CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO DE PIMENTÃO VERMELHO E DOS COMPLEXOS OBTIDOS

4.5.1 Cromatografica Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

O extrato de pimentão vermelho foi analisado por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de fotodiodos (CLAE-DAD) para separação e caracterização dos carotenoides presentes. Primeiramente o extrato foi saponificado em hidróxido de potássio a 10% (m/v) durante 16 horas, na ausência de luz e em temperatura ambiente, a fim de hidrolisar ésteres de carotenoides que poderiam interferir na identificação dos mesmos. Após esta etapa, a amostra foi lavada e vestígios de água foram removidos com adição de sulfato de sódio anidro. O equipamento utilizado para esta análise foi o cromatógrafo líquido de alta eficiência da marca Waters, com módulo de separação Alliance 2695, composto por bomba analítica, injetor automático, desgaseificador, forno para colunas e detector de arranjo de diodos PDA 2996, com sistema controlado pelo software Empower. A coluna foi do tipo YMC (Waters), C30, 250 x 4,5 mm, 3 μm. Anteriormente à injeção, 10 μL de extrato de pimentão foram dissolvidos em 990 μL de acetona e 15 μL da solução foram injetados. A fase móvel (Tabela 1) utilizada foi um gradiente de eluição com os solventes metanol (fase A) e éter metil-terc-butílico (fase B), utilizando-se o fluxo de 0,8 mL/min.

Tabela 1: Composição do gradiente da fase móvel utilizada na análise.

Tempo (minutos) %Fase A %Fase B

0 80 20 0,50 75 25 15,00 15 85 15,05 10 90 16,50 10 90 16,55 80 20 28,00 80 20

Eficiência de Inclusão (%) = 100 x (conteúdo medido de carotenoides /conteúdo total teórico de carotenoides)

Além do extrato de pimentão, os carotenoides presentes nos complexos de inclusão também foram analisados. Para isso, foi efetuada a extração dos carotenoides dos complexos pela mesma metodologia descrita para a determinação da eficiência de inclusão. Para isto, foi retirada uma alíquota de 100 μL das amostras, sendo necessária a evaporação do solvente no qual estavam diluídas, neste caso, etanol e acetonitrila, com o auxílio de ar comprimido. Após a evaporação, ao extrato obtido foi adicionado 1 mL de acetona, sendo posteriormente a solução injetada nas mesmas condições já relatadas. Para estas amostras não foi realizada a saponificação, pois a quantidade das mesmas era insuficiente. A identificação dos carotenoides foi realizada através da comparação dos tempos de retenção e espectro de absorção no UV-visível da biblioteca de padrões previamente isolados pelo Laboratório de Cromatografia Líquida da Embrapa Agroindústria de Alimentos, onde foram realizadas as análises cromatográficas.

4.5.2 Espectrofotometria de Infravermelho por Transformada de Fourier

Os espectros de infravermelho de todas as amostras foram obtidos na faixa de 500 a 4000 cm-1, utilizando o espectrômetro Eco-ATR Alpha (Bruker Corporation), sem necessidade de preparo da amostra, podendo ser esta líquida ou sólida. A resolução dos espectros foi de 0,01 cm-1.

4.5.3 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)

As análises de DSC foram realizadas utilizando-se o aparelho 822 Mettler-Toledo (Mettler Toledo). Para calibração utilizou-se indium e zinco como materiais de referência. Durante a análise as amostras foram aquecidas de 25 a 400 ºC, a uma taxa de aquecimento de 10ºC/minuto, sob atmosfera de nitrogênio. As análises foram conduzidas no Laboratório de Processamento e Caracterização de Materiais Poliméricos, no Instituto Nacional de Tecnologia (INT).

4.5.4 Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H)

As análises de RMN1H foram realizadas com a utilização do equipamento Varian VNMRS com frequência de 500 MHz. As soluções para análise foram preparadas através da diluição de 6 mg das amostras dos complexos, misturas físicas e extrato de pimentão

vermelho em 600 μL de solventes deuterados. Para a diluição dos complexos e misturas físicas foi utilizado óxido de deutério (D2O), enquanto que para o extrato foi utilizado dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6). A edição dos espectros foi realizada utilizando-se o programa SpinWorks 4. As análises foram realizadas no Laboratório Multiusuário de Ressonância Magnética, no Instituto de Química da Universidade Federal Fluminense (UFF).

4.5.5 Difusão Dinâmica da Luz (DLS)

A determinação do tamanho e distribuição de partículas dos complexos, mistura física e HP-β-CD foi realizada utilizando-se o aparelho ZetaSizer Nano (Malvern). Para a execução desta análise, 10 mg de cada amostra foram diluídos em 3 mL de água ultra-pura, sendo em seguida dispostos em cubetas de acrílico para a medição do tamanho e distribuição de partículas. As análises foram realizadas no Instituto de Biologia da Universidade Federal Fluminense (UFF)

4.5.6 Ensaio de solubilidade

As análises para o ensaio de solubilidade dos complexos, misturas físicas e extrato de pimentão foram baseadas na metodologia proposta por Tran et al (2014), com modificações. Um excesso de amostra foi adicionado a 4 mL de água destilada, sendo dispostos em tubos de vidro. Os tubos foram posicionados em um banho metabólico por 48 horas a 27 ºC ±2, em constante movimento até atingirem o equilíbrio. Para os testes com complexos e misturas físicas, utilizou-se 0,1 g, enquanto que para o extrato utilizou-se 0,05 g de amostra.

Após esta etapa, as amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm por 10 minutos a fim de separar a porção não solubilizada. Em seguida à separação das fases, as soluções foram filtradas através de membrana (0,2 μm) acoplada a uma seringa, retirada uma alíquota de 1 mL e ajustada ao volume de 50 mL com água destilada. Após diluição, as amostras foram analisadas por espectrofotometria de absorção no UV-visível, em comprimentos específicos para cada amostra. O experimento foi realizado em triplicata. A preparação da amostra em banho metabólico foi realizada no Laboratório de Bromatologia da Faculdade de Farmácia da UFF, enquanto as análises espectrofotométricas foram realizadas na Central Analítica da mesma instituição.

4.6 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DE COR DOS COMPLEXOS DE INCLUSÃO EM