O estudo da CMC possibilitou estabelecer uma faixa de concentrações do tensoativo onde a papaína e a L-cisteína encontravam-se nas condições ideais de solubilidade para uma preparação farmacêutica. Informações obtidas pela literatura permitiram a determinação da faixa de concentração de L-cisteína seriam utilizadas neste estudo. (MIURA, 2012) As formulações planejadas para as etapas seguintes do trabalho foram definidas tendo por base um desenho experimental fatorial de 33. As variáveis independentes foram à concentração de cisteína e de polissorbato e o tempo de armazenagem. O desenho experimental com seus diferentes níveis esta representado na Tabela 6 e 7. Os géis formulados foram avaliados em tempos diferentes, sendo que os dados obtidos logo após a sua preparação foram utilizados para a caracterização dos produtos.
Tabela 6: Desenho experimental fatorial
Níveis Variáveis -1 0 1 L- Cisteína monohidratada (%; p/p) 0,000 0,025 0,050 Polissorbato 80 (%; p/p) 0,4 0,700 1,000 Tempo (dias) 1 15 30
Tabela 7: Formulações para o estudo obtidas a partir de desenho experimental fatorial 33 Variáveis Formulações Cys (%, p/p) P80(%, p/p) Dias P11 0,000 0,400 1 P21 0,000 0,700 1 P31 0,000 1,000 1 P41 0,025 0,400 1 P51 0,025 0,700 1 P61 0,025 1,000 1 P71 0,050 0,400 1 P81 0,050 0,700 1 P91 0,050 1,000 1 P115 0,000 0,400 15 P215 0,000 0,700 15 P315 0,000 1,000 15 P415 0,025 0,400 15 P515 0,025 0,700 15 P615 0,025 1,000 15 P715 0,050 0,400 15 P815 0,050 0,700 15 P915 0,050 1,000 15 P130 0,000 0,400 30 P230 0,000 0,700 30 P330 0,000 1,000 30 P430 0,025 0,400 30 P530 0,025 0,700 30 P630 0,025 1,000 30 P730 0,050 0,400 30 P830 0,050 0,700 30 P930 0,050 1,000 30
Legenda: Cys = L-Cisteína; P80 = Polissorbato 80
Os géis foram obtidos pela metodologia descrita no item 4.2.1.2. Para cada formulação foram preparados 02 lotes de 125 g, que foram divididos em 05 potes de vidro transparentes, com 25g cada. Os vidros foram envolvidos por papel alumínio e fechados com Parafilm® e tampa própria. Imediatamente após o preparo todas as formulações foram levadas e preservadas sob refrigeração (5ºC±3) por todo o período do estudo para a manutenção das propriedades da papaína. A escolha da embalagem primária com uso de papel alumínio se justifica pela norma Q8 (R2) (ICH, 2009).
No estudo de estabilidade foram acrescentados dois valores de tempo intermediários, 7 (D7) e 23 dias (D23) além daqueles que seriam usados nas análises para o desenho experimental. Sendo assim foram considerados cinco tempos (D1; D7; D15; D23 e D30) para avaliação das características sensoriais, físico-químicas e químicas.
A avaliação do tempo zero é determinada após as primeiras 24 horas da incorporação da papaína e dos coadjuvantes ao gel (PINTO et al., 2011; CAPUCHO, 2007; MIURA, 2012), ou seja após o primeiro dia de armazenagem, o qual foi denominado de D1. Ressalta-se que as amostras foram envasadas em embalagem de vidro envolta de papal alumínio, vedada, tampadas e acondicionadas sob refrigeração (5ºC±3) imediatamente após sua manipulação.
Características sensoriais
As características sensoriais foram avaliadas em três propriedades: cor, odor e aspecto. Estes mesmos parâmetros foram descritos por Pinto (2005) e por Miura (2012) e estão descritos na Tabela 8. As avaliações foram feitas pelo mesmo operador.
Tabela 8: Parâmetros avaliativos das características sensoriais das preparações
Cor
A Amarelado
A+ Amarelado pronunciado
A++ Amarelado ainda mais pronunciado (palha)
Odor
C Característico da papaína e do polissorbato 80 LM
Levemente modificado, um leve aumento dos odores característicos da papaína e do polissorbato 80, indicam possível inicio da degradação dos
componentes.
