UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE
NICOLLY DE LIMA PETITO
COMPLEXAÇÃO DE CAROTENOIDES DE PIMENTÃO VERMELHO COM HIDROXIPROPIL-β-CICLODEXTRINA: CARACTERIZAÇÃO, AVALIAÇÃO DA
SOLUBILIDADE E ESTABILIDADE EM FORMULAÇÕES ALIMENTÍCIAS
NITERÓI, RJ 2015
NICOLLY DE LIMA PETITO
COMPLEXAÇÃO DE CAROTENOIDES DE PIMENTÃO VERMELHO COM HIDROXIPROPIL-β-CICLODEXTRINA: CARACTERIZAÇÃO, AVALIAÇÃO DA
SOLUBILIDADE E ESTABILIDADE EM FORMULAÇÕES ALIMENTÍCIAS.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense como requisito para obtenção do grau de Mestre.
Orientadora: Profa Dra. KÁTIA GOMES DE LIMA ARAÚJO Co-orientadora: Profª. Drª DEBORAH QUINTANILHA FALCÃO
Niterói, RJ 2015
NICOLLY DE LIMA PETITO
COMPLEXAÇÃO DE CAROTENOIDES DE PIMENTÃO VERMELHO COM HIDROXIPROPIL-β-CICLODEXTRINA: CARACTERIZAÇÃO, AVALIAÇÃO DA
SOLUBILIDADE E ESTABILIDADE EM FORMULAÇÕES ALIMENTÍCIAS.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense como requisito para obtenção do grau de Mestre.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________________________________ Profª. Dra. KÁTIA GOMES DE LIMA ARAÚJO - Orientadora
Universidade Federal Fluminense – UFF
_________________________________________________________________________ Prof°. Dr. DANIEL PERRONE MOREIRA – Membro Titular
Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ
_________________________________________________________________________ Prof°. Dr. JULIO BELTRAME DALEPRANE – Membro Titular
Universidade do Estado do Rio de Janeiro - UERJ
Niterói, RJ 2015
AGRADECIMENTOS
À Deus, por estar presente em minha vida, me abençoando, iluminando o meu caminho, provendo saúde, e por ter me dado a oportunidade de conclusão desta etapa.
À minha orientadora Kátia Gomes de Lima Araújo, pelo carinho, atenção, amizade, disponibilidade, e por todos os ensinamentos ao longo destes anos.
À minha co-orientadora Deborah Quintanilha Falcão, pela paciência, disponibilidade, incentivo, amizade e ajuda na produção deste trabalho.
À professora Josiane Roberto Domingues, pelo apoio, disponibilidade, carinho e amizade, sempre estando presente e disposta a sanar dúvidas, e ajudar em todos os momentos.
À professora Vanessa Naciuk, pelos conselhos, ajudas, conversas, companhia e amizade, e pela revisão deste trabalho.
Às amigas do Laboratório de Biotecnologia de Alimentos (LABIOTEC), Beatriz, Carla, Daiana, Dayane, Fabiana, Francine, Gabriela, Hevelyn, Josiane, Lidiane, Manuela, Paula, Roberta, Thais, e ao amigo Jorge, pela companhia, disposição em ajudar, amizade e risadas.
À minha família, pelo amor, apoio, educação, ensinamentos, valores, incentivo, e por serem os principais responsáveis pelo cumprimento de mais esta etapa da minha vida.
Ao meu namorado, Carlos Eduardo Antunes, pela paciência, compreensão, carinho e amor.
Aos colegas Carolina, Patrícia e Rafael pela ajuda na realização das análises de DLS.
Ao Laboratório de Ressonância Magnética da UFF, pela realização das análises de RMN.
Aos Professores Fernando Silva e Vitor Ferreira, pela ajuda na realização das análises de Infravermelho.
À Drª Valéria Costa, do Instituto Nacional de Tecnologia, pela realização das análises de DSC.
Ao Laboratório de Cromatografia Líquida de Alimentos da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), em especial ao Dr. Ronoel Godoy e ao Dr. Sidney Pacheco pela realização das etapas de análise cromatográfica do extrato de pimentão vermelho.
Às técnicas da Central Analítica da Faculdade de Farmácia da UFF, Camila, Larissa e Nelize pela companhia e ajuda.
Às professoras Alice e Luciana Esper, por cederem vidrarias e reagentes.
Ao Laboratório de Bromatologia; aos professores Marcelo, Leonor e Márcia; às técnicas Adriana e Aline; pela ajuda, utilização de equipamentos, reagentes e solventes.
À professora Márcia Feijó, pela correção do projeto de pesquisa.
A todos os professores, bolsistas e funcionários da Faculdade de Farmácia, por estarem sempre dispostos a ajudar, e que de forma indireta foram essenciais na elaboração deste trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa de mestrado.
RESUMO
Carotenoides são pigmentos naturais amplamente distribuídos na natureza, responsáveis pelas cores vermelhas, laranjas e amarelas. São substâncias amplamente estudadas por apresentarem potencial antioxidante e atividade pró-vitamina A. Devido a seu caráter lipofílico, são pigmentos naturais de difícil aplicação em alimentos como aditivos, além de apresentarem alta instabilidade frente a fatores comuns no processamento, como pH, luz, calor e oxigênio. O uso de ciclodextrinas como agentes encapsulantes é recomendado a fim de aumentar a solubilidade dos carotenoides em meio aquoso, e possivelmente, protegê-los dos fatores químicos e ambientais. Portanto, o objetivo deste trabalho foi conduzir a inclusão molecular de carotenoides de pimentão vermelho (Capsicum annuum L.) em hidroxipropil-β-ciclodextrina visando o aumento de sua solubilidade e estabilidade frente a fatores envolvidos no processamento e armazenamento de bebidas isotônicas. A extração dos carotenoides de pimentão vermelho foi realizada por meio de maceração em solvente etanol e água (9:1), seguida de partição com hexano e evaporação em baixa temperatura. O perfil de carotenoides do extrato obtido foi determinado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-UV). A inclusão do extrato de pimentão vermelho em hidroxipropil-β-ciclodextrina foi realizada por meio de sonda de ultrassom em quatro proporções (1:4, 1:6, 1:8 e 1:10 v/v). Misturas físicas nas mesmas proporções foram preparadas para efeito comparativo. O extrato de pimentão vermelho, os complexos de inclusão obtidos e as misturas físicas foram caracterizados por espectrofotometria no infravermelho (FT-IR), ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN1H), calorimetria exploratória diferencial (DSC), difusão dinâmica da luz (DLS), espectrofotometria de absorção na região do UV-visível e ensaio de solubilidade. No extrato de pimentão vermelho foram identificados cinco carotenoides, a saber: caroteno, β-criptoxantina, 9-cis-β-caroteno, capsantina e 13-cis-β-caroteno. Observou-se que a inclusão molecular foi efetiva para as diferentes proporções de complexo ao compará-las com os resultados das misturas físicas, principalmente pelos resultados dos ensaios de solubilidade, onde foi identificado o aumento de solubilidade em até 660 vezes comparado ao do extrato isolado. Devido à relação custo-benefício, optou-se por dar continuidade aos experimentos com os complexos com proporção 1:6 (m/m). A estabilidade de cor dos complexos e do extrato de pimentão foi avaliada sob o efeito combinado das variáveis pH, tempo e temperatura. Os resultados demonstraram que se pode esperar maior retenção dos parâmetros de cor com o uso do complexo do que com o uso do extrato. A fim de avaliar a estabilidade de cor dos complexos em condições de armazenamento durante 40 dias, foram formuladas bebidas isotônicas adicionadas de complexo ou de corantes artificiais, adicionadas de conservante ou pasteurizadas, submetidas à 10 ou 25 μmol de fótons.m2.s-1, ou armazenadas na ausência de luz. Os resultados revelaram que as amostras armazenadas ao abrigo de luz apresentaram menor variação da cor, tendo as pasteurizadas apresentado melhor resultado. Em conclusão, a inclusão molecular permite o aumento da solubilidade dos carotenoides de pimentão vermelho, permitindo assim a sua aplicação em formulações alimentícias, e atribui o efeito protetor a estes carotenoides frente a fatores inerentes ao processamento de alimentos.
