UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA A SAÚDE
CAROLINE DECKMANN NICOLETTI
DESENVOLVIMENTO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4,0% (p/p) COM POLISSORBATO 80 COMO AGENTE SOLUBILIZANTE
NITERÓI 2015
CAROLINE DECKMANN NICOLETTI
DESENVOLVIMENTO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4,0% (p/p) COM POLISSORBATO 80 COMO AGENTE SOLUBILIZANTE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produto para a Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde.
Campo de Confluência: Tecnologia Farmacêutica.
Orientadora:
Prof.a Dr.ª Débora Omena Futuro Co-Orientador:
Prof. Dr. Raphael Cruz
Niterói, RJ 2015
N 643 Nicoletti, Caroline Deckmann
Desenvolvimento de géis de papaína a 4,0% (p/p) com
polissorbato 80 como agente solubilizante/ Caroline
Deckmann Nicoletti; orientadora: Débora Omena Futuro. –
Niterói, 2015.
113f.
Dissertação
(Mestrado)
–
Universidade
Federal
Fluminense, 2015.
1. Géis 2. Papaína 3. Concentração Micelar Crítica 4.
Cicatrização de feridas I. Futuro, Débora Omena II. Título
CAROLINE DECKMANN NICOLETTI
DESENVOLVIMENTO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4,0% (p/p) COM POLISSORBATO 80 COMO AGENTE SOLUBILIZANTE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produto para a Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde.
Campo de Confluência: Tecnologia Farmacêutica.
Aprovada em 31 de março de 2015.
BANCA EXAMINADORA
Prof.a Dr.ª Débora Omena Futuro – UFF Orientadora
Dr.ª Alessandra Lifsitch Viçosa - Farmanguinhos – FIOCRUZ
Dr.ª Zaida Maria Faria de Freitas - Faculdade de Farmácia - UFRJ
Niterói 2015
DEDICATÓRIA
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Prof.ª Dr.ª Débora Omena Futuro pela amizade, por ter aceitado o desafio, pela oportunidade, confiança e ensinamentos. Meu reconhecimento por termos feito essa caminhada juntas.
Ao professor Dr. Raphael Cruz pelo conhecimento na área da físico-química tão assombrosa para nós farmacêuticos.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde e seus docentes, o meu obrigado.
À CAPES pela bolsa de mestrado, possibilitando que eu me dedicasse exclusivamente a esse projeto.
Aos professores Dr.ª Deborah Quintanilha Falcão, Dr.ª Samanta Cardozo Mourão, Dr.ª Thelma Machado, Dr.ª Luciana Esper e Déo Anselmo Pinheiro por acompanharem o meu caminhar e contribuírem com incentivos e opiniões; bem como com a cedência de matérias-primas, materiais e instrumentos.
Às meninas da Central Analítica, em especial a Nelise, que me despertou e auxiliou a compreender a metodologia tão complexa.
A Dy que com amor e dedicação tem sempre um repositor de energias, principalmente para as horas difíceis. A Ju, com seu sorriso contagiante torna o dia sempre melhor.
Aos amigos e colegas de laboratório, Mariana, Vitor, Marcielle (minha cumadre), Letícia, Alessandra, Hingrid, Kessiane, Rafael, Anne, Daniele, Lorena, Patricia Alice, Juliana, Ana Carolina, que estiveram comigo tornando os momentos no laboratório mais agradáveis e produtivos.
À Patricia, minha irmã da UFF, que me apoiou, deu força, sendo um exemplo de companheirismos nas boas e más horas. As horas de laboratório foram muito mais fáceis ao
seu lado. Impossível esquecer o dia em que fiz a primeira placa de atividade proteolítica, você estava lá e segurou minha mão, literalmente.
À amiga Sandra, que aceitou o desafio de me ensinar a língua inglesa, tão assustadora para mim. Somente com os seus ensinamentos foi possível iniciar essa jornada.
À minha família, que mesmo de longe, me apoiou e acreditou em mim.
É preciso que eu suporte duas ou três larvas se quiser conhecer as borboletas.
RESUMO
NICOLETTI, C.D. Desenvolvimento de géis de papaína a 4,0% (p/p) com polissorbato 80
como agente solubilizante. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em
Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense, 2015.
A papaína é uma enzima proteolítica utilizada no tratamento de feridas. É parcialmente solúvel em água e tem baixa estabilidade em preparações farmacêuticas, dessa forma os géis com concentrações de papaína acima de 1% podem apresentar precipitados. O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de géis de papaína a 4% (p/p) usando tensoativos como agente solubilizante. Como fase inicial do estudo realizou-se a determinação da Concentração Micelar Crítica (CMC) por meio da medida de tensão superficial de geis de papaína a 4,0% (p/p) com e sem L-cisteína e diferentes concentrações de polissorbato 80. Novas preparações foram desenvolvidas usando-se concentrações de polissorbato e L-cisteína que resultavam na completa solubilização da papaína. O estudo de estabilidade dos géis de papaína a 4,0% (p/p) com polissorbato 80 foi planejado e executado a partir de desenho experimental fatorial 33 em amostras armazenadas sob refrigeração por 30 dias. As variáveis independentes estipuladas foram concentração de L-cisteína, concentração de polissorbato 80 e o tempo de armazenagem; a variável dependente avaliada foi a concentração de papaína ativa. Todas as amostras foram analisadas quanto à manutenção das características sensoriais e físico-químicas. Durante o período de avaliação as preparações conservaram-se como géis homogêneos, mantendo-se estáveis quanto aos valores de pH, de viscosidade e de estabilidade termodinâmica. Estas amostras não apresentaram mudanças no seu comportamento reológico. As preparações estudas apresentaram concentrações de papaína ativa entre 90 e 110% apos 24 horas de preparo, mas não foi possível a manutenção desta atividade durante o período de estudo. As avaliações estatísticas decorrentes do desenho experimental fatorial resultaram em gráficos de superfície de resposta e de contorno, que demonstraram que o tempo é o fator de maior influência sobre a perda da atividade da papaína nas preparações em gel. A L-cisteína interfere favoravelmente para a manutenção da atividade, mas sua ação isolada é incapaz de sobrepor-se ao efeito do tempo. A associação da L-cisteína e do polissorbato 80 também apresenta ação favorável a manutenção da atividade enzimática, que se torna evidente somente nas maiores concentrações estudadas para estes adjuvantes.
Palavras-chave: Papaína; Concentração Micelar Crítica; Atividade proteolítica; Desenho
ABSTRACT
NICOLETTI, C.D. Development of papain gels at 4.0% (w/w) with polysorbate-80 as
solubilizing agent. Dissertation (Master’s degree). Programa de Pós-Graduação em Ciências
Aplicadas a Produtos para a Saúde, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense, 2015.
Papain is a proteolytic enzyme used in the treatment of wounds. It is partially soluble in water and has low stability in pharmaceutical preparations thus gels with papain above 1% concentration may have precipitated. This study aimed to the development of papain gels at 4% (w / w) using surfactants as solubilizing agent. As the initial phase of study was carried out to determine the critical micellar concentration (CMC) by action of surface tension of papain gels at 4.0% (w / w) with and without L-cysteine and different concentrations of polysorbate 80. New preparations were developed using concentrations of polysorbate and L-cysteine resulted in complete solubilization of papain. The stability study of papain gels at 4.0% (w / w) polysorbate 80 was planned and carried out from 33 factorial experimental design for samples stored under refrigeration for 30 days. The independent variables were prescribed concentration of L-cysteine, concentration of polysorbate 80 and the storage time; the evaluated dependent variable was the concentration of active papain. All samples were analyzed for the maintenance of sensorial and physicochemical characteristics. During the evaluation period preparations presented as homogeneous gels, remaining stable as the pH, viscosity and thermodynamic stability. These samples showed no changes in their rheological behavior. The preparations studied showed ative papain concentrations between 90 and 110% after 24 hours of preparation, but it was not possible to maintain this activity over the study period. The statistical evaluations resulting from the factorial experimental design resulted in response surface graphs and contour, showing that time is the most influential factor on the loss of papain activity in preparations gel. L-cysteine favorably affects the maintenance of the activity, but its action alone is unable to override the effect of the time. The combination of L-cysteine and polysorbate 80 also presents favorable action to maintain the enzyme activity, which becomes evident only at the highest concentrations investigated for these adjuvants.