M Modificado, odor característico da degradação da papaína.
Aspecto
Ho Homogêneo
Avaliação de pH
A medição do pH foi realizada a partir de potenciometria, onde o pHmetro foi ligado e deixado estabilizar em temperatura ambiente, e calibrado com as soluções tampão de pH 7,00 e 4,00. Procedeu-se a limpeza do eletrodo com água purificada e secagem com papel absorvente, para a calibração de dois pontos, introduziu o eletrodo na solução tampão de pH 7,00, e após em solução padrão pH 4,00. Sempre limpando com água purificada e secando com papel absorvente entre uma solução e outra.
As amostras foram retiradas do acondicionamento refrigerado e a análise procedida após alcançarem a temperatura ambiente. A medida foi feita pela imersão o eletrodo nas formulações, aguardando até a estabilização do valor para registrar a leitura. A cada amostra foi procedida a limpeza da sonda com água purificada e a secagem com papel absorvente.
O pH foi medido em pHmetro (PHTEK – PHS-3B – PH Meter Model) localizado no laboratório de Análise Farmacêutica e Controle de Qualidade, da Faculdade de Farmácia da UFF.
Comportamento Reológico
As medidas reológicas das diferentes amostras descritas no item 4.2.3 foram realizadas em temperatura ambiente com o emprego do Reômetro Rotacional Rotovisco – Haake RV 2, de cilindros concêntricos, localizado no Laboratório de Termodinâmica e Reologia, no Instituto de Química da UFF.
O sistema de cilindros concêntricos ou co-axiais é munido de dois cilindros de diâmetros diferentes, sendo o externamente estacionário e o interno rotacional. A amostra foi colocada entre estes dois e sofre cisalhamento do cilindro interno (ou spindle).
A amostra foi colocada conforme indicado na Figura 11, a velocidade de rotação foi crescente de 0,1 a 512 RPM. E o spindle utilizado foi SV II. A partir dessas velocidades e seus resultados pode-se obter os valores de Taxa de Cisalhamento (γ), Tensão de Cisalhamento (τ) e Viscosidade Absoluta (η).
Figura 11: Desenho esquemático do reômetro rotacional de cilindros concêntricos. (Adaptado TREVISAN (2011)).
Avaliação do potencial zeta
Avaliação do potencial zeta das diferentes amostras descritas na Tabela 7 (página 54) foi executada conforme descrito anteriormente (item 4.2.1.2, página 52) em subitem da determinação da CMC de géis de papaína 4,0% (p/p) com tensoativo.
. Amostra Cilindro Rotatório Cilindro Estacionário Sensor de Torque Motor Obtenção dos Resultados
Determinação da concentração de papaína ativa pela avaliação da atividade proteolítica em géis de papaína a 4,0% (p/p)
Em 1977, Kanaoka descreveram o uso de reagentes orgânicos, derivados amino cumarínicos (MCA), com capacidade fluorescente. Neste estudo eles observaram reações de hidrólise com o substrato benzoil-L-arginina-4-metilcumarina-7-amina dando origem ao produto 7-amino-4-metilcumarina. A linearidade da fluorescência em relação ao tempo de incubação é proporcional a concentração das enzimas, seja tripsina ou papaína, pois estas agirão como catalisadoras da reação de hidrólise. A reação pode ser observada na Figura 12. Os autores ainda apresentam este método como sendo 100 vezes mais sensível quando comparado com a do substrato cromogênico benzoil-L-arginina-ρ-nitroanilida. (KANAOKA, 1977)
Figura 12: Reação de fluorescência catalisada pela papaína (Adaptado Kanaoka (1977)). Legenda: 1) n-Benzoil-L- arginina-4-metilcumarina-7-amida (BZ-L-Arg-MCA)
2) 7-amino-4-metilcumarina
Desta forma, para a quantificação da atividade da papaína foi utilizado o cloridrato de carbobenzoxi-L-fenilalanil-L-arginina 4-metilcumarina-7-amido (N-CBZ-PHE-ARG-7- MCA). Esta substância terá sua hidrólise catalisada pela papaína liberando o produto fluorescente, 4-metilcumarina-7-amido, o qual é detectável mesmo em baixas concentrações. Empregaram-se os filtros de excitação de 360 nm e emissão de 460 nm, enquanto o ganho foi programado para 1500.