Palavras-chave: carotenoides, inclusão molecular, pimentão vermelho, hidroxipropil-β-ciclodextrina
ABSTRACT
Carotenoids are natural pigments widely distributed in nature, responsible for the red, orange and yellow colors. They are known and studied due to their antioxidant potential and pro-vitamin A activity. However, due to their lipophilic nature and high instability under influence of common processing factors, such as pH, light, heat and oxygen, it is difficult to apply them in food . Use of cyclodextrins as encapsulating agent is recommended in order to increase their aqueous solubility and protect the molecules against chemical and environmental factors. The aim of this study was to perform molecular inclusion of red bell pepper carotenoids (Capsicum annuum L.) in hydroxypropyl-β-cyclodextrin, in order to increase their solubility and stability in front of factors involved in processing and storage of food. The extraction of red bell pepper carotenoids was carried out by soaking in solvent ethanol and water (9: 1), followed by partition with hexane and evaporation at low temperature. In order to characterize the extract obtained, analysis by high performance liquid chromatography was performed (HPLC), identifying β-carotene, β-cryptoxanthin, 9-cis-β-carotene, capsanthin and 13-cis-β-carotene. Inclusion of red pepper extract in hydroxypropyl-β-cyclodextrin was performed using ultrasound probe in four different ratios (1: 4, 1: 6, 1: 8 and 1:10). Additionally, physical mixtures in the same ratios were prepared for comparative purposes. The obtained inclusion complexes, red pepper extract, hydroxypropyl-β-cyclodextrin and physical mixtures were characterized by infrared spectroscopy (FT-IR), nuclear magnetic resonance (1 H NMR), differential scanning calorimetry (DSC), dynamic light scattering (DLS), UV-visible spectroscopy and solubility assay. Molecular inclusion was effective for the different proportions of the complex, by comparing them with the results of physical mixtures, mainly the results of the solubility tests, where the increased solubility was identified up to 660 times, compared to the pure extract. Due to cost-effectiveness, it was decided to continue the experiment with the 1:6 complex. The color stability of the complex and of red bell pepper extract was evaluated under the combined effect of pH, time and temperature. Results demonstrated greater retention of color parameters using complex than the use of extract. In order to evaluate the stability of complex color storage conditions for 40 days, isotonic drinks added of artificial colors or complex were formulated, adding preservative or pasteurized, subjected to 10 or 25 micromol photons.m2.s-1 or stored in the absence of light. Results showed that the samples stored in the absence of light had less color variation, being the pasteurized the best condition. In conclusion, molecular inclusion allows increasing of solubility, thereby allowing its application in food formulations, and assigns the protective effect for carotenoids against inherent factors in food processing.
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 15 2 OBJETIVOS 17 2.1 OBJETIVO GERAL 17 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 17 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 18
3.1 A IMPORTÂNCIA DA COR NOS ALIMENTOS 18
3.2 CORANTES UTILIZADOS PELA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS 18
3.2.1 Corantes artificiais 19
3.2.1.1 Aspectos toxicológicos do uso de corantes artificiais em alimentos 22
3.2.2 Corantes naturais 23
3.2.2.1 Carotenoides 26
3.3 PIGMENTOS DO PIMENTÃO VERMELHO 28
3.4 ESTABILIDADE DOS CAROTENOIDES FRENTE A FATORES DO PROCESSAMENTO E ARMAZENAMENTO DE ALIMENTOS
29
3.5 MICROENCAPSULAÇÃO APLICADA A ALIMENTOS 31
3.5.1 Inclusão molecular em ciclodextrinas 32
3.5.2 2-hidroxipropil-β-ciclodextrinas 34
4 METODOLOGIA 36
4.1 PROCESSAMENTO DO PIMENTÃO VERMELHO E OBTENÇÃO DO EXTRATO
36 4.2 INCLUSÃO MOLECULAR DO EXTRATO DE PIMENTÃO VERMELHO
EM HIDROXIPROPIL-Β-CICLODEXTRINA
37 4.3 ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO
UV-VISÍVEL
39
4.4 DETERMINAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE INCLUSÃO 39
4.5 CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO DE PIMENTÃO VERMELHO E DOS COMPLEXOS OBTIDOS
40
4.5.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 40
4.5.2 Espectrofotometria no Infravermelho por Transformada de Fourier (FT-IR) 41
4.5.3 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) 41
4.5.4 Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN1H) 41
4.5.5 Difusão Dinâmica da Luz (DLS) 42
4.6 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DOS COMPLEXOS DE INCLUSÃO EM SISTEMAS MODELOS, FRENTE A FATORES IMPORTANTES PARA O PROCESSAMENTO DE ALIMENTOS.
43
4.7 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DE COR DE BEBIDAS ISOTÔNICAS ADICIONADAS DE COMPLEXOS DE INCLUSÃO DURANTE O ARMAZENAMENTO
45
4.8 ANÁLISES ESTATÍSTICAS 46
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 48
5.1 ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO UV-VISÍVEL
48 5.2 INCLUSÃO MOLECULAR DO EXTRATO DE PIMENTÃO VERMELHO
EM HIDROXIPROPIL-β-CICLODEXTRINA E DETERMINAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE INCLUSÃO
50
5.3 CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO DE PIMENTÃO VERMELHO E DOS COMPLEXOS OBTIDOS
52
5.3.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 52
5.3.2 Espectrofotometria no Infravermelho por Transformada de Fourier (FT-IR) 55
5.3.3 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) 58
5.3.4 Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN1H) 60
5.3.5 Difusão Dinâmica da Luz (DLS) 64
5.3.6 Ensaio de solubilidade 68
5.4 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DA COR DO COMPLEXO DE INCLUSÃO EM SISTEMA MODELO, FRENTE A FATORES IMPORTANTES PARA O PROCESSAMENTO DE ALIMENTOS
70
5.5 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DE COR DE BEBIDAS ISOTÔNICAS ADICIONADAS DE COMPLEXOS DE CAROTENOIDES DE PIMENTÃO VERMELHO E HIDROXIPROPIL-Β-CICLODEXTRINA
81
6 CONCLUSÕES 90
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Estruturas químicas dos corantes artificiais permitidos no Brasil. (SCIFINDER, 2015).
20 Quadro 1 Características dos principais corantes artificiais utilizados pelas
indústrias de alimentos.
21 Quadro 2 Corantes Orgânicos Naturais permitidos no Brasil. 24 Quadro 3 Características dos principais corantes naturais permitidos para uso
no Brasil.
24 Figura 2 Estruturas de alguns pigmentos naturais (SCIFINDER, 2015). 26 Figura 3 Estruturas de alguns carotenoides (FERNÁNDEZ-GARCÍA, et al.
2012)
27 Figura 4 Estruturas químicas de α-, β- e γ-ciclodextrinas (ASTRAY et al.
2009)
33 Figura 5 Distribuição das principais ciclodextrinas utilizadas em drogas
comerciais.: β-ciclodextrina, hidroxipropil- β-ciclodextrina, , hidroxipropil- γ -ciclodextrina , sulfobutil-éter-ciclodextrina (KURKOV ; LOFTSSON, 2013).
34
Figura 6 Estrutura da hidroxipropil-β-ciclodextrina 35
Figura 7 Etapas envolvidas no processamento do pimentão: pimentão vermelho in natura (a), pimentão após corte (b), pimentão triturado (c), pimentão em maceração (d) e pimentão após esgotamento (e).
36
Figura 8 Obtenção do extrato: partição com hexano (a), esgotamento da partição (b), evaporação do solvente (c), extrato de pimentão (d)
37 Figura 9 Procedimento de inclusão molecular em sonda de ultrassom (a), e
complexo liofilizado (b).
38 Figura 10 Esquema de elaboração das bebidas isotônicas: tratamento e
condições aplicadas.
46 Figura 11 Espectros de absorção no UV-visível do extrato de pimentão
vermelho em acetonitrila:etanol (a); extrato de pimentão vermelho em hexano (b); complexos em água (c) e misturas físicas em água (d).
49
Figura 12 Curvas padrões dos complexos solubilizados em água : 1:4 (a); 1:6 (b); 1:8 (c) e 1:10 (d).
49 Figura 13 Curvas padrões do extrato de pimentão vermelho: em
acetonitrila:etanol (1:5) (a); e em hexano (b).
50 Figura 14 Curvas padrões das misturas físicas em água: M1:4(a); M1:6(b);
M1:8(c) e M1:10(d).
50 Figura 15 Perfil cromatográfico do extrato de pimentão vermelho saponificado
(a) e sem saponificação (b).
53 Figura 16 Cromatogramas dos pigmentos incluídos nos complexos de inclusão
de extrato de pimentão vermelho em hidroxipropil-β-ciclodextrina
nas proporções 1:4, 1:6, 1:8 e 1:10.