Keywords: Papain; Critical Micelle Concentration; Proteolytic activity; Factorial
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Estrutura geral dos polímeros de carboxivinil ... 21
Figura 2: Estrutura tridimensional da papaína, onde os dois domínios da cadeia principal estão representados em verde e o sítio catalítico, em azul... 23
Figura 3: Representação das forças atrativas na superfície a no meio do líquido. ... 33
Figura 4: Tensão superficial de solução de tensoativo x concentração, com formação de micelas. ... 34
Figura 5: Mecanismos de estabilização de proteínas por surfactantes, que podem (a) posicionar-se na interface e evitar a adsorção de proteínas, ou (b) se associam com as proteínas e preferencialmente, assim, evitar a aproximação e agregação. ... 37
Quadro 1: Quadro das 5 regiões de intereações proteína-tensoativo e interface...38
Figura 6: Estrutura química geral dos polissorbatos. O alifático (hidrofóbico) caudas de polissorbato 20 e 80 pode variar em comprimento e grau de insaturação, enquanto que o teor de óxido de polietileno (PEO) mantém-se constante... 39
Figura 7: Representação esquemática das alterações microscópicas de volume causada por processo de associação de um surfactante não iônico a géis de carbômero.. ...43
Figura 8: Etapas da associação do tensoativo ao polímero; A) a concentração do tensoativo esta superior a concentração de agregação crítica (CAC) e dá-se inicio a associação entre os dois componentes; B) a concentração do tensoativo esta acima do ponto de saturação do polímero (PSP)... ... 43
Figura 9: Tensiômetro com indicativo dos acessórios básicos... 50
Figura 10: Cubetas para análise de potencial zeta em aparelho Zetasizer® Nanoseries – Nano ZS90 – Malvern Instruments ... 52
Figura 11: Desenho esquemático do reômetro rotacional de cilindros concêntricos. ...57
Figura 12: Reação de fluorescência catalisada pela papaína. ... 58
Figura 13: Esquema da microplaca de 96 poços para análise de uma amostra. ... 60
Figura 14: Gráfico da Tensão Superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série com cisteína ... 65
Figura 15: Representação gráfica do cálculo das equações de reta usadas para o estabelecimento da CMC no gráfico de tensão superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série com cisteína... 66
Figura 16: Gráfico da Tensão Superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série sem cisteína ... 67 Figura 17: Representação gráfica do calculo das equações de reta usadas para o estabelecimento da CMC no gráfico de tensão superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série sem cisteína ... 68 Figura 18: Desenho esquemático da dupla camada elétrica, segundo o modelo de Stern, das cargas presentes na superfície da partícula que fornecerão valores de potencial zeta. ... 71 Figura 19: Gráfico de Potencial Zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série com cisteína 73 Figura 20: Gráfico de Potencial Zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série sem cisteína. 73 Figura 21: Diapositivos de amostras dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1 ... 76 Figura 22: Gráfico logarítmico da viscosidade absoluta x taxa de cisalhamento de géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1... 78 Figura 23: Histograma dos valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1 ... 81 Figura 24: Curva de Calibração da papaína 30.000 USP-U/mg...82 Figura 25: Concentração de papaína ativa dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D184 Figura 26: Diapositivos de amostras dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias (continua)... 85 Figura 27: Gráfico logarítmico da viscosidade absoluta em função da taxa de cisalhamento dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em D1 ... 89 Figura 28: Gráfico logarítmico da viscosidade absoluta em função da taxa de cisalhamento dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em D7 ... 89 Figura 29: Gráfico logarítmico da viscosidade absoluta em função da taxa de cisalhamento dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em D15 ... 90 Figura 30: Gráfico logarítmico da viscosidade absoluta em função da taxa de cisalhamento dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em D23 ... 90 Figura 31: Gráfico logarítmico da viscosidade absoluta em função da taxa de cisalhamento dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em D30 ... 90 Figura 32: Histograma dos valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias... 92 Figura 33: Histograma dos valores da concentração de papaína ativa dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias ...96 Figura 34: Taxa de redução percentual da atividade proteolítica em 30 dias... 97 Figura 35: Histograma de resíduos brutos pelo modelo ... 98
Figura 36: Histograma de valores preditos pelo modelo ...98 Figura 37: Gráfico de valores preditos por valores observados ... 99 Figura 38: Gráfico normal probabilístico dos resíduos brutos ... 99 Figura 39: Gráfico dos resíduos brutos x resíduos estimados segundo Student suprimidos .... 99 Figura 40: Diagrama de Pareto dos efeitos padronizados. ... 101 Figura 41: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da papaína ativa em função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80, fixando o Tempo em D1 ... 101 Figura 42: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da papaína ativa em função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80 fixando o Tempo em D7 ... 102 Figura 43: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da papaína ativa em função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80 fixando o Tempo em D15 ... 102 Figura 44: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da papaína ativa em função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80 fixando o Tempo em D23 ... 102 Figura 45: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da papaína ativa em função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80 fixando o Tempo em D30 ... 103
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Propriedades físicas da papaína. ... 24
Tabela 2: Uso x Concentração dos polissorbatos ... 40
Tabela 3: Características físicas e toxicidades dos Polissorbatos... 41
Tabela 4: Formulação do gel base de Carbômero 940. ... 48
Tabela 5A: Formulações da série de géis de papaína com L-cisteína ... 49
Tabela 5B: Formulações da série de géis de papaína sem L-cisteína... 49
Tabela 6: Desenho experimental fatorial... 53
Tabela 7: Formulações para o estudo obtidas a partir de desenho experimental fatorial 33... 54
Tabela 8: Parâmetros avaliativos das características sensoriais das preparações... 55
Tabela 9: Valores de tensão superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série com cisteína. ... 65
Tabela 10: Valores de tensão superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série de preparações sem cisteína. ... 67
Tabela 11: Valores de pH dos géis de papaína a 4,0% (p/p) das duas séries de preparações. . 70
Tabela 12: Valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p) das duas séries de preparações. ... 72
Tabela 13: Valores de L-cisteína e Polissorbato 80 nas formulações de géis de papaína a 4,0% (p/p)...74
Tabela 14: Características sensoriais dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1 ... 75
Tabela 15: Valores de pH dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1 ... 77
Tabela 16: Valores de Viscosidade Absoluta em função da velocidade e taxa de cisalhamento dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1 ... 79
Tabela 17: Valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1... 80
Tabela 18: Resultados experimentais obtidos na curva de calibração da papaína padrão secundários 30.000 USP-U/MG. ... 82
Tabela 19: Valores de unidade de fluorescência e concentração de papaína ativa dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1... 83
Tabela 20: Avaliação das características sensoriais das amostras dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias... 87
Tabela 21: Valores de pH e seus percentuais de variação dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias... 88
Tabela 22: Valores logarítmicos da viscosidade absoluta na velocidade de 0,4 RPM dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias... 91 Tabela 23: Valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias ..92 Tabela 24: Resultados do tratamento de médias para avaliação de significância (teste de Tukey) para valores de potencial zeta das amostras individuais no decorrer dos 5 tempos para cada amostra .... 93 Tabela 25: Valores de unidade de fluorescência por minuto para os géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 nos cinco tempos de análise... 94 Tabela 26: Valores de concentração absoluta e de concentração percentual de papaína ativa dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias ... 95 Tabela 27: Valores da taxa de redução percentual de papaína ativa (TRP) dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias... 97 Tabela 28: Estimativa de efeito para a concentração de papaína ativa ... 100
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO... 16 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 18 2.1 CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS ... 18 2.2 SISTEMAS COLOIDAIS ... 20 2.3 PAPAÍNA... 22 2.42.4 SOLUBILIDADE DE SUBSTÂNCIAS...28 2.4.1 ESTRATÉGIAS DE SOLUBILIZAÇÃO ... 29 2.4.2 TENSOATIVOS... 31 2.4.3 COMPLEXOS PROTEÍNA-TENSOATIVOS ... 36 2.4.4 POLISSORBATOS ... 39 3. OBJETIVO... 45 3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 45 4. MATERIAIS E MÉTODOS... 46 4.1 MATERIAIS ... 46 4.2 MÉTODOS... 47
4.2.1. DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4% (P/P) UTILIZANDO TENSOATIVO COMO AGENTE SOLUBILIZANTE ... 47
4.2.2 CARACTERIZAÇÃO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4% (P/P) UTILIZANDO TENSOATIVO COMO AGENTE SOLUBILIZANTE... 53
4.2.3 ESTUDO DE ESTABILIDADE DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4% (P/P)... 61
4.2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 62
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 64
5.1 DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4% (P/P) UTILIZANDO TENSOATIVO COMO AGENTE SOLUBILIZANTE. ... 64
5.1.1 CONCENTRAÇÃO MICELAR CRÍTICA DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4,0% (P/P) COM TENSOATIVO... 65
5.2 CARACTERIZAÇÃO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4% (P/P) UTILIZANDO TENSOATIVO COMO AGENTE SOLUBILIZANTE... 74
5.2.1 CARACTERIZAÇÃO DOS GÉIS DE PAPAÍNA A 4,0% (P/P) EM D1... 75
5.2.2 ESTUDO DE ESTABILIDADE DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4,0 % (P/P)... 85
5.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 98
6. CONCLUSÕES...104
1. INTRODUÇÃO
A pele é o maior órgão do corpo humano representando 15% do peso corpóreo. Tem como função primordial proteger o corpo contra ações químicas e físicas além de prevenir a perda de água e de outras substâncias pelo corpo. Divide-se em três camadas, a epiderme, derme e hipoderme (AZULAY, 2008; CAMARGO, 2006). A interrupção do tecido corpóreo decorrente de algum trauma, seja ele químico ou mecânico, que venha a comprometer a integridade anatômica da pele recebendo a denominação de ferida (AZULAY, 2008), e pode repercutir fisicamente, psicoemocionalmente e socialmente em seus portadores (MACIEL, 2008; SILVA, 2003). Doenças crônicas, especialmente as cardiovasculares e o diabetes estão relacionadas ao desenvolvimento de feridas, úlceras arteriais, úlceras diabéticas, úlceras venosas, úlceras por pressão, dentre outras (MACIEL, 2008).
