 mL) contendo 50 mL de suco
(Tabela 1) acrescido de 10; 25 e 100 UA/mL do extrato de bovicina HC5 e incubados a 43 ºC e 120 rpm. Amostras de 100 µl foram coletadas após 0, 1, 2, 4, 8, 12 e 24 horas de incubação e submetidas a diluições seriadas sucessivas de10-1 a 10-7. O experimento foi realizado duas vezes em duplicata utilizando a técnica de microgotas descrita no item 3.5. Tratamento controle sem a adição da bacteriocina também foi realizado. Os resultados apresentados representam as médias das repetições.