Figura 17 Espectros de infravermelho: extrato de pimentão vermelho, hidroxipropil-β-ciclodextrina, misturas físicas (à esquerda) e complexos de inclusão (à direita).
56
Figura 18 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC): extrato de pimentão vermelho (verde), hidroxipropil-β-ciclodextrina (preto), complexo 1:4 (roxo), complexo 1:6 (vermelho), complexo 1:8 (azul) e complexo 1:10 (cinza) em atmosfera de nitrogênio.
59
Figura 19 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC): extrato de pimentão vermelho(verde), hidroxipropil-β-ciclodextrina (azul), mistura física 1:4 (vermelho), mistura física 1:6 (roxo), mistura física 1:8 (cinza) e mistura física 1:10 (rosa) em atmosfera de nitrogênio.
60
Figura 20 Espectros de RMN1H: hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPβCD), extrato, e complexos 1:4, 1:6, 1:8 e 1:10, respecivamente.
62 Figura 21 Distribuição do tamanho de partícula das soluções das suspensões dos
complexos.
66 Figura 22 Distribuição do tamanho de partícula das soluções das misturas
físicas.
67 Figura 23 Teste de solubilidade: (a) complexos de inclusão, (b) misturas físicas,
(c) extrato de pimentão vermelho.
69 Figura 24 Gráfico de solubilidade das amostras de complexos de inclusão e
extrato de pimentão vermelho e misturas físicas.
70 Figura 25 Variações dos índices L*(a), a*(b) e b*(c) de acordo com o pH. 73 Figura 26 Gráficos de Paretto indicando os efeitos do pH, temperatura e tempo
de aquecimento sobre o índice L* nas amostras de extrato de pimentão e complexo.
74
Figura 27 Gráficos de Paretto indicando os efeitos do pH, temperatura e tempo de aquecimento sobre o índice a* nas amostras de extrato de pimentão e complexo.
74
Figura 28 Gráficos de Paretto indicando os efeitos do pH, temperatura e tempo de aquecimento sobre o índice b* nas amostras de extrato de pimentão e complexo.
74
Figura 29 Superfícies de resposta das variações do índice L* para o extrato e complexo em função da temperatura e pH; tempo e pH ; e temperatura e pH.
78
Figura 30 Superfícies de resposta das variações do índice a* para o extrato e complexo em função da temperatura e pH; tempo e pH ; e temperatura e pH.
79
Figura 31 Superfícies de resposta das variações do índice b* para o extrato e complexo em função da temperatura e pH; tempo e pH ; e temperatura e pH.
80
bebidas isotônicas adicionadas de complexo de extrato de pimentão e hidroxipropil-β-ciclodextrina (à direita).
Figura 33 Gráficos da variação dos índices L*(a) , a*(b) e b*(c) para as bebidas isotônicas adicionadas de corantes com conservante ou pasteurizadas, sob a irradiância de 25 e 10 μmol de fótons/m2
/s-, e ao abrigo da luz.
82
Figura 34 Gráficos da variação dos índices L*(a) , a*(b) e b*(c) para as bebidas isotônicas adicionadas de complexo 1:6 com conservante, sob a irradiância de 25 e 10 μmol de fótons/m2
/s-, e ao abrigo da luz.
84
Figura 35 Gráficos da variação dos índices L*(a) , a*(b) e b*(c) para as bebidas isotônicas adicionadas de complexos 1:6, pasteurizadas, sob a irradiância de 25 e 10 μmol de fótons/m2
/s-, e ao abrigo da luz.
85
Figura 36 Bebidas isotônicas adicionadas de complexos de inclusão: Ao abrigo da luz (à esquerda) e exposta à luz (à direita).
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composição do gradiente da fase móvel utilizada na análise. 40 Tabela 2 Variáveis e níveis utilizados no planejamento experimental. 43
Tabela 3 Combinações de variáveis e níveis utilizados. 43
Tabela 4 Composição da bebida isotônica produzida. 45
Tabela 5 Rendimento e eficiência de inclusão das amostras de complexos de inclusão nas diferentes proporções.
52 Tabela 6 Deslocamentos químicos obtidos através dos espectros dos complexos de
inclusão, comparados ao espectro da hidroxipropil-β-ciclodextrina.
61 Tabela 7 Deslocamentos químicos obtidos através dos espectros das misturas
físicas, comparadas ao espectro da hidroxipropil-β-ciclodextrina.
62 Tabela 8 Tamanho de partícula (diâmetro em nm) das amostras de complexos,
HPBCD, e misturas físicas.
65
Tabela 9 Índice de polidispersão das amostras. 69
Tabela 10 Matriz experimental utilizada para avaliação estatística do experimento de avaliação da estabilidade de cor dos complexos de inclusão e do extrato de pimentão vermelho.
72
Tabela 11 Análise de variância (ANOVA) para o índice L* do complexo (R2=0,9262).
75 Tabela 12 Análise de variância (ANOVA) para o índice b* do complexo
(R2=0,9807).
75 Tabela 13 Análise de variância (ANOVA) para o índice L* do extrato (R2=0,9344). 76 Tabela 14 Análise de variância (ANOVA) para o índice a* do extrato (R2=0,9295). 76 Tabela 15 Análise de variância (ANOVA) para o índice b* do extrato (R2=0,9775). 76 Tabela 16 Variação percentual dos índices L*, a* e b*, entre os tempos 0 e 40. 86
LISTA DE ABREVIAÇÕES
IDA Ingestão Diária Aceitável
INS Sistema Internacional de Numeração de Aditivos Alimentares CNNPA Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos JECFA Joint FAO/WHO Committee on Food Additives
β-CD β-Ciclodextrina
HP-β-CD Hidroxipropil- Β-Ciclodextrina
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
1 INTRODUÇÃO
Segundo a Portaria nº 540/97, emitida pelo Ministério da Saúde (SVS/MS), aditivo alimentar é definido como qualquer ingrediente adicionado intencionalmente aos alimentos, sem propósito de nutrir, com o objetivo de modificar as características físicas, químicas, biológicas ou sensoriais, durante a fabricação, processamento, preparação, tratamento, embalagem, acondicionamento, armazenagem, transporte ou manipulação de um alimento. O emprego de aditivos químicos é extensamente discutido devido aos seus potenciais efeitos tóxicos à saúde humana. Neste sentido, há uma profunda necessidade em conduzir estudos que investiguem a influência do consumo de aditivos a longo e curto prazo para a saúde humana, estabelecendo uma possível relação com a etiologia de determinadas doenças. O uso de corantes artificiais, uma das principais classes utilizadas de aditivos alimentares, é uma das ações mais polêmicas da indústria alimentícia, já que seu uso justifica-se por questões de hábitos alimentares, justifica-sendo a aparência e aceitação do produto os maiores argumentos para empregá-los. Apesar de serem largamente aplicados em alimentos, diversas pesquisas apontam os malefícios dos corantes artificiais para saúde, alertando para o seu uso e consumo indiscriminado. Os estudos sugerem uma grande variedade de aspectos nocivos relacionados ao consumo dos corantes artificiais, como hiperatividade em crianças, danos ao DNA de diversos tecidos em ratos, reações alérgicas, lesões hepáticas, angioedema, asma, e urticárias, indicando a necessidade de prosseguimento com estudos toxicológicos destas substâncias.
Por este motivo, há um grande interesse pela obtenção de corantes naturais estáveis às condições de processamento e armazenamento dos alimentos como alternativa ao uso dos corantes artificiais. Além de apresentarem baixa toxicidade e alto poder de coloração, os corantes naturais podem apresentar propriedades bioativas como a atividade antioxidante, relacionada à diminuição do risco de doenças crônicas não transmissíveis.
O pimentão vermelho (Capsicum annuum L.), hortaliça popularmente conhecida e distribuída mundialmente, é um exemplo de vegetal fonte de pigmentos naturais. Além disso, é uma das hortaliças com maior volume de produção no Brasil, sendo cultivado principalmente na região Sudeste. Sua polpa é rica em carotenoides, compostos bioativos de cores amarelo, laranja e vermelho, presentes em diversas frutas, hortaliças, flores e micro-organismos. Os carotenoides também apresentam atividade antioxidante, e em alguns casos, atividade pró-vitamínica A.