Para medir a atividade proteolítica da papaína, mesmo quando incorporada em formulações, foi utilizada a espectrofluorimetria por método de microplacas. Uma metodologia descrita por Kanaoka et al. (1977), e validada por Miura (2012).
O ensaio foi realizado em Espectrofluorímetro de microplacas de 96 poços (Fluorímetro – FLUOstar OPTIMA), locado na Central Analítica do Programa de Pós- Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade de Farmácia da UFF.
Foram utilizadas as seguintes soluções:
a) Solução tampão de fosfato-cisteína-EDTA
Em balão volumétrico de 500 mL colocou-se 3,55 g de fosfato de sódio dibásico anidro os quais foram dissolvidos em 400 mL de água ultra-pura. Adicionou-se 7,00 g de EDTA dissódico e 2,74 g de cloridrato de cisteína anidro, e então se completou o volume com água ultra-pura e agitou-se até total dissolução. O pH foi adequado para 6,0 (± 0,1) com solução de hidróxido de sódio 10% (p/p).
b) Solução do substrato N-CBZ-PHE-ARG-7-MCA
Em frasco de vidro âmbar pesa-se exatamente 25 mg do substrato N-CBZ-PHE- ARG-7-MCA os quais foram solubilizados em 38 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Uma alíquota de 400 µL desta solução foi transferida para um balão volumétrico de 25 mL. O qual teve seu volume completado com solução tampão e homogeneizado sob agitação.
c) Solução de ácido acético 30% (v/v)
Para um balão volumétrico de 100 mL foi transferido 30 mL de ácido acético glacial e o seu volume foi completado com água purificada, após foi homogeneizado sob agitação.
Em cada poço da microplaca, adicionaram-se:
• 55 µ L da solução tampão,
• 125 µ L da solução do substrato,
• 20 µ L de papaína (gel de papaína ou padrão de papaína) e
• 40 µL de solução de ácido acético 30% (v/v), com o objetivo interromper a reação de hidrólise.
As soluções, bem como a placa, foram mantidas em banho de gelo, durante todo o tempo de preparo da microplaca. Posteriormente a placa foi colocada no aparelho de fluorimetria e incubada a 40ºC por 45 minutos. A cada 15 minutos a reação foi interrompida com a adição da solução de ácido acético 30% (v/v), iniciando no tempo zero e terminando em 45 minutos. O experimento foi realizado em triplicata.
O esquema da microplaca está representado na Figura 13. Os poços em cor cinza representam a análise de uma amostra: as quatro linhas (A, B, C, D) são referentes ao tempo de reação (0, 15, 30 e 45 minutos) e as três colunas, às repetições (triplicata).
Figura 13: Esquema da microplaca de 96 poços para análise de uma amostra.
Gráficos com os valores de fluorescência médio em função do tempo de reação foram confeccionados, obtendo-se assim a velocidade da reação (aumento da fluorescência por minuto), uma vez que há relação entre o aumento da velocidade de fluorescência em função da concentração de papaína.
Curva de Calibração
Para a construção da curva de calibração foram pesados exatamente 25 mg de papaína padrão secundário 30.000 USP-U/MG, os quais foram transferidos para balão volumétrico de 250 mL. O volume foi completado com solução tampão fosfato de cisteína- EDTA (conforme 4.2.3.1.5 item a) sob agitação e procedeu-se a homogeneização.
Desta solução, foram transferidas alíquotas de 180 µL, 300 µ L, 600 µ L, 1200 µ L e 1500 µL para 05 balões volumétricos de 100 mL e seus volumes foram completados com solução tampão fosfato de cisteína-EDTA e homogeneizados. As soluções foram avaliadas conforme procedimento descrito anteriormente no item 4.2.3.5. A partir das diluições supracitadas, em cada poço da microplaca, foram obtidas as concentrações finais de: 0,45; 0,75; 1,50; 3,00 e 3,75 USP-U/mL, respectivamente.