A utilização da papaína no tratamento de feridas tem sido amplamente estudada quanto à sua ação, sendo estabelecidos protocolos para sua utilização em diversos tipos de lesões, como as supras citadas. Ela se destaca como uma ótima alternativa para o tratamento de feridas, pois se trata de uma enzima proteolítica de origem vegetal, extraída do látex do fruto verde de Carica papaya, apresentando-se ao mercado com baixo custo, podendo ser usada em pacientes e feridas diversas, além da ausência de efeitos colaterais (VELASCO, 1993; SANCHEZ, 1991; FERREIRA, et al 2008; SILVA, 2003; HAX, 2009). Os únicos efeitos adversos relatados estão relacionados à pacientes que apresentam sensibilidade ao látex do mamão, que poderão apresentar sensibilidade à papaína também (PIEPER; CALIRI, 2003).
Apesar do potencial das enzimas para o uso como ativos em cosméticos e medicamentos, a manutenção de sua estabilidade é problemática, já que a maior parte das enzimas, em temperatura ambiente, perde sua atividade biológica em aproximadamente um mês (YOUNG-CHU, 2000). Além disso, trata-se de uma molécula parcialmente solúvel em água e em preparações farmacêuticas, dessa forma os géis com concentrações de papaína acima de 1% podem apresentar precipitados (MIURA, 2012).
O presente projeto pretende avaliar a eficiência de adjuvantes técnicos à géis de papaína no intuito de ampliar a estabilidade desta enzima nas preparações, assim como melhorar a sua homogeneidade nas preparações.
No primeiro momento buscou-se alcançar a concentração de polissorbato 80 na qual os sistemas apresentar-se-iam homogêneos. De posse deste resultado desenhou-se um estudo experimental fatorial de 33, sendo as variáveis independentes a concentração dos adjuvantes (cisteína e polissorbato 80) e o tempo de armazenagem. As análises estatísticas dos resultados foram avaliadas a partir de gráficos de superfície de resposta e de contorno.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS
Ferida é a interrupção da continuidade de qualquer um dos tecidos corpóreos, tanto em maior quando em menor extensão, podendo ser locais ou sistêmicas. A lesão poderá ser causada por trauma físico, químico, mecânico ou fisiológico de defesa orgânica desencadeada por alguma afecção clínica (CESARETTI, 1998). As feridas também podem ser classificadas como agudas e crônicas, dependendo da natureza do processo de cicatrização (FERNANDES, 2012).
A cicatrização de feridas é iniciada imediatamente após a ocorrência da lesão. Trata-se de um processo dinâmico, contínuo e complexo, composto por diversos tipos de células (epiteliais, inflamatórias, plaquetas e fibroblastos) e fases sobrepostas (BLANES, 2004; CAMARGO, 2006; CESARETTI, 1998; DECLAIR, 2002; HAX, 2009). Morfologicamente, identificam-se três fases da cicatrização: inflamatória, proliferativa e de maturação (BLANES, 2004; CESARETTI, 1998; HAX, 2009), porém não se aterá a nenhuma dessas fases, mas sim a cicatrização em si. Há a dependência de vários fatores para que ocorra a cicatrização, dentre locais e gerais destaca-se: localização anatômica, tipo de pele e raça (CAMARGO, 2006).
O tratamento de feridas vem sendo alvo de muitos estudos, englobando conhecimentos relacionados aos tipos de lesões, processo de reparação do tecido lesado e demais fatores das etapas de cicatrização. O conhecimento adquiridos tem resultando no desenvolvimento de novas estratégias para seu tratamento (PEREIRA; BACHION, 2005). Existe hoje mais de 2.500 dispositivos diferentes indicados ao tratamento de feridas agudas e crônicas (MANDELBAUM, 2003a).
Com avanços tecnológicos foram desenvolvidas de novas tecnologias terapêuticas para o tratamento de feridas, entre elas: cultura de tecidos e transplante de fibroblastos (Hyalograf 3D), terapia por vácuo e câmaras hiperbáricas, moldes de contato total, tratamentos fisioterápicos: massagem, eletroterapia, ultra-som, termoterapia, laser de baixa potência, oxigenoterapia hiperbárica, silicones (placas e tiras), modulação e terapia genética,
albumina, ácido hialurônico, derivado do intestino de porco entre outras tecnologias de ponta. Elas são, normalmente, de alto custo e não estão acessíveis à grande parte da população. Sendo assim, o terapia tópica continua sendo a prática eleita dentre os médicos (MANDELBAUM, 2003b, ROL et al. 2005).
As formas farmacêuticas de uso tópico, ungüentos, géis, cremes ou pastas, formados por uma base semi-sólida hidrofílica ou hidrofóbica onde será incorporado o fármaco são estratégias viáveis a todos os pacientes (AULTON, 2005).
É preciso favorecer as condições locais por meio da terapia tópica para viabilizar o processo fisiológico de cicatrização. Pode-se definir terapia tópica como o conjunto de condutas que visam à cura precoce das feridas, compreendendo a limpeza, o desbridamento e a cobertura (BLANES, 2004; GOMES; CARVALHO, 2002).
A limpeza da ferida deve ser feita com uso de técnica e fluido de modo que minimize o trauma físico e químico. As soluções utilizadas variam, podendo ser água e/ou soluções fisiológicas. O desbridamento é o processo de retirada do tecido desvitalizado ou necrótico, visando a limpeza, deixando o local da ferida apto para que ocorra a cicatrização (SANTOS, 2000).
Mandelbaum, (2003b) fez uma revisão dos principais recursos disponíveis no Brasil, ácidos graxos essenciais (AGE); alginato de cálcio; anti-sépticos e degermantes; bandagens para a compressão; carvão ativado e prata; sulfadiazina de prata; filmes semipermeáveis; colágeno biológico e enzimas combinadas; fatores de crescimento celular; acetato de celulose e outras membranas permeáveis ao vapor; protetores cutâneos; hidropolímeros; hidrogéis; hidrocolóides e enzimas proteolíticas, entre outros de menor relevância.
O hidrocolóides, hidropolímeros e hidrogéis foram lançados no Brasil na década de 90, somado a propriedade umidificante, eles permitem a evaporação do exsudato, o que promove a granulação e diminuição da compressão dos tecidos recém formados (MANDELBAUM, 2003a).