Apesar de seus benefícios, os carotenoides e outros pigmentos naturais apresentam como desvantagens a instabilidade química, baixa solubilidade em água e susceptibilidade às alterações causadas pela luz, calor, oxigênio e variações de pH. Estas limitações dificultam o emprego destes pigmentos como aditivos, uma vez que os alimentos industrializados passam por diversas etapas de processamento e armazenagem.
Devido a estes fatores, a busca por alternativas que modifiquem e melhorem estas características limitantes são necessárias. Uma destas possibilidades é a inclusão molecular em ciclodextrinas, formando uma barreira física que protege os pigmentos contra os fatores ambientais e favorece a sua solubilidade em água. As ciclodextrinas são moléculas compostas por unidades de glicose, que, através da sua conformação, formam uma cavidade hidrofóbica ideal para recepção de substâncias lipossolúveis. Além disso, apresentam o exterior hidrofílico, permitindo a dissolução destas substâncias em meio aquoso.
A inclusão de substâncias em ciclodextrinas constitui-se numa aplicação da nanotecnologia em função das pequenas dimensões das estruturas formadas. É importante considerar que com a evolução da nanotecnologia, as ciclodextrinas possam, pelo seu baixo custo, grande disponibilidade e baixa toxicidade, serem empregadas para aumentar a solubilidade e a estabilidade dos carotenoides, viabilizando seu emprego como aditivos alimentares.
Em trabalho anterior do nosso grupo de pesquisa, foi conduzida a inclusão de pigmentos do pimentão vermelho em β-ciclodextrina, porém a solubilidade dos complexos obtidos não foi totalmente satisfatória em meio aquoso. Por este motivo, a hidroxipropil-β-ciclodextrina foi escolhida para dar continuidade a este trabalho, devido à sua alta solubilidade em água, podendo ser aplicada em alimentos de base aquosa, ao contrário da β-ciclodextrina usada anteriormente. Ademais, deve-se enfatizar a escassez de dados na literatura que abranjam o desenvolvimento de complexos de inclusão com pigmentos naturais, com o intuito de veiculação de substâncias bioativas e da aplicação em formulações alimentícias como corantes concomitantemente.
Portanto, o presente trabalho propõe o estudo da inclusão de carotenoides de pimentão vermelho em hidroxipropil-β-ciclodextrina, caracterizando os complexos obtidos, avaliando aspectos da sua solubilidade e estabilidade frente a fatores envolvidos no processamento e armazenamento de alimentos, visando avaliar a viabilidade de sua aplicação em substituição ao uso de corantes artificiais e como veículo de substâncias bioativas em alimentos.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Conduzir a complexação de carotenoides do extrato de pimentão vermelho (Capsicum
annuum L.) com hidroxipropil-β-ciclodextrina, visando elevar sua solubilidade em água e sua
estabilidade frente a fatores envolvidos no processamento e armazenamento de alimentos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Analisar os pigmentos carotenoides do extrato de pimentão vermelho por métodos cromatográficos e por espectrofotometria de absorção;
Conduzir a complexação de carotenoides do extrato de pimentão vermelho com hidroxipropil-β-ciclodextrina em diferentes proporções visando elevar a solubilidade em água dos carotenoides;
Caracterizar os complexos de inclusão por métodos térmicos e espectrofotométricos, a fim de identificar a ocorrência da inclusão molecular;
Avaliar a solubilidade dos complexos obtidos em meio aquoso;
Avaliar a estabilidade de cor dos complexos frente a fatores importantes no processamento de alimentos como pH, temperatura e tempo de aquecimento;
Avaliar a estabilidade de cor durante o armazenamento de bebidas isotônicas adicionadas dos complexos de inclusão, pasteurizadas e adicionadas de conservante.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 IMPORTÂNCIA DA COR NOS ALIMENTOS
A aceitação dos alimentos está estreitamente relacionada a uma experiência multissensorial composta pelos sentidos da visão, olfato, tato, audição e paladar. Dentre estas percepções, a cor é uma das principais características sensoriais que leva a escolha de um produto, podendo influenciar a expectativa e o gosto real dos alimentos. A coloração pode denotar características sensoriais como doçura, frescor, e intensidade do sabor (WEI et al, 2013).
Diferentes cores podem transportar diferentes significados semânticos, como a percepção da cor indicando uma característica ou a identidade de um alimento. Ou seja, sabemos que um alimento não está em boas condições de consumo ao analisarmos se sua cor naquele momento não condiz com sua identidade usual. Portanto, a cor pode refletir a qualidade, frescor e aptidão para o consumo de um produto. Isto está relacionado ao nosso desenvolvimento cognitivo, dependente da memória e de experiências vividas, como por exemplo, a associação da cor azul e verde com alimentos mofados, e da cor marrom com hortaliças e frutas deterioradas (SHANKAR, LEVITAN; SPENCE, 2010).
Por este motivo, há um grande interesse do setor alimentício pela adição de corantes aos alimentos, a fim de obter produtos que agradem e sejam aceitos pelos consumidores. Estes corantes são adicionados, principalmente, para restituir a aparência original perdida durante seu processo de produção. Geralmente, a cor original dos alimentos é afetada devido aos métodos de processamento, estocagem, embalagem e distribuição, acarretando em um produto não aceito pelos consumidores. Os corantes também são utilizados em alimentos desprovidos de cor, ou para realçar as cores já existentes (PRADO; GODOY, 2003).
3.2 CORANTES UTILIZADOS PELA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS
De acordo com a resolução nº 44/77 da Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos (CNNPA), do Ministério da Saúde, corantes são definidos como substâncias ou mistura de substâncias que possuem a propriedade de conferir ou intensificar a coloração dos alimentos. Estes podem ser classificados como: (1) corantes orgânicos naturais, aqueles obtidos a partir de vegetal, ou eventualmente, de animal, cujo princípio corante tenha sido
isolado com o emprego de processo tecnológico adequado; (2) corantes orgânicos sintéticos, obtidos por síntese orgânica mediante o emprego de processo tecnológico adequado; (3) corantes artificiais, que são corantes orgânicos sintéticos não encontrados em produtos naturais; (4) corantes orgânicos sintéticos idênticos ao natural, que são os corantes orgânicos sintéticos cujas estruturas químicas são semelhantes à do princípio ativo isolado de corante orgânico natural; (5) corantes inorgânicos, aqueles obtidos a partir de substâncias minerais e submetidos a processos de elaboração e purificação adequados a seu emprego em alimento; (6) caramelo, o corante natural obtido pelo aquecimento de açúcares à temperatura superior ao ponto de fusão; e (7) caramelo (processo amônia), é o corante orgânico sintético idêntico ao natural obtido pelo processo amônia, desde que o teor de 4-metil-imidazol não exceda no mesmo 200 mg/kg (BRASIL, 1977).
3.2.1 Corantes artificiais
Os corantes artificiais são aqueles obtidos através de processamento tecnológico, não sendo extraídos de fontes naturais (BRASIL, 1977). São amplamente utilizados pela indústria alimentícia, devido a sua alta estabilidade e poder de coloração, grande variedade de cores e tonalidades, e por apresentar baixo custo (LINDINO et al., 2008).
Estes aditivos são constantemente criticados devido ao seu potencial toxicológico e por causar reações adversas a alguns consumidores, sendo alvo de investigações científicas. O uso desses corantes apenas justifica-se pela adição de cor aos alimentos, melhorando suas características sensoriais e tornando-os mais atrativos, não trazendo benefícios funcionais ou nutricionais aos consumidores (FREITAS, 2012).
Os corantes artificiais permitidos no Brasil para alimentos e bebidas são classificados em quatro grupos: azo (amaranto, amarelo crepúsculo, azorrubina, ponceau 4R, vermelho 40 e tartrazina), trifenilmetano (azul brilhante, azul patente V e verde rápido), indigóides (azul de indigotina) e xantenos (vermelho de eritrosina). Atualmente são utilizados em diversos alimentos como balas de goma, chicletes, pirulitos, balas, chocolates, gelatinas, refrigerantes, iogurte e leites fermentados, produtos de confeitaria e panificação, sobremesas, bebidas, sorvetes, produtos a base de cereais (BRASIL, 1977). A Figura 1 apresenta as estruturas químicas dos corantes artificiais permitidos no Brasil, enquanto o Quadro 1 indica as características, os valores de IDA (Ingestão Diária Aceitável), assim como o número INS (Sistema Internacional de Numeração de Aditivos Alimentares) de cada corante.
Figura 1: Estruturas químicas dos corantes artificiais permitidos no Brasil. (SCIFINDER, 2015).
Quadro 1: Características dos principais corantes artificiais utilizados pelas indústrias de alimentos.
