Caracterização da amostra e aspectos éticos

Neste trabalho foram avaliados 340 indivíduos voluntários amostrados junto ao Hemocentro de Ribeirão Preto – SP. O presente estudo foi aprovado em seus aspectos éticos pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FFCLRP-USP, de acordo com o Processo CEP-FFCLRP CAAE n.º 25696413.7.0000.5407.

Cada indivíduo participante assinou um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) permitindo o uso de seu material biológico (10 mL de sangue periférico, mantido em tubo Vacutainer® com anticoagulante EDTA) para estudo. Questionários foram aplicados a cada um dos participantes da pesquisa para obtenção de informações a respeito dos fenótipos de pigmentação e ancestralidade.

Os participantes, composto por indivíduos de ambos os sexos, com idade variando de 18 e 70 anos, foram classificados em grupos de acordo com a cor dos olhos, cabelos e pele, bem como quanto a presença ou ausência de sardas. As classificações foram realizadas por dois membros do LPFG de forma independente para que não houvesse influência sobre as respostas, seguida por diálogo para alcançar uma definição consensual. Desta forma, a classificação fenotípica foi estabelecida pela heteroclassificação.

A classificação dos indivíduos com relação à pigmentação da pele foi realizada conforme o sistema proposto por Fitzpatrick (1988), que avalia a resposta da pessoa em relação a exposição ao sol. A Escala Fitzpatrick (EF) é dividida em seis categorias onde a pontuação mais baixa (I) representa pele muito clara e sensível à radiação ultra-violeta e a maior pontuação (VI) representa pele escura, que nunca se bronzeia em reação à radiação ultra-violeta.

Adicionalmente, a intensidade da pigmentação da pele foi quantificada por meio do espectrofotômetro portátil CMR-2500d e do software SkinAnalysis (Konica Minolta Holdings, Inc.), com as especificações de iluminador D65 e observador 2°. O uso deste equipamento permitiu realizar análises quantitativas de modo a tornar mais objetiva a classificação da pele a partir da determinação do índice de melanina de cada indivíduo analisado.

A cor dos olhos e dos cabelos foi caracterizada e dividida de acordo com categorias criadas em nosso laboratório. Estas classificações foram elaboradas a partir de diferentes

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classificações, uma vez que não há um consenso quanto a classificação destes fenótipos na literatura (Edwards et al., 2016). Portanto, as categorias para classificação da cor dos olhos foram (1) azul, (2) verde, (3) mel, (4) castanho claro e (5) castanho escuro. Em relação a cor dos cabelos a classificação compreendeu o (1) ruivo, (2) loiro-claro, (3) loiro-escuro, (4) castanho-claro, (5) castanho-escuro e (6) preto. Imagens fotográficas de regiões corporais pequenas e bem delimitadas (olho, raiz dos cabelos, regiões do braço não-expostas ao sol e região da testa exposta ao sol) foram coletadas de modo que estas não permitissem a identificação do doador. Para tal, foi utilizada uma máquina fotográfica Canon Powershot SX510 HS com abertura, shutterspeed e ISO fixados para f = 3,4, 1/10 e 100, respectivamente, tendo sido utilizada uma distância média de 7 cm entre a câmera e o indivíduo para obtenção das imagens fotográficas. As imagens foram utilizadas para compor um banco de dados, a fim de tornar mais objetiva a classificação de cor dos olhos e cabelos. Sempre que possível, a coleta foi realizada no mesmo local, de modo a tentar minimizar efeitos externos que pudessem interferir na qualidade das fotos e mensuração dos dados do espectrofotômetro.

O controle e cuidado com o local e a iluminação foram primordialmente importantes para as fotografias das íris do indivíduos coletados. Isto porque as imagens fotográficas das íris foram utilizadas para realizar análises quantitativas da cor do olho.

5.1.1. Análise quantitativa da cor dos olhos e estruturas secundárias

Análises quantitativas da cor dos olhos e de estruturas secundárias presentes em ambos os olhos foram realizadas por meio de imagens fotográficas, com o auxílio de um programa desenvolvido no laboratório do Prof. Esteban J. Parra na University of Toronto, Mississauga, Canada. Tais análises foram conduzidas em tal laboratório durante o período de estágio no exterior concedido pela CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior).