A umidade e o aquecimento propiciam a cicatrização tecidual (BOATENG et al., 2008). Além disso, tal ambiente impede danos teciduais por ressecamento, promove a atividade de enzimas líticas, que retiram debris residuais no início da cicatrização. Com a
oclusão aumenta a taxa de epidelização e a baixa da pressão inicial de oxigênio, que irá promover a fase inflamatória cicatricial (FERNANDES, 2012)
2.2 SISTEMAS COLOIDAIS
Sistemas coloidais apresentam um componente disperso no seio de outro, são caracterizados pela presença de partículas compreendidas entre 0,001 e 0,1 µm, ou seja, partículas maiores do que as soluções verdadeiras mas menores que às das suspensões. As dispersões coloidais que tem a fase externa um líquido serão chamadas de sóis e classificados em liófobos, quando a viscosidade e tensão superficial não são modificadas quando é efetuada a mistura, e liófilos quando as partículas serão impregnadas pelo dissolvente, comportando-se como se fossem líquidas (PRISTA et al., 1995; AULTON, 2005; SINKO, 2008; VILLANOVA, ORÉFICE, CUNHA, 2010).
Os soles liófilos poderão ser constituídos por produtos naturais ou sintéticos (como os carbômeros, por exemplo) de elevado peso molecular que se encontram distribuídos e intumescidos por completo em um meio contínuo líquido formando um semi-sólido denominado de gel ou hidrogel. A denominação de hidrogel é usada quando o meio dispersante for água, logo o colóide hidratar-se-á. Assim, o produto final terá maior viscosidade que o líquido inicial (FERREIRA, 2005; SINKO, 2008).
Os géis possuem características térmicas e mecânicas que pode ser avaliada por métodos simples. Muitos géis apresentam histerese diante de aquecimento e em geral não possuem temperatura específica de gelificação (KAMERZELL et al., 2011). Além disso, apresenta uma grande superfície específica, o que resulta em propriedades singulares (SINKO, 2008).
Os hidrogéis naturais e sintéticos são empregados na cura de feridas, como suportes para a engenharia dos tecidos e em sistemas de liberação sustentada. Sua utilização em feridas se mostra vantajosa ao manter o ambiente úmido, condição esta fundamental para a absorção, assepsia e desbridamento de tecidos necrosados e fibróticos, favorecendo a atividade
enzimática e patrocinando o processo de cicatrização. Além disso, o gel não excede os limites da lesão se distribuindo prontamente, além da fácil remoção (GOULART, 2006).
Uma alternativa para preparações de uso tópico contendo papaína trata-se de uma formulação de gel que segundo a Farmacopéia Brasileira (BRASIL, 2010) trata-se de uma dispersão coloidal basicamente hidrofílica, onde se empregam polímeros inertes estáveis quimicamente e fisicamente (EXCIPIENTES, 1998). Graças à pequena afinidade pelo sebo cutâneo, o gel tem pequena penetração, desta forma desenvolve uma película sobre a pele de ativo a partir da evaporação da água (MOSQUETA, 1996).
2.3.1 Carbômeros
Os polímeros sintéticos de alto peso molecular de acido acrílico são usados como agentes emulsionante, geleificantes, suspensores ou aglutinantes em comprimidos de liberação controlada (FERREIRA, 2008, KOLENG, McGINITY, 2006; PRISTA et al., 1995). Os carbômeros são sintetizados a partir do ácido acrílico combinado, fazendo ligações cruzadas, com alilsacarose ou ali-éteres de pentaeritrol (Figura 1) (AULTON, 2005; FERREIRA, 2008).
Figura 1: Estrutura geral dos polímeros de carboxivinil (KOLENG, McGINITY, 2006; PRISTA, 1995).
Ao incorporar o polímero em água, obtêm-se molécula enovelada com baixa capacidade espessante devido a faixa de pH ácida (2,8 e 3,2). Para obter-se viscosidade e transparência é necessário elevá-lo ao uma faixa de pH de 4,5 a 11. A neutralização dos grupos carboxilas do carbômero permite o alongamento de sua molécula e assim a formação de uma matriz coloidal. A neutralização poderá ser alcançada lançando mão de bases
inorgânicas como hidróxido de sódio (KOLENG, McGINITY, 2006) ou amônio, e bases orgânicas como trietananolamina e aminometilpropanol (AMP-95). A estabilidade do gel é obtida na faixa de pH de 6,0 a 11,0, sendo o máximo da viscosidade alcançada em pH 7,0 (FERREIRA, 2008).
Comercialmente os carbômeros recebem várias denominações como Acrypol; Acritamer, sendo a mais conhecida Carbopol®. Segundo Ferreira (2008), a observação da letra P após a designação do número, determina a presença de resíduo de benzeno inferior a 0,1%, logo, o Carbopol 934P, poderá ser usado em formulações tanto de uso interno quanto externo. Porém Koleng e McGinity, (2006) relata que para PhEur 2005 apenas aceita-se os polímeros com a denominação 971P ou 974P para uso interno.
Pinto (2011), em estudo recente, sugere que a presença de polímeros pode aumentar a estabilidade da emulsão, uma vez que promove a redução da velocidade de separação de fases.
2.3 PAPAÍNA
A papaína é uma enzima de origem vegetal, isolada do látex das folhas e dos frutos verdes da espécie Carica papaya Linne. Amplamente utilizada na prática clínica como agente desbridante, apresenta também características bactericida/bacteriostática, anti-inflamatória e bioestimulante (CAPUCHO, 2007; MIURA, 2012).
A papaína é uma tiol proteinase, sendo sua molécula é constituída de uma exclusiva cadeia polipeptídica simples com 212 resíduos de aminoácidos (SANGEETHA; ABRAHAM, 2006).
A estrutura cristalina tridimensional de sua molécula indica que sua cadeia é dobrada em duas porções aparentes, porém com formações diferentes, de modo a formar uma abertura sobre a superfície enzimática onde se localiza seu sítio ativo, conforme Figura 2 (NAEEM; FATIMA; KHAN, 2006; CAPUCHO, 2007). Há resíduos de aminoácidos na posição 25 de cisteína (Cis 25), na 159 de histidina (His 159) e de asparagina na 175 (Asp 175), os quais localizam-se na superfície dessa abertura entre as duas porções da molécula. Para Sangeetha e
Abraham (2006) estes três aminoácidos representam o centro catalítico enzimático, enquanto que para Brockelehurst (1990) apenas Cis 25 e His 159 interagem para essa ação catalítica.
Figura 2: Estrutura tridimensional da papaína, onde os dois domínios da cadeia principal estão representados em verde e o sítio catalítico, em azul (CAPUCHO, 2007).
O grupo sulfidrílico encontra-se na posição Cis 25, os seis demais resíduos cisteína formam três ligações dissulfetos (SZABÓ et al., 2006). Logo sua estrutura é estabilizada por estas ligações dissulfeto, que ao serem destruídas acarretam na redução da atividade biológica, catalítica e imunológica da enzima (ZHUANG; BUTTERFIELD, 1991).
A estrutura química da papaína possui um radical sulfidrila (-SH) no seu sítio ativo, especificamente, no resíduo de cisteína, sendo fundamental que este grupo esteja livre para a ação de atividade enzimática, na sua forma reduzida. Pode-se, desse modo, adicionar agentes redutores tais como cisteína, sulfitos, ciamidas, cianeto de hidrogênio, glutationa reduzida e tioglicolato, porém é facilmente oxidado em soluções aquosas ou em contato com substâncias compostas por iodo, oxigênio e metais pesados como o ferro, ácidos concentrados e com o aumento de temperatura. Uma vez que esse radical é oxidado, a enzima perde sua atividade proteolítica e, com isso, a papaína perde suas propriedades (KIMMEL; SMITH, 1954; SMITH; KIMMEL; BROWN, 1954; ARNON, 1070; USP XXXI, 2008; CAPUCHO, 2007).
Devido a essas características, recomenda-se que o armazenamento dessa substância obedeça a condições específicas como abrigo da luz, umidade, oxigênio e calor. Como padrão para ativação do sítio enzimático e para proteção contra a sua inativação tem-se lançado mão de um meio contendo cisteína e EDTA (CAPUCHO, 2007; FERREIRA, 2005; MIURA, 2012; SILVA, 2003; USP XXXI, 2008). A maior estabilidade enzimática é conseguida na faixa de pH 5,0 a 7,0 (SIM et al., 2000).