Corantes
IDA*
(mg/Kg peso) INS** Cor
Estabilidade Solubilidade Aquosa (25ºC)
Amaranto 0-0,5 123 Vermelho Estável à luz,
calor e ácido; 7,2g/100mL Amarelo crepúsculo 0-2,5 110 Amarelo alaranjado Pouco estável à ácido ascórbico e SO2 19g/100mL
Azorrubina 0-4 122 Vermelho Estável à luz, calor e ácido; 5-10g/ 100mL a 19ºC Azul brilhante 0-12,5 133 Azul Razoável estabilidade à luz, calor e ácido 20 g/100mL Azul de indigotina 0-5 132 Azul Pouco estável à luz ,alcalinidade, SO2, acidez. 1,6 g/100mL Azul patente V *** 131 Azul Pouco estável à ácido ascórbico e SO2 5g/100mL a 20ºC Ponceau 4R 0-4 124 Vermelho Parcialmente estável à ácido ascórbico e SO2 25g/100mL
Tartrazina 0-7,5 102 Amarelo Pouco estável à
ácido ascórbico 20g/100mL Vermelho
de eritrosina
0-0,1 127 Vermelho Pouco estável à
acidez 9g/ 100mL Vermelho 40 0-7 129 Vermelho Estável à luz, calor e ácido; 22 g/100mL Verde rápido 0-25 143 Verde Razoável estabilidade à luz, calor e ácido 20g/100 mL * Sistema Internacional de Numeração de Aditivos Alimentares; **Ingestão Diária Aceitável (WHO, 2001); *** IDA não definida
Fonte: FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2013; CANADIAN FOOD INSPECTION AGENCY, 2012 EUROPEAN COMISSION, 2010; PRADO; GODOY, 2003; NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION, 2015; SOCACIU, 2007;
A legislação pertinente ao uso destes aditivos não é mundialmente padronizada, variando em cada país. Nos Estados Unidos, por exemplo, os corantes amaranto, azorrubina, azul patente, ponceau 4R e verde rápido são proibidos (FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2013). Já no Canadá apenas azorrubina, azul patente V e ponceau 4R são proibidos (CANADIAN FOOD INSPECTION AGENCY, 2012). A Europa autoriza todos os corantes artificiais liberados no Brasil, com exceção do verde rápido. Além disso, a Comissão Europeia, após consultar a European Food Safety Authority (EFSA), determinou que houvesse uma reavaliação da permissão de uso destes corantes, inclusive da quantidade tolerada para seu consumo, após a publicação de diversos artigos que evidenciavam seus efeitos tóxicos (EUROPEAN COMISSION, 2010).
3.2.1.1 Aspectos toxicológicos do uso de corantes artificiais em alimentos
Para que haja um parâmetro de fiscalização e de segurança no consumo de aditivos, é estabelecida a IDA pela JECFA (Joint FAO/WHO Committee on Food Additives). A IDA é uma estimativa da quantidade do aditivo alimentar, presente no alimento ou bebida, expressa em relação ao peso corpóreo (mg/Kg de peso corporal), que pode ser consumida diariamente, durante toda a vida, sem trazer risco apreciável à saúde do consumidor (WHO, 2001). No entanto, diversos estudos demonstram a presença de aditivos em quantidades maiores daquelas permitidas pela legislação (SUH; CHOL, 2012; RAO et al., 2004; HUSAIN et al, 2006). Além disso, as pessoas costumam consumir não apenas uma classe de aditivos, mas diversas ao longo de um dia.
Suh e Chol (2012) analisaram o conteúdo de corantes artificiais em 643 produtos nas categorias chocolate, doces, produtos de panificação, geleias, doces, gomas de mascar, bebidas alcoólicas e não-alcóolicas na Coréia. Dentre estas amostras, 78% eram coloridas artificialmente. Os principais corantes utilizados nestes produtos foram tartrazina (23%) e azul brilhante (19,1%). A quantidade do corante amarelo crepúsculo nas amostras de doces chegou a 1,90 mg/kg de peso corporal, quatro vezes o limite indicado pela União Europeia, que é de 0,5 mg/kg de peso. Esse limite também se apresentou acima dos limites máximos permitidos nas amostras de chocolate.
Amin, Abdel Hameid e Abd Elsttar (2010) observaram que o consumo de baixas ou altas doses de azorrubina (8 ou 100 mg/Kg de peso) e tartrazina (15 ou 500 mg/Kg de peso) diminuíram o ganho de peso em ratos machos jovens comparados ao grupo controle, sendo o primeiro indicador para a toxicidade destes corantes. Além disso, ambas as concentrações dos corantes foram capazes de alterar as enzimas hepáticas transaminase glutâmico-oxalacética e transaminase glutâmico-pirúvica, indicando lesão neste órgão. Houve também aumento das taxas de creatinina, ureia e das proteínas do soro, provavelmente relacionado à ação dos anticorpos ativados pela hipersensibilidade aos corantes.
Mpountoukas et al. (2010) testaram os efeitos citotóxico (àquele que é capaz de destruir ou lesar a célula), genotóxico (àquele que é capaz de trazer danos ao DNA) e o potencial citostático (àquele que impede a multiplicação e crescimento das células) dos corantes amaranto, eritrosina e tartrazina em linfócitos humanos. Alta concentração (8 mM) de amaranto demonstrou alta genotoxicidade, citotoxicidade e citostaticidade. Da mesma forma, a eritrosina, em concentrações de 2, 4 e 8 mM, demonstrou alta citoxicidade e citostaticidade. Por outro lado, a tartrazina não apresentou genotoxicidade em nenhuma das concentrações investigadas, porém apresentou citotoxicidade e citostaticidade nas concentrações de 1 e 2 mM e de 4 e 8 mM, respectivamente.
Adicionalmente, Yadav et al. (2013) identificaram alterações imunológicas em esplenócitos submetidos à dose de 250 μg/mL (acima da IDA) de corante amarelo crepúsculo. Estes autores observaram diminuição na proliferação das células, indução de distúrbios no balanço de linfócitos T e B, supressão na reação dos linfócitos contra os antígenos aplicados, e supressão na expressão das citocinas IL2, IL4, IL6, IL-17, IFN-γ e TNF-α.
Desta forma, é crescente o interesse por investigar corantes naturais com potencial para substituição dos corantes artificiais e que promovam propriedades sensoriais similares, além de agregar valor nutricional aos alimentos.
3.2.2 Pigmentos naturais
Os pigmentos naturais são aqueles obtidos através de organismos vivos, ou pela modificação de seus materiais. Podem ser extraídos de plantas, insetos, algas, cianobactérias, bactérias e fungos. Apresentam como maior vantagem o uso seguro, sem evidências de que possam ser prejudiciais à saúde. Porém, em geral, apresentam como desvantagem a baixa estabilidade na presença de oxigênio, luz, pH extremos e calor, além de apresentar alto custo de produção (SHAHID; SHAHID-UL-ISLAM; MOHAMMAD, 2013).
Atualmente há um grande interesse pelo desenvolvimento de produtos naturais, visto que as críticas relacionadas aos aditivos utilizados pela indústria estão amplamente disseminadas entre os consumidores. Os corantes artificiais são constantemente questionados quanto a seus efeitos tóxicos, carcinogenicidade e alergias. Já o consumo de corantes naturais, além de não apresentarem efeitos adversos noticiados, propicia os diferentes benefícios funcionais que os pigmentos bioativos podem oferecer (VOLP; RENHE; STRINGUETA, 2009). A lista de corantes orgânicos naturais permitidos no Brasil está disposta no Quadro 3, enquanto as características dos principais corantes utilizados encontra-se no Quadro 4.