As imagens fotográficas foram capturadas durante a coleta de amostras. Cada participante teve as duas íris (direita e esquerda) fotografadas. Visando manter uma iluminação constante, foi acoplado à câmera um flash externo em forma de anel que projetava uma luz de LED branca, contínua e estável. O flash externo poderia ser ajustado quanto a sua intensidade de luz e quanto ao reflexo desta luz na periferia da pupila de três diferentes formas, sendo uma com o flash completo em forma de anel e duas outras formas dividindo o flash em luz direita e esquerda. Quatro imagens fotográficas foram capturadas para cada indivíduo. Para cada íris foi obtido uma foto com o flash voltado para a parte interna do olho (Figura 3A), e uma foto com o flash voltado para a parte externa do olho (Figura 3B).

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A

B

A

B

D

C

Figura 3 - Imagem fotográfica da íris mostrando o posicionamento do flash. A: flash interno (voltado

para a parte interna do olho, sentido ponto lacrimal). B: flash externo (voltado para a parte externa do olho, sentido contrário ao ponto lacrimal).

Para a análise quantitativa através destas fotografias, optamos por utilizar as imagens que possuíam o flash voltado para a parte interna do olho. Isto porque a análise é realizada na metade da íris oposta ao ponto lacrimal e, deste modo, o flash acarretaria em uma menor influência.

O programa para análise quantitativa da cor dos olhos e identificação de estruturas secundárias esta detalhadamente descrito em Edwards et al. (2016). O programa consiste em uma aplicação para a Web, acessada pelo site http://iris.davidcha.ca. Após inserção das fotos no site, cinco etapas são seguidas de modo a avaliar a quantificação pigmentar da íris. Para cada foto, é solicitado ao usuário que identifique (a) o ponto central aproximado da íris, (b) o ponto central aproximado da pupila e, em seguida, (c) desenhe um círculo que melhor se ajuste em torno dos limites da esclera, zona pupilar e collerette iridiana (que separa as zonas pupilar e ciliar da íris) (Figura 4).

A B

A B

D C

Figura 4 - Etapas para delimitação da íris e posterior análise de quantificação. O usuário projeta

círculos que melhor se ajustem (A) à região que delimita a esclera da íris (círculo vermelho), (B) em torno da periferia da pupila (círculo rosa), e (C) à collarette iridiana (círculo azul). (D) Isto permite que o programa identifique a zona pupilar (delimitada pelos círculos azul e rosa) e a zona ciliar (delimitada pelos círculos azul e vermelho).

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Após estas definições, (d) o programa recorta uma fatia da íris em um ângulo de 60º da região ciliar e da região pupilar oposta ao ponto lacrimal do olho, e (e) realiza uma mensuração da cor média dos olhos (Figura 5). As seis etapas finais são utilizadas para identificar estruturas secundárias também presentes nos olhos, como (a) sulcos de contração, (b) nódulos de Wolfflin, (c) criptas de Fuch e pigmentos delimitados (d) na íris e (e) na esclera e (f) anel de pigmentação ao redor da pupila.

A B

A B

D C

Figura 5 - Imagem aumentada do corte de diferentes cores de olho (azul, verde, mel, castanho claro e

castanho escuro, respectivamente), realizado pelo algoritmo do programa utilizado para análises quantitativas.

Cada conjunto de íris (olho direito e olho esquerdo) foi analisado por um único pesquisador (Guilherme Debortoli). Depois de processar todas as fotografias da íris, a visualização independente das regiões cortadas de cada uma das íris foi realizada pelo analista para verificar visualmente quaisquer evidências de obstrução ou delimitação incorreta que pudesse dificultar a análise pelo algoritmo.

A metodologia implantada no algoritmo para quantificação da cor do olho extrai medidas de cor no espectro de cores RGB (do inglês, red, green e blue) das fotografias da íris, e transforma estas medidas na escala CIELAB (do inglês, International Commission on Illumination LAB). CIELAB é um sistema internacional de cores padronizado e projetado para aproximar a percepção de cor pela visão humana (CIE, 1986), motivo pelo qual, tal espectro de cores foi utilizado. As medidas quantitativas fornecidas pelo espectro de cores CIELAB podem ser observadas em três dimensões diferentes, sendo uma dimensão de brilho (L*) e duas dimensões de cores (a* e b*). A primeira dimensão, L*, é usada para representar o brilho, possuindo valores contínuos de 0 a 100, onde 0 é escuro e 100 é claro. As dimensões de a* e b* representam as escalas cromáticas, com valores negativos de a* indicando verde e positivo indicando vermelho, e valores negativos de b* indicando azul e positivos indicando amarelo.