As características físicas da papaína descritas na Tabela 1. Tabela 1. Propriedades físicas da papaína.
Propriedades físicas Características
Apresentação Pó amorfo de cor branca leitosa, com odor
forte e característico, similar ao enxofre.
Solubilidade Parcialmente solúvel em água e glicerol.
Insolúvel em álcool, éter e clorofórmio.
Massa molecular 23.406 Da
Dimensão aproximada 5,0 x 3,7 x 3,7 nm
Ponto isoelétrico pH 8,75
λmax 278 nm
Temperatura ótima para atividade enzimática 65ºC Faixa de pH ótimo para atividade enzimática 5,0 a 7,0 Faixa de pH da solução aquosa 2% 4,8 a 6,2
Fonte: ZULLI, 2007; MIURA, 2012.
O uso da papaína é indicado para todas as fases do processo de cicatrização, em feridas secas ou exsudativas, colonizadas ou infectadas, com ou sem necrose. Neste contexto a papaína promove o desbridamento químico, ativa o processo de regeneração tecidual e reduz o período de cicatrização, além de apresentar ação bactericida, bacteriostática e anti-inflamatória. Em estudo dirigido por Ferreira et al (2008) demonstrou-se que apenas o gel de papaína a 10% foi capaz de inibir o crescimento do S. aureus e de P. aeruginosas. Já em um estudo in vitro, com sementes do fruto de Carica papaya em diferentes graus de maturação, a papaína demonstrou atividade bacteriana (DAWKINS et al.; 2003).
A ação proteolítica da papaína é observada somente em tecidos inviáveis, não agredindo os tecidos sadios. Este fato deve-se à enzima alfa1-antitripsina, uma antiprotease plasmática, que evita a atividade enzimática, estando presente somente nas células sadias (FLINDT, 1978 apud ZULLI, 2007; FERREIRA, 2005). Além disso, no extrato córneo humano foi identificada uma nova protease, da família da papaína, denominada Stratum Corneum Cathepsin-L-like Protease (SCCL). Esta enzima tem efeito sobre a degradação das corneodemosinas (um dos constituintes dos corneodesmossomos), patrocinando o processo de descamação epidérmica (BERNARD et al., 2003). Este fato pode explicar o desbridamento promovido pela papaína.
Sua atividade proteolítica, nas concentrações de 0,1, 0,5 e 1,0% diminuiu a crosta da queimadura melhorando a cicatrização (RAKHIMOV, 2000). Esta enzima digere os restos teciduais e representantes insolúveis do exsudato inflamatório, como as fibrinas e material genético de células necróticas, transformando-os em peptídeos quimiotáticos para os fibroblastos, os quais irão excitar precocemente a fibroplastia/cicatrização (FERREIRA, et al 2008; MONETTA, 1987; SANCHEZ, 1991; VELASCO, 1993). Sua capacidade de degradação abrange proteínas que contenham em sua estrutura resíduos do aminoácido cisteína, como os fatores de crescimento. A exemplo disso há a não degradação do colágeno, uma vez que o mesmo não possui a cisteína em sua composição (FALANGA, 2002). Existe uma predisposição de clivagem de ligações peptídicas envolvendo aminoácidos básicos (CAPUCHO, 2007).
Na prática clínica são utilizadas as concentrações de 2% em feridas com tecido de granulação, 4% a 6%, em feridas com exsudato purulento, e 8 a 10% quando se observa a presença de tecido necrótico (HAX, 2009).
Capucho (2007) relata a aplicação da papaína nos mais diversos setores; na indústria alimentícia: na fabricação de queijos e biscoitos, amaciantes de carne e clarificantes de cervejas; na produção de detergentes (como promotor de limpeza por meio da degradação hidrolítica de proteínas encontradas em manchas de sangue, ovo, chocolate, entre outras); na indústria do couro, para remoção de pelos e amaciante do couro e na indústria cosmética no preparo de esfoliantes, devido seu poder debridante. Korolkovas (2006) cita a papaína como agente cáustico.
Além desses destacam-se o uso como agentes depilatórios (TRAVERSA, 2003), em "peeling" (SANTOS, 2001), como também se observa sua aplicação associada a alfa-hidroxiácidos e ao ácido salicílico em tratamentos de rejuvenescimento e ressecamento da pele (OZLEN, 1996).
Comercialmente, nos Estados Unidos, encontra-se o produto Panafil®, associação da papaína à uréia e à clorofila. Também se encontra o Accuzyme®, produto com papaína e uréia. Além desses encontra-se um produto de origem italiana o NouriFusion®, que associa a papaína com as vitaminas A, C e E. A uréia nesse tipo de formulação tem a função de auxiliar a ação proteolítica da papaína, ao clivar as ligações hidrogênio expondo os sítios ativos da papaína por ação solvente, alterando suas estruturas tridimensionais. A uréia também atua na
redução das pontes dissulfeto das proteínas e expõe os resíduos de cisteína, os quais são mais susceptíveis à ação enzimática. Essa associação, comparada à papaína isolada, demonstra o dobro da ação e efetividade na digestão de proteínas (MIURA, 2012; CAPUCHO, 2007; FALANGA, 2002). Ainda existe o produto odontológico para a remoção química do tecido cariado e infectado, preservando os tecidos saudáveis adjacentes aos dentes, o Papacárie® (SILVA, 2005). No auxilio na degradação das proteínas da dieta, encontramos o Filogaster®, que associa a papaína, a pancreatina e a diastase (DEF, 2002; WALSH, HEADON, 1994).
A papaína, no que tange ao tratamento de feridas, pode ser utilizada sob diversas formas farmacêuticas como solução aquosa, pó, gel e creme (FERREIRA, 2005).
As preparações de uso tópico com papaína são exclusivamente provenientes da farmácia magistral. Por não apresentar forma industrializada, não se encontram registros de estudos de estabilidade dessas formulações. As mesmas só passaram a fazer parte do Formulário Nacional em 2011 (BRASIL, 2011), e sua monografia não apresenta dados sobre a estabilidade das formulações, tornando impossível assegurar a eficácia e a segurança do medicamento durante o tempo de tratamento e/ou validade do produto.
Tem-se estudado novas formas farmacêuticas para veicular a papaína, de modo a aumentar sua estabilidade. Dentre as novas pesquisas há a tentativa de imobilizar a enzima com o objetivo de estabilizá-la.
Ruas e colaboradores (2006) desenvolveram uma matriz polimérica para obtenção de um adesivo de uso tópico com ação cicatrizante. Foram analisadas duas dispersões de silicone. Sendo que a primeira formulação, com monocomponente e sem irradiação, apresentou um melhor perfil de liberação, enquanto que a segunda, com bicomponente, o processo térmico alterou a atividade da enzima.
Zulli (2007) incorporou papaína em matrizes poliméricas, com a finalidade de obter um sistema de liberação controlada da enzima. Utilizou-se látex de borracha natural bicentrifugado (LBNB); adesivo acrílico (AA); dispersão de silicone monocomponente (SM) e dispersão de silicone bicomponente (SB). As membranas de dispersão de silicone mono (SM) e bicomponentes (SB) não apresentaram citotoxicidade. Nestas duas foram incorporados 2% de papaína e estas foram submetidas ao ensaio de liberação com células de difusão de
Franz. Este resultou em liberação constante da papaína nas 12 horas iniciais do ensaio, ocorrendo burst effect.
A formulação em gel de papaína pode perder a viscosidade, por conta de sua concentração. Contudo, não há relatos na literatura sobre a concentração máxima de papaína em gel que assegure a manutenção das características da formulação (FERREIRA, 2005; KISIDAY et al., 2002, apud SINKO, 2008).
Pinto (2011) relatou que géis formulados com hidroxietilcelulose não resistiram ao teste de estresse térmico e centrifugação, enquanto que, dentre as formulações que resistiram a estes testes, encontram-se formulações com carbômero. Inclusive a formulação que se associou hidroxietilcelulose a outros polímeros sintéticos tiveram piores desempenhos.
Capucho (2007) testou três diferentes formadores de matrizes poliméricas coloidais para incorporar a papaína, Pluronic® F127, Carbopol© 940 e Natrosol® 250 HHR sendo de Carbopol© 940 a mais eficaz para veicular a papaína.