Quadro 2: Corantes Orgânicos Naturais permitidos no Brasil. Corantes Orgânicos Naturais
Curcumina Riboflavina
Cochonilha, ácido carmínico Urzela, orceína, orecína,
oreceína Clorofila Caramelo Carvão medicinal Antocianinas -pelargonidina, cianidina -peonidina, delfinidina -petunidina, nalvidina Carotenoides -alfa, beta e gama-caroteno
-bixina, norbixina -capsantina, capsorubina -licopeno -flavoxantina, luteína -criptoxantina -rubixantina -violaxantina -rodoxantina -cantaxantina Vermelho de beterraba, betanina Fonte: BRASIL, 1977
Quadro 3: Características dos principais corantes naturais permitidos para uso no Brasil. Corantes INS Principais fontes
/ Obtenção Coloração Estabilidade
Solubilidade Aquosa
Antocianinas 163
(i; ii) Vegetais e frutas
Vermelho a roxo Instáveis ao calor, luz e oxigênio Solúveis
Betanina 162 Beterraba Vermelho
Instável ao calor, luz e oxigênio Solúvel Caramelo 150 (a-d) Aquecimento de carboidratos Marrom Estável ao
calor e luz Solúvel Carmim/ cochonilha 120 Inseto Dactylopius coccus Vermelho Estável ao calor e luz Pouco Solúvel em baixo pH Carotenoides 160
(a-f) Vegetais e frutas
Amarelo a vermelho Instáveis ao calor, luz e oxigênio Insolúveis
Clorofila 140i Vegetais Verde
Instável ao calor, luz e oxigênio
Insolúvel
Curcumina 100i Curcuma longa
(açafrão-da-terra) Amarelo Instável à luz Insolúvel Fonte: VOLP; RENHE; STRINGUETA, 2009; WROLSTAD; CULVER, 2011;
Os pigmentos naturais, em geral, são conhecidos por apresentarem atividades antioxidantes. Individualmente, diversos estudos são conduzidos a fim de identificar as propriedades benéficas destes compostos bioativos sobre diferentes doenças. As antocianinas, por exemplo, são estudadas em relação à propiedades anti-inflamatórias, anti-carcinogênicas e sobre a saúde dos olhos (HELLSTROM; MATILLA; KARJALAINEN; 2013; KALT et al., 2010). A curcumina demonstrou efeito apoptótico de células cancerígenas da tireoide (SONG et al., 2012), além de exercer efeito sobre a imunidade e sobre componentes lipídicos do sangue (SHA; YAN, 2011). Já os carotenoides, uma das classes de pigmentos com maior distribuição na natureza, são reconhecidos por suas atividades antioxidantes, anti-inflamatória, foto-protetora na pele, anti-carcinogênica e na saúde dos olhos (SOMMER; VYAS, 2012; ABDEL NASSER; OMAYMA, 2013). As estruturas químicas de alguns corantes naturais encontram-se na Figura 2.
Figura 2: Estruturas de alguns pigmentos naturais (SCIFINDER,2015).
3.2.2.1 Carotenoides
Carotenoides são pigmentos lipossolúveis de cores amarelo, laranja ou vermelho, encontrados em plantas, alguns animais, algas, fungos, bactérias e nas cianobactérias. Os animais não tem a capacidade de sintetizá-los, portanto os adquirem através da alimentação. Apresentam como base um esqueleto tetraterpenoide com 40 átomos de carbono, que podem sofrer diversas modificações, tais como ciclização (em uma ou ambas extremidades), hidrogenação, desidrogenação ou adição de grupos laterais possibilitando uma variedade de compostos. Podem ser divididos em carotenos, compostos contendo apenas carbono e hidrogênio, representados por licopeno, α, β e γ-caroteno, ou xantofilas, compostos por hidrogênio, carbono e oxigênio, representados por capsorubina, capsantina criptoxantina, zeaxantina, xantofila e luteína, por exemplo. Em sua estrutura apresentam um sistema de duplas ligações conjugadas, que constitui o grupo cromóforo responsável pela cor (ABDEL NASSER; OMAYMA, 2013). Na Figura 3 são apresentadas as estruturas de alguns carotenoides.
Nos vegetais e plantas, os carotenoides estão presentes nos tecidos fotossintéticos e cloroplastos. Sua cor é mascarada pela maior quantidade de clorofila nestas organelas. Durante o amadurecimento do vegetal, os cloroplastos transformam-se em cromoplastos,
ocorrendo a degradação das clorofilas e maior produção de carotenoides, dando lugar às cores avermelhadas ou amareladas, características do fruto maduro. Os carotenoides apresentam importantes funções como a proteção contra danos foto-oxidativos, são precursores de fitormônios (ácido abscísico e estrigolactonas) e apresentam papel na atração de polinizadores (HANNOUFA; HOSSAIN, 2012).
Figura 3: Estruturas de alguns carotenoides (FERNÁNDEZ-GARCÍA, et al. 2012).
Uma das suas principais funções no organismo humano é atividade pro-vitamina A, onde, por exemplo, α e β-carotenos são convertidos a vitamina A na mucosa intestinal. Porém, nem todos os carotenoides apresentam esta função, apenas aqueles que possuem em sua estrutura o anel β–ionona. Além disso, também são responsáveis por ações benéficas como a diminuição no risco de certos tipos de câncer, doenças cardiovasculares, cataratas e degeneração macular. Devido à presença de duplas ligações conjugadas, estas substâncias apresentam ação antioxidante, atuando nas células contra a ação de radicais livres, e estabilização de oxigênio singlete (RIOS;ANTUNES; BIANCHI, 2009).
As xantofilas zeaxantina e luteína são reconhecidamente relacionadas à saúde dos olhos, estando presentes na retina. Estão presentes também na pele, onde apresentam um
papel essencial na proteção contra a luz do sol. Como os carotenoides não são sintetizados pelo organismo humano, a única forma de obtenção destes compostos é pela dieta do indivíduo, sendo essencial o seu consumo (KIJLSTRA et al., 2012).
Diversos estudos têm demonstrado a ação benéfica dos carotenoides. Liang et al. (2012) relacionaram o consumo de licopeno por ratas ovariectomizadas à diminuição da perda óssea, comparadas ao grupo que não recebeu licopeno. Em estudo de Maoka et al. (2011), os carotenoides capsantina e capsorubina isolados de pimentões, demonstraram grande poder antitumoral in vitro. In vivo, demonstraram a diminuição da incidência de papilomas em ratos.
Zhang, et al. (2011) observaram os efeitos antitumorais dos carotenoides β-caroteno, capsantina, bixina e astaxantina sobre células de leucemia. Todos os carotenoides estudados demonstraram diminuir a viabilidade celular, interferiram na progressão do ciclo celular e induziram apoptose de modo dose-dependente.
3.3 PIGMENTOS DO PIMENTÃO VERMELHO
O pimentão (Capsicum anumm, L) é um vegetal muito conhecido e utilizado na culinária mundial. Apresenta diversas colorações como verde, amarelo, vermelho, roxo, dentre outras. Além de apresentar sabor marcante, é também uma ótima fonte de nutrientes e compostos bioativos, como os carotenoides. O pimentão vermelho apresenta alto poder de coloração devido à presença de carotenoides presentes em sua polpa, dentre eles capsorubina e capsantina, responsáveis pela cor vermelha (AZEVEDO-MELEIRO;RODRIGUEZ-AMAYA, 2009).
Topuz et al. (2011), ao analisarem a páprica, condimento avermelhado obtido por meio da desidratação e da moagem de diferentes variedades de pimentões, identificaram oito carotenoides em sua constituição, dentre eles: capsantina, capsorubina, violaxantina, mutatoxantina, zeaxantina, capsoluteína, β-critptoxantina e β-caroteno. O carotenoide capsantina, responsável pela cor vermelha, foi o principal componente encontrando, correspondendo a 56% do conteúdo total de carotenoides.
Azevedo-Meleiro e Rodriguez-Amaya (2009) identificaram os principais carotenoides contidos nos pimentões vermelho e amarelo. Neste sentido, a capsantina, luteína, β-caroteno e a violaxantina foram os carotenoides majoritários no pimentão vermelho. No entanto, também foram identificados os carotenoides capsorubina, β-apo-8’-carotenal, anteraxantina, zeaxantina e β-criptoxantina em menores concentrações.
Em estudo anterior do nosso grupo de pesquisa, foram identificados no extrato de pimentão vermelho os carotenoides capsantina, capsorubina, β-criptoxantina, β-caroteno e os isômeros 13-cis-β-caroteno e 9-cis-β-caroteno. Capsantina e β-caroteno foram os pigmentos predominantes neste extrato (GOMES et al., 2014).
Além de ser uma matriz rica em carotenoides, o cultivo do pimentão é um dos mais difundidos em todo o território nacional, sendo considerada uma das dez espécies de maior importância no mercado de hortaliças cuja produção anual atinge, aproximadamente, 249.000 toneladas. Segundo o último Censo Agropecuário conduzido pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, seu cultivo concentra-se na região Sudeste do país, principalmente no estado de São Paulo que chega a 48.585 toneladas, sendo o maior produtor do país atualmente (IBGE, 2006). Em relação à agricultura mundial, a China é o maior produtor de pimentões, sendo responsável por 51% da produção, seguido por México e Turquia (7% cada), Indonésia (5%), Espanha e Estados Unidos (3% cada), sendo 24% produzido pelo restante do mundo (UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE, 2013).