Segundo Miura (2012) faz-se necessária a adequação da concentração do Carbômero® 940 em relação às concentrações de papaína e dos adjuvantes técnicos, para que o produto apresente a viscosidade adequada para o uso. Além disso, observou-se com o uso do EDTA dissódico uma influência positiva para a atividade proteolítica da papaína, porém sem manutenção prolongada.
Já o emprego de cisteína apresentou uma influência negativa quanto à manutenção da atividade proteolítica de papaína. A presença de propilenoglicol na formulação demonstrou não interferir nos resultados da atividade da enzima (MIURA, 2012). Enquanto que o relatado por
Sathish
, Kumar e Prakash (2007) foi o aumento da estabilidade da papaína com o uso de diversas substâncias polihidroxiladas. As avaliações das preparações por um período de 60 dias indicaram a manutenção estabilidade física das preparações, porém a perda da atividade proteolítica foi acentuada mesmo nas formulações armazenadas sob refrigeração (MIURA, 2012).Ainda considerando o estudo realizado por Miura (2012) os géis de papaína apresentaram ausência de cor e odor característico, porém tiveram um aspecto heterogêneo, caracterizado pela presença de precipitados brancos, atribuídos à papaína. A papaína apresenta pouca solubilidade em água (ARNON, 1970). Quantidades de papaína superiores a
concentração de 10 mg/mL tornam sua solubilidade no meio aquoso parcial (MIURA, 2012). Pinto (2005) descreve um gel de papaína homogêneo e transparente, durante sua avaliação de estabilidade. Toda via suas formulações estavam em concentrações não maiores de 0,8% de papaína, quantidade que atender a solubilidade referenciada anteriormente. Capucho (2007), em sua avaliação prévia de géis de diferentes polímeros com papaína, obteve formulações opacas e ligeiramente amareladas. Nestes mesmos estudos a concentração de papaína foi de 1%, e, ao considerar-se a quantidade total de água nas diferentes dispersões coloidais, observa-se que esta se encontra levemente acima da solubilidade da enzima. Diante disso, quando o objetivo é a obtenção de sistemas transparentes e homogêneos, a forma farmacêutica de gel apresenta limitações.
Para que substâncias pouco solúveis, como a papaína, sejam adicionadas a quaisquer veículos, incluindo géis de carbômero, deve-se previamente levigá-las com algum solvente (ou cossolventes) para favorecer a sua solubilização (FERREIRA, 2008).
2.4 SOLUBILIDADE DE SUBSTÂNCIAS
A solubilidade de uma substância em um solvente sempre será limitada, ou seja, para a formação de uma solução há a necessidade que os dois componentes (soluto e solvente) formem uma mistura homogênea. O componente que se encontram líquido e/ou na maior proporção será chamado de solvente (PRISTA, 1995).
Por sua vez, podemos observar, em sistemas homogêneos, as soluções ideais e as soluções reais. Na primeira, não há diferença entre as interações das moléculas do soluto com o solvente em comparação às interações entre as moléculas do soluto puro e do solvente puro. Porém para as soluções reais as interações soluto-solvente são muito diferentes das interações soluto-soluto e solvente-solvente (PRISTA, 1995).
Entre vários fatores, a solubilidade em água é de suma importância no desenvolvimento de uma formulação, para que sua dosagem no sítio alvo seja segura e eficaz. Esta propriedade tem influência na preparação, na absorção e até mesmo na atividade biológica de um fármaco. Todo o fármaco, para demonstrar seu efeito terapêutico, deve
possuir certa solubilidade em água (AULTON, 2005; RUCKENSTEIN, SHULGIN, 2003a e 2003b; MIRANDA, 2011). No entanto, vêem-se no mercado farmacêutico diversas moléculas lipofílicas já em uso ou com promissor potencial terapêuticos (CHAUD, 2010; MIRANDA, 2011).
2.4.1 Estratégias de Solubilização
Quando a solubilidade em água de uma substância é baixa, recorre-se a alguns artifícios. Dentre as abordagens para a solubilização de fármacos, as mais frequentemente utilizadas são, conjuntas ou individualmente, controle do pH; formação de complexos moleculares hidrossolúveis e uso de tensoativos e/ou co-solventes (PRISTA, 1995; MAHATO; NARANG, 2012).
O controle de pH tem papel primordial na conquista de soluções de interesse medicamentoso, este domínio tem direta influência na dissolução do fármaco; na manutenção da estabilidade, seja ela química como farmacodinâmica; irritação do sítio de ação e local de administração da substância; e acima de todos a obtenção do efeito terapêutico adequado, o qual relaciona-se, como já mencionado, com a solubilidade (PRISTA, 1995). Fato fundamental é que o aumento ou a diminuição do pH poderá causar a precipitação do soluto na solução (MAHATO, NARANG, 2012). Logo, poderá ser utilizado tampões para a fixação do pH, para evitar mudanças desfavoráveis (PRISTA, 1995).
A partir do uso de adjuvantes, como benzoato ou salicilato de sódio, teremos a formação de complexos hidrossolúveis, com a solubilização da cafeína em água. Estes complexos representam a combinação de duas ou mais moléculas intermolecularmente ligadas por ligações de hidrogênio ou de van der Walls (PRISTA, 1995).
A exemplo da diversidade de substâncias passíveis de aumentar a solubilidade de fármacos em água encontra-se o estudo de Loftsson, Fririksdóttir e Gumundsdóttir (1996), que estudaram soluções aquosas de polímeros (hidroxipropilmetilcelulose e polivinilpirrolidona), o qual obteve resultados significantes de aumento de solubilidade mesmo em baixas concentrações (0,10-0,25% (w/v). Barreiro-Iglesias e colaboradores (2003)
estudaram, a partir de sondas de fluorescência, a rede de carbômero a qual se apresenta de forma mais apolar do que a água. Assim como demais sistemas coloidais que irão afetar positivamente a solubilidade (SYNKO, 2008; VILLANOVA; ORÉFICE; CUNHA, 2010). aumentando a possibilidade de incorporação nestas formas farmacêuticas de moléculas menos solúveis em água.
Com o mesmo objetivo pode-se lançar mão de ciclodextrinas (CD), estas que tem a capacidade de modificar as características físico-químicas de moléculas lipofílicas, ao acomodá-las em sua cavidade interior formando complexos de inclusão. As ciclodextrinas podem ser usadas sozinhas ou associadas a polímeros solúveis em água, como os supracitados. Alguns estudos demonstram que essa associação mostra-se vantajosa, pois aumentará a eficiência de solubilização exigindo menor quantidade de ciclodextrina para a complexação de fármacos (LOFTSSON, 1994; LOFTOSSON; FRIRIKSDÓTTIR; GUMUNDSDÓTTIR, 1996; LOFTOSSON; FRIRIKSDÓTTIR, 1998; MIRANDA, 2011).
Chaud (2010) abordou as dispersões sólidas (DS), como subsídio para melhorar a solubilidade de fármacos. DS nada mais são que um sistema no qual o fármaco sólido é disperso num transportador hidrófilo biologicamente inócuo.
Os polióis estão entre os agentes solubilizantes mais usados, além dos alcoóis, solventes orgânicos, tensoativos, sais e óleos (FERREIRA, 2008). É bastante notório que à adição de um cossolvente orgânico ou carreadores hidrofílicos como, por exemplo, propilenoglicol, sorbitol, glicerol e os polietilenoglicóis (PEG) alterarão drasticamente a solubilidade do fármaco em água. A solubilidade de um soluto sólido será maior num solvente misto (solvente mais co-solvente) do que em qualquer um dos solventes puros (RUCKENSTEIN, SHULGIN, 2003a e 2003b). A adição de polietilenoglicóis em sistemas contendo princípios ativos hidrofóbicos tem influenciado significativamente sua solubilização em meio aquoso, este episódio é associado a menor constante dielétrica do PEG quando comparada aos demais cossolvente (MEDEIROS, KANIS, 2010).
A partir do uso de tensoativos e co-solventes em presença de água e óleo, poderemos obter tanto emulsões como micro-emulsões, sendo que ambas são de grande aplicabilidade para a solubilização de substâncias pouco solúveis (DAMASCENO et al., 2011). Quando haverá ausência da fase oleosa, porém a presença de fármaco pouco solúvel e tensoativos ocorrerá a formação de micelas.
2.4.2 Tensoativos
Tensoativos são substâncias anfifílicas assim conhecidas por possuírem afinidade tanto a solventes polares como apolares. Nestas substâncias distinguem-se duas regiões de polaridade distinta: uma região hidrofílica, constituída por grupos iônicos ou não-iônicos polares, que estão ligados a uma região hidrofóbica composta por uma ou mais cadeias carbônicas (alquílica ou alquilfenílica) (PIRES, 2002; LEE et al., 2011). Eles têm uma vasta aplicação na área farmacêutica, compreendendo agentes antiespumante, emulsionante A/O e O/A, de molhabilidade e de espalhabilidade, detergentes e solubilizantes, apresentando ainda ações antibacteriana, de proteção e de estabilização de proteínas (SILVA, 2002; SINKO, 2008; LEE et al., 2011; OHTAKE, 2011).
A literatura técnica recomenda que os tensoativos estejam presentes nas formulações cosméticas e farmacêuticas em concentrações que não excedam a 5% (FERREIRA, 2008).
Os tensoativos podem ser classificados quanto ao seu Equilíbrio Hidrófilo-Lipófilo (EHL). Esta escala, empiricamente que vai do 0 ao 50, corresponde a polaridade relativa do tensoativo e assim permite a comparação entre diferentes tipos químicos de tensoativos. Desta forma, altos valores de EHL estão relacionados aos agentes hidrofílicos e baixos valores (menores de 9) aos agentes hidrofóbicos. Quando estes agentes têm seu valor de EHL entre 6 e 9, são considerados agentes molhantes, pois ao serem dissolvidos em água diminuem o ângulo de contato, auxiliando no deslocamento do ar substituído pela fase líquida, uma vez que as cadeias carbonicas serão adsorvidas na face das partículas hidrofóbicas. A parte polar fica projetada para parte aquosa, hidratando-se, levando o ângulo de contato próximo de zero. Para serem considerados como agentes solubilizantes seu EHL deve ser acima de 16 (PRISTA, 1995; AULTON, 2005; SYNKO,2008).
O aumento da solubilidade de substâncias pouco solúveis ou insolúveis no meio de dispersão é possível graças a propriedade, quando em solução, de formação de micelas. Essa habilidade de solubilização de fármacos por tensoativos varia conforme a composição química dos tensoativos envolvidos e com a localização do fármaco na micela. Quando se tem moléculas anfifílicas em água, a parte apolar ocupa a região do interior da micela e no seu
exterior estarão as porções polares do tensoativo, em contato com as moléculas de água da fase contínua (SHAW, 1975; FERREIRA, 2008; SINKO, 2008).
Para a melhoria da propriedade de solubilização de micelas constituídas de tensoativos catiônicos e aniônicos usa-se como principal método o aumento do raio do núcleo hidrocarbônico, ou seja, aumento do número de carbonos da cadeia hidrocarbônica na molécula do tensoativo. Esse aumento irá favorecer a entrada de moléculas na micela, uma vez que reduzirá a pressão de Laplace (SINKO, 2008).
Porém para micelas compostas de tensoativos não-iônicos a observação desse efeito não está bem caracterizada (SINKO, 2008), ao passo que para o tensoativo aniônico constituído de derivado etérico de polietilenoglicol o aumento no tamanho da micela em número de carbonos acima de 16, não melhora a solubilização de vários fármacos, mas a inclusão de um grupamento éter ou cetônico na região hidrofóbica afeta a solubilização e a propriedade micelar (ATTWOOD; ELWORTHY; LAWRENCE, 1989, apud SINKO, 2008).
Quando a energia livre padrão de solubilização (∆Gos) é negativa o processo de solubilização é espontâneo. Segundo Sinko (2008), valores negativos das funções termodinâmicas ∆Gos, ∆Hos ∆Sos para a solubilização do ácido benzóico em tensoativos não-iônicos, demonstram sua adsorção na superfície micelar. Os sinais e a amplitude das funções termodinâmicas podem dar indícios quanto à localização do fármaco solubilizado na micela.
As micelas com formato de bastão podem ser alteradas para globulares em solubilizados. As primeiras são observadas em tensoativos iônico e não-iônicos e sua capacidade de solubilização é elevada quando se está próximo da formação de coacervato1 (SINKO, 2008).
É fundamental o conhecimento da localização, distribuição e orientação dos fármacos solubilizados na micela para que seja possível compreender os aspectos cinéticos da técnica de solubilização e das interações entre o fármaco e os constituintes micelares, uma vez que estes fatores interferem na estabilidade molecular quanto à oxidação e à hidrólise, além da biodisponibilidade da molécula ativa (SINKO, 2008).
A indometacina, fármaco pouco solúvel em água e em sorbitol, apresenta redução do ponto de turvação quando veiculado em soluções aquosas de polissorbato 80 (tensoativo não-iônico) (ATTWOOD et al., 1989, apud SINKO, 2008). A solubilização deste fármaco aumenta o tamanho micelar, seja pela sua incorporação na micela do tensoativo, seja pelo aumento do número de monômeros de polissorbato por micela. O aumento da micela sugere a sua reestruturação para acomodação do fármaco, ficando esta mais simétrica e hidratada (SINKO, 2008).
Os tensoativos podem ser chamados de agentes de atividade de superfície, devido a tendência de acumular-se na fronteira entre as fases, inclusive na interface líquido-vapor (AULTON, 2005; FLORENCE, ATWOOD, 2011).
A tensão superficial propriamente dita é um predicado físico característico da interface líquido-vapor (γLV), onde moléculas situadas na superfície apresentam forças atrativas de coesão com as demais situadas no líquido e abaixo ou adjacentes a elas (Figura 3). A força adesiva de atração é pequena com as moléculas que constituem a outra interface, neste caso o ar (SINKO, 2008). Esta força mantém as moléculas juntas pela contração da superfície dando origem a tensão superficial, levando a mesma a se comportar como uma membrana elástica, devido às forças atrativas no sentido horizontal e no sentido do seu interior. Esta energia torna-se elevada quando há um aumento da superfície na mesma massa do líquido (SINKO, 2008).
Figura 3: Representação das forças atrativas na superfície a no meio do líquido. (Fonte: SHAW, 1975)
Quando a concentração de tensoativos atinge um determinado estágio, a interface passa a ficar saturada iniciando a formação de auto-agregados chamados de micelas, o que também reduzirá a energia livre do sistema e, de acordo com a equação de Gibbs, denota o aumento da adsorção (SHAW, 1975; SINKO, 2008; LEE et al., 2011). Nesse momento a
tensão superficial, que antes vinha decaindo, passa a ficar constante mesmo com o aumento da concentração de tensoativos. Nessa estreita faixa de concentração de tensoativos que ocorre a mudança de ângulo das retas, ou seja, inflexão da curva, encontra-se a Concentração Micelar Crítica (CMC), demonstrada na Figura 4 (SILVA, 2002; GUZMÀN, 2010; CAI, 2011; TIWARI, 2011). Cabe ressaltar que a CMC depende de diversos fatores, como estrutura iônica e características do meio, além da temperatura do meio e da presença de sais que irão afetar o processo de agregação (GUZMÁN, 2010).
Figura 4: Tensão superficial de solução de tensoativo x concentração, com formação de micelas. (Adaptado de http://www.kruss.de/services/education-theory/glossary/cmc%20/)
Para um sistema conter moléculas de tensoativos (monômeros) dispersos em água é necessário estar abaixo do CMC, enquanto que acima dessa concentração o sistema possui duas fases em equilíbrio: igual a do caso abaixo do CMC e outra contendo micelas de tensoativos. Neste caso a formação de micelas não é uma agregação progressiva de monômero de tensoativo e sim um processo de uma etapa, pois leva a formação de uma fase separada de uma solução aquosa (modelo de separação de fase) (BINANA-LIMBELE, ZANA, 1989). Outro exemplo de propriedades das soluções micelares é a associação gradual de monômeros para a formação de uma única micela (número de agregação). A combinação dessas duas características somadas gera a expressão para a energia livre padrão de micelização (SHAW, 1975; SINKO, 2008).