3.4 ESTABILIDADE DOS CAROTENOIDES FRENTE A FATORES DO PROCESSAMENTO E ARMAZENAMENTO DE ALIMENTOS
É imprescindível que os pigmentos naturais sejam estáveis durante todas as etapas do processamento de alimentos até a estocagem, resultando em um produto final de qualidade e que apresente características sensoriais satisfatórias às necessidades dos consumidores. A baixa estabilidade dos corantes naturais utilizados pela indústria frente aos fatores de processamento e armazenamento como variação de pH, hidratação, tratamento térmico, exposição à luz, e em alguns casos, baixa solubilidade aquosa, suscita a necessidade do desenvolvimento de pesquisas e novas tecnologias que facilitem a sua aplicação industrial mais ampla (GHIDOUCHE et al., 2013).
Os carotenoides são exemplos de corantes naturais que apresentam alta instabilidade durante o processamento de alimentos. Topuz et al. (2011) observaram que, de acordo com o método de secagem do purê de pimentões para produzir a páprica, o conteúdo final de carotenoides modificava-se, havendo perdas na quantidade total de carotenoides ao serem comparados às amostras não processadas. Para a secagem das amostras foram utilizados quatro métodos de secagem: liofilização a -70ºC por 8 dias; secagem em estufa ventilada a 60ºC por aproximadamente 7 horas; Refractance Window™Drying (RWD), método onde o alimento é disposto em uma esteira que passa sobre o vapor de água, retirando a umidade do
alimento; e o método natural, onde os pimentões in natura eram cortados e dispostos em cordas, sob temperatura ambiente e sombra. Os primeiros três métodos de secagem resultaram em diminuição no conteúdo final de carotenoides das amostras. O pimentão submetido ao método natural, onde era apenas subdividido em partes menores, pareceu reter o conteúdo de pigmentos, dificultando sua perda. Além disso, segundo o autor, exibiram maiores concentrações de carotenoides, que podem ser explicadas pela ocorrência da sua síntese durante o método natural, que apresenta baixa temperatura e método lento de secagem.
Arslan e Ozcan (2011) observaram a mudança da coloração de fatias de pimentão vermelho submetidas ao calor por meio de forno micro-ondas, forno convencional e pela luz do sol. As amostras apresentaram mudança nos valores de L*, a* e b*, que indica a mudança na cor das amostras. Após secagem ao forno (50 a 70ºC), os valores de L* (luminosidade) diminuíram, sendo justificados pela formação de pigmentos castanhos, derivados da grande quantidade de açúcares redutores e aminoácidos nos pimentões (reação de Maillard). Valores de L* para secagem ao micro-ondas não variaram, e estiveram mais altos nos pimentões expostos ao sol. Os valores de a* (negativo = verde, positivo = vermelho) foram mais altos nas amostras expostas a luz do sol e frescas, e diminuíram nas submetidas ao forno micro-ondas e convencional. Os valores da variável b* (negativo = azul, positivo = amarelo) aumentaram também para a luz e micro-ondas e, para forno convencional, não variaram significativamente. Os autores concluíram que as altas temperaturas e a secagem por convecção, características do forno convencional, levaram a redução na luminosidade, e na cor vermelha e amarela das amostras.
Fratianni, Cinquanta e Panfili (2010) analisaram a degradação dos carotenoides de suco de laranja após a submissão ao aquecimento em micro-ondas em diferentes intervalos de tempo e temperatura. Foi observada maior instabilidade dos carotenoides violaxantina e anteraxantina em 60 e 70°C por 10 minutos. Já os carotenoides precursores de vitamina A, (β-caroteno, β-criptoxantina e α-caroteno) e a luteína foram mais estáveis. Ao serem submetidos a 85°C por 1 minuto, houve degradação de 50% dos carotenoides da amostra, evidenciando a instabilidade desses compostos em temperaturas mais elevadas. Segundo Lin e Chen (2005), a temperatura de armazenamento também influencia a concentração de carotenoides. Em seu estudo, amostras de suco de tomate foram armazenadas a 4°C, 25°C ou 35°C por 12 semanas, e o tempo de degradação dos carotenoides foi inversamente proporcional ao aumento da temperatura de armazenamento dos sucos de tomates.
Çinar (2004) analisou a degradação dos carotenoides extraídos de cenouras, casca de laranja e da batata doce durante o armazenamento por 45 dias em temperaturas de 4°C, 25°C
(na presença e ausência de luz) e 40ºC. Foi observada uma maior manutenção da concentração de carotenoides no armazenamento à 4ºC, e maior perda à 40ºC. Além disso, não foi observada diferença significativa entre a perda de carotenoides na presença ou ausência de luz.
Outro fator que dificulta o emprego de carotenoides na indústria de alimentos é sua baixa solubilidade em água. Esta característica se deve ao fato de os carotenoides serem moléculas lipossolúveis, o que dificulta sua incorporação em alimentos, já que a grande maioria dos produtos alimentícios é de base aquosa (FERNÁNDEZ-GARCÍA, et al. 2012).
3.5 MICROENCAPSULAÇÃO APLICADA A ALIMENTOS
Uma das alternativas para modificar a estabilidade e solubilidade dos pigmentos é a encapsulação, metodologia na qual a substância ativa é inserida em um material de parede, que pode ser de diversos tamanhos, núcleos e finalidades. As cápsulas geradas são divididas em 3 categorias: macro- (>5.000 µm), micro- (0,2-5.000 µm) e nanocápsulas (<0,2 µm). Em termos estruturais, as cápsulas podem ser divididas em dois grupos: aquelas nas quais o núcleo está localizado na região central, envolto por um filme definido e contínuo do material de parede, e aquelas nas quais o núcleo é uniformemente disperso em uma matriz (AZEREDO, 2005).
A encapsulação em produtos naturais tem como objetivo proteger a substância de interesse dos fatores externos como luz, temperatura, acidez ou alcalinidade, prover solubilidade em água, ou seja, possibilitar que as substâncias sabidamente sensíveis a estes fatores possam ter seu uso viabilizado em alimentos, cosméticos e medicamentos. Na indústria de alimentos, a encapsulação pode ser utilizada para diversos fins, como: impedir interação do núcleo com o ambiente externo, proteger o material encapsulado contra alterações na cor, aroma e valor nutricional durante o processamento e estocagem, promover sua solubilidade e mascarar sabores indesejáveis, e realizar a entrega da substância em seu tecido alvo (NEDOVIC, et al. 2011).
Há uma gama de compostos com objetivo de enriquecer os produtos alimentícios, trazendo diversos benefícios funcionais e nutricionais. Diversas substâncias bioativas e micronutrientes podem ser microencapsulados e aplicados na indústria. Alguns exemplos são os carotenoides, polifenóis, ácidos graxos essenciais, aminoácidos, proteínas, fitoesteróis, vitaminas, minerais e bactérias probióticas (SAGALOWICZ; LESER, 2010).
Inúmeras técnicas para a encapsulação estão disponíveis, e podem variar de acordo com as características da substância de interesse e do produto a ser adicionado. A preparação de emulsões óleo-em-água, por exemplo, é a mais indicada para moléculas lipossolúveis, podendo ser utilizadas em leites, iogurtes, molhos e maioneses. Já o spray drying é um dos métodos mais utilizados onde o material a ser encapsulado é dissolvido em uma solução aquosa do composto que constituirá a membrana e em seguida é atomizado em pequenas gotas que passarão por um fluxo de ar quente, secando-as e formando partículas sólidas. Além destes, existem outras técnicas como a coacervação, extrusão, liofilização, spray-cooling, lipossomas, e a inclusão molecular, técnica de interesse do presente trabalho (DE VOS et al., 2010).
3.5.1 Inclusão molecular e ciclodextrinas
A técnica de inclusão molecular, ao contrário dos outros métodos, ocorre em nível molecular, e utiliza como agente encapsulante as ciclodextrinas. As ciclodextrinas atuam como uma cápsula, pois sua conformação apresenta uma cavidade hidrofóbica e o exterior hidrofílico, permitindo que atuem como “moléculas hospedeiras”. Seu interior hidrofóbico permite a inserção de diversas substâncias apolares, como ácidos graxos, óleos vegetais e essenciais, vitaminas e hormônios. As ciclodextrinas são comumente utilizadas, servindo como veículo para diversos fármacos, propiciando sua solubilidade em meio aquoso e liberação da droga no sistema biológico (BOONYARATTANAKALIN et al., 2010).