Os agregados formados acima de uma concentração crítica tem morfologias variadas, As micelas formadas por tensoativos não-iônicos mostram um aumento de polaridade do núcleo em direção à superfície polioxietileno-água. A interface núcleo-solução aquosa (parte polar) é uma “paliçada” extremamente hidratada, e esta distribuição anisotrópica favorece a inserção de diversas moléculas, ou seja, permite a solubilização (SINKO, 2008; PRAZERES, 2012).
Outros estudos demonstram que a CMC irá diminuir com o aumento de grupos espaçadores1, bem como com a substituição destes por hidroxilas, porém o primeiro tem maior efeito na diminuição da CMC (TIWARI, 2011).
Soluções de tensoativos aniônicos, catiônicos e não-iônicos foram usadas acima de suas concentrações micelares críticas para testar a solubilidade de um fármaco insolúvel em água (Artemotil). Os resultados evidenciam um aumento na solubilidade mediante a solubilização micelar nas duas primeiras soluções, enquanto que para soluções não-iônicas a melhoria na solubilização foi pequena (KRISHNA, FLANAGAN, 1989, apud SINKO, 2008). Outro grupo de pesquisa testou a solubilização de óleo de hortelã-pimenta em água usando o polissorbato 20 como solubilizante, obtendo resultados diferentes entre misturas homogêneas, gel aquoso, solução límpida e separação de fases, dependente das concentrações dos 3 componentes (O'MALLEY; PENNATTI; MARTIN, 1958, apud SINKO, 2008). Para a preparação de formulações límpidas de vitamina A monofásica, a quantidade mínima presumível de tensoativo para a solubilização da vitamina foi determinada pelo diagrama de fase (BOON et al., 1961, apud SINKO, 2008).
Os tensoativos podem ser classificados como não iônicos e iônicos, onde os não iônicos não fornecem íons na solução aquosa e a sua solubilidade neste meio se dá devido as seus grupamentos funcionais hidrofílicos. Os tensoativos iônicos apresentam cargas elétricas na parte hidrofílica que formam íons carregados positiva ou negativamente, ao se dissociarem em água (ROSSI et al., 2006).
2.4.3 Complexos Proteína-Tensoativos
Um dos excipientes mais comuns empregados para controlar as interações interfaciais das proteínas são os tensoativos não-iônicos, por exemplo, os polissorbatos (KAMERZELL et al., 2011; LEE et al., 2011; OHTAKE, 2011).
Os tensoativos ao aumentarem a solubilização de proteínas, a partir da interação direta e ligações hidrofóbicas na superfície protéica, irão cobrir e proteger a mesma de outras interações indesejáveis. (KAMERZELL et al., 2011).
As proteínas, dentre elas as enzimas, como a papaína, são moléculas de superfície, ou seja, tendem a adsorver e acumular-se nas interfaces, ficando assim muito suscetíveis à perda de sua atividade, que também poderá ocorrer pelo desdobramento estrutural e pequenas agregações moleculares. Algumas modificações de formulações, como mudança do pH e uso de excipientes, são úteis para minimizar as interações interfaciais das proteínas (KAMERZELL et al., 2011; LEE et al., 2011; OHTAKE, 2011).
Misturas de proteínas e tensoativos provocam alterações isotérmicas nas interfaces, e essas mudanças de valores de adsorção, em função do tensoativo, fornecem informações de grande relevância sobre a composição e propriedades estruturais dessa camada (KAMERZELL et al., 2011).
Kamerzell e colaboradores (2011) sugerem que ao reduzir a tensão superficial, bem como a energia livre do sistema, os tensoativos também reduzirão a interação proteína-proteína e proteína-proteína-superfície, uma vez que haverá competição com a proteína-proteína para adsorver nas interfaces. Além disso, teremos um sistema energeticamente desfavorável a adsorção da proteína na interface (GRAY, 2009). Lee e colaboradores (2011) acrescentam, que tensoativos aumentam a estabilidade conformacional da proteína e o desdobramento da energia livre associada à desnaturação/agregação. Lee e colaboradores (2011) e Ohtake (2011) completam, que a proteção protéica por de tensoativos poderá ocorrer por um dos mecanismos ou por ambos, ou seja, pelo impedimento da adsorção e/ou pela estabilização da proteína em solução inibindo a aproximação e conseqüente agregação (Figura 5).
Figura 5: Mecanismos de estabilização de proteínas por surfactantes, que podem (a) posicionar-se na interface e evitar a adsorção de proteínas, ou (b) se associam com as proteínas e preferencialmente, assim, evitar a
aproximação e agregação (Adaptado: LEE et al. (2011)).
O efeito protetor do tensoativo sobre a proteína estará correlacionado com a CMC, seja pela formação micelar, ou pela simples solubilização por interações hidrofóbicas. Desta forma sendo diretamente ligado à concentração da proteína quanto do tensoativo (GRAY, 2009; KAMERZELL et al., 2011; LEE et al., 2011).
Comumente, adiciona-se tensoativos aniônicos e não iônicos, para prevenir a adsorção de proteínas às superfícies e desta forma estabilizar macromoléculas (BAM; RANDOLPH; CHELAND, 1995). Por outro lado, concentrações elevadas de tensoativo podem desestabilizar estas mesmas macromoléculas (KATAKAM; BELL; BANGA, 1995). A concentração de tensoativo sobre a agregação de proteínas supõe uma ação protetora correlacionada com a concentração micelar crítica do tensoativo (WANG; JOHNSTON, 1993).
O esquema apresentado no Quadro 1 refere-se a uma mistura de proteína-tensoativo idealizada e em equilíbrio. É uma referência útil para explicar as observações de sistemas de maior complexidade. No entanto, por razões teóricas e práticas, as medições do verdadeiro equilíbrio interfacial, geralmente, não são possíveis e tão claras no caso de misturas de proteína-tensoativo reais (LEE et al., 2011). Os resultados na prática poderão ser variáveis, conforme a proteína, o tensoativo, suas concentrações e o meio em que ambas encontram-se (GRAY, 2009).
Quadro 1: Quadro das 5 regiões de interações proteínas-tensoativos e interface. Região 1: Concentrações baixíssimas de tensoativos: Região 2: Concentrações baixas de tensoativos: Região 3: Concentrações moderadas de tensoativos: Região 4: Concentrações altas de tensoativos: Região 5: Concentrações mais altas de tensoativos (> CMC): Poucas moléculas de tensoativos têm pouco, ou nenhum, efeito sobre a tensão superficial. O aumento da concentração de tensoativos diminui a tensão superficial, levando ao inicio da formação de complexos de proteínas-tensoativos Há interações consideráveis entre proteínas-tensoativos e superfície. A interação proteína-tensoativo induz ao deslocamento da proteína pra o interior do líquido (afastando-a da superfície). A proteína fica completamente afastada da superfície. A proteína torna-se revestida pelos tensoativos.
Representação esquemática da diminuição da tensão superficial associadas a cinco momentos distintos a interação da proteína-tensoativo e interações de tensoativo na interface (Adaptado: LEE et al. (2011) e GRAY (2009)).
É possível observar cinco momentos distintos de interação proteína-tensoativo dependente da concentração de tensoativos. Na primeira fase a concentração de tensoativos é nula ou baixíssima, não havendo efeito sobre a tensão superficial, a qual seria a mesma que a de uma solução pura de proteína; as interações proteínas-tensoativos e nas interfaces são limitadas. Na segunda fase, na qual ocorre uma mínima adição de tensoativos, observa-se queda na tensão superficial. Esse fenômeno ocorre graças ao posicionamento do tensoativo na interface ar-água, mesmo que haja também algumas moléculas dispersas no líquido. Nesta pequena concentração já se inicia a formação de complexos de proteínas-tensoativos, porém ainda bastante restritos. Com o crescente aumento de tensoativos observa-se a terceira fase, onde as interações entre proteínas-tensoativos e superfície tornam-se apreciáveis. A tensão superficial entra em um platô, a partir do favorecimento energético para a ligação entre o tensoativo e a proteína. Provavelmente nesse intervalo, a CMC registrada para o tensoativo em meio isento de proteínas é ultrapassada. Com uma concentração progressiva de tensoativos registra-se a quarta fase e há interações significantes entre proteínas-tensoativos e superfície. Estas interações induzem as proteínas a afastarem-se da superfície ao serem deslocadas para o interior do líquido. Na quinta fase, a partir do aumento contínuo de