Em alimentos as ciclodextrinas são utilizadas para a estabilização de sabores e aromas, eliminação de sabores indesejados, proteção contra a ação de microrganismos, proteção de moléculas lipofílicas da oxidação, degradação pela luz e aquecimento e solubilização de pigmentos naturais e vitaminas (ASTRAY et al., 2009).
As ciclodextrinas são oligossacarídeos cíclicos compostos por unidades de glicose unidas por ligações glicosídicas do tipo α-1,4, sendo produzidas por meio da transformação do amido pela enzima glucosil transferase, sintetizada por bactérias como Bacillus macerans. As ciclodextrinas mais utilizadas são a α, β, e γ constituídas por 6, 7 ou 8 unidades de glicose, respectivamente. A quantidade de moléculas de glicose determinam o tamanho da cavidade das ciclodextrinas, e consequentemente, a capacidade de incorporar moléculas que apresentem compatibilidade geométrica com seu interior. Além disso, o complexo ocorre
apenas se houver afinidade em termos de polaridade (SAGALOWICZ ;LESER, 2010). A Figura 4 demonstra as estruturas da α-, β- e γ-ciclodextrinas.
Figura 4: Estruturas químicas de α-, β- e γ-ciclodextrinas (ASTRAY et al. 2009)
A formação do complexo de inclusão consiste na inserção da molécula hospedeira (mais apolar) em seu interior, substituindo as moléculas de água (polar) que antes permaneciam ali, por ser uma interação energeticamente favorável. Além das interações hidrofóbicas também podem estar presentes no processo de complexação as ligações de hidrogênio, forças de Van der Waals, interações dipolo-dipolo e íon-dipolo (CASTRONUOVO; NICCOLI, 2013).
As ciclodextrinas são encapsulantes amplamente utilizados e produzidos em grande escala. Existe uma grande variedade de ciclodextrinas disponíveis no mercado, porém a mais utilizada atualmente é a β-ciclodextrina (β-CD), provavelmente devido à facilidade em sua produção, baixa toxicidade e ao seu baixo custo (cerca de 5 US$/kg). Entretanto, a β-CD apresenta como principal inconveniente a baixa solubilidade em água, associada a sua estrutura molecular. Acredita-se que suas dimensões moleculares são ótimas para a formação de ligações de hidrogênio intramoleculares que neutralizam a hidratação da β-CD em água, reduzindo sua solubilidade. A solução encontrada para este problema foi a substituição das hidroxilas presentes na parte externa da β-CD por porções orgânicas causando a quebra das ligações de hidrogênio, aumentando a solubilidade da molécula. (KURKOV; LOFTSSON, 2013)
Alguns desses derivados das ciclodextrinas são a 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (HP-β-CD) e sulfobutil-eter-β-ciclodextrina, que além de serem mais solúveis em água, apresentam melhores perfis toxicológicos, ao serem comparadas as suas moléculas-mãe, e
podem ser utilizadas até como formas injetáveis (BREWSTER; LOFTSSON, 2007). Na Figura 5 é exemplificada a distribuição das principais ciclodextrinas utilizadas em drogas comerciais.
Além de aumentar a solubilidade de diversas substâncias em água, alguns estudos relataram o aumento da atividade antioxidante dos compostos pelas ciclodextrinas, provavelmente pela proteção que esta oferece às substâncias hospedeiras contra o ataque de radicais livres. Complexos de carotenoides:β-CD (GOMES, 2014) mangiferina:β-CD (FERREIRA et al. 2013) e astaxantina:HP-β-CD (YUAN et al. , 2013) são exemplos deste aumento na atividade antioxidante.
Figura 5: Distribuição das principais ciclodextrinas utilizadas em drogas comerciais.: β-ciclodextrina, hidroxipropil- β-β-ciclodextrina, , hidroxipropil- γ -ciclodextrina ,
sulfobutil-éter-ciclodextrina (KURKOV ; LOFTSSON, 2013).
A toxicologia das ciclodextrinas varia entre os diferentes tipos, e principalmente pela forma de administração. Por exemplo, as ciclodextrinas administradas oralmente não demonstram praticamente nenhuma toxicidade, devido à falta de absorção intestinal. Já a administração parenteral de β-CD, α-CD, β-CD metiladas, resulta em toxicidade renal. HP-β-CD, sulfobutil-éter-βHP-β-CD, γ-CD e Hidroxipropil-γ-CD não apresentam toxicidade por esta via de administração (KURKOV; LOFTSSON, 2013).
3.5.2 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina
A 2-hidroxipropil-ciclodextrina resulta da modificação da estrutura da β-ciclodextrina pela substituição de hidroxilas por grupo hidroxipropil (C3H7O). A HP-βC-D é reconhecida por oferecer maior solubilidade em meio aquoso quando comparada à β-CD
(WANG et al., 2011). Lu et al. (2009), compararam a eficácia de β-CD e HP-β-CD em aumentar a solubilidade do resveratrol em água. O complexo resveratrol/HP-β-CD apresentou maior capacidade de solubilidade e a constante de estabilidade (KC) foi de 6.778 M
−1 , em comparação a 1.815 M−1 para o complexo β-CD, além de ter apresentado maior atividade antioxidante, analisada por meio do ensaio de DPPH.
Diversos estudos, tanto de fármacos quanto de substâncias bioativas para uso em alimentos, mostraram a capacidade da HP-β-CD em formar o complexo de inclusão, promover a solubilidade do composto e protegê-lo contra os fatores presentes no meio (WANG et al., 2011; ZENG et al., 2011; GE et al., 2012, MA et al., 2012), demonstrando que esta é uma tecnologia promissora, com uma ampla gama de aplicação.
4. METODOLOGIA
4.1 PROCESSAMENTO E OBTENÇÃO DO EXTRATO DE PIMENTÃO VERMELHO
Foram utilizados aproximadamente quatro quilogramas de pimentão vermelho maduro, adquiridos em mercados da cidade de Niterói, Rio de Janeiro. Os pimentões foram higienizados, separados dos talos, cortados em tiras e submetidos à moagem em liquidificador industrial. À polpa moída foram adicionados dois litros de solução etanol:água (9:1, v/v) (MEIRELES, 2008). A polpa permaneceu em maceração em um erlenmeyer de 5 litros, sendo trocado o solvente em dias alternados até exaustão da cor. As imagens relativas ao processamento do pimentão vermelho e obtenção do extrato encontram-se nas Figuras 7 e 8, respectivamente.
Figura 7: Etapas envolvidas no processamento do pimentão: pimentão vermelho in natura (a), pimentão após corte (b), pimentão triturado (c), pimentão em maceração (d) e pimentão após
esgotamento (e).
O solvente foi separado da matriz em centrífuga (Hanil Combi 514-R) a 3000 rpm, por 15 minutos a 4ºC, e filtrado a vácuo para a separação de partículas, dando origem ao extrato em meio hidro-alcoólico. Este extrato foi submetido à partição com hexano. Para acelerar o processo de partição, foram adicionados à mistura 100 mL de solução de cloreto de sódio a 10% (m/v). O processo de extração foi realizado até esgotamento, ou seja, até cessar a
transferência de pigmentos entre as fases. A fase apolar foi submetida à evaporação em rotaevaporador (Fisatom), à baixa pressão e temperatura de 35ºC a fim de concentrar o extrato, sendo a fase aquosa descartada. As etapas de extração foram realizadas ao abrigo de luz e o extrato foi pesado para determinação do rendimento.
Figura 8: Obtenção do extrato: partição com hexano (a), esgotamento da partição (b), evaporação do solvente (c), extrato de pimentão (d).
4.2 INCLUSÃO MOLECULAR DO EXTRATO DE PIMENTÃO VERMELHO EM HIDROXIPROPIL-Β-CICLODEXTRINA
Foram testadas quatro diferentes proporções entre o extrato de pimentão vermelho e a HP-β-CD (Sigma Aldrich) para a formação dos complexos (1:4, 1:6, 1:8 e 1:10, extrato:ciclodextrina, m/m), visando identificar aquela que apresentaria maior rendimento e eficiência de inclusão. Para a preparação do complexo foi fixada a quantidade de 0,8 g de HPβCD, variando-se a quantidade de extrato de pimentão vermelho, de acordo com a
