Caracterização dos materiais

2.10.1. Microscopia eletrônica de varredura e Espectroscopia de energia dispersiva de raios-X

O pó do CIV foi disperso em solução de 50% de álcool etílico e 50% de água destilada em uma lâmina de vidro e levado à estufa de secagem (FANEM, São Paulo, SP, Brasil). Pequenas quantidades de mfC e nfC foram imersas em água destilada por 30 min, sob leve agitação, e foram tratadas com concentrações crescentes (50, 70, 95 e 100%) de solução de acetona (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA).

O pó, as fibras, e amostras representativas dos grupos experimentais do CIV e dos compósitos desenvolvidos foram recobertos com uma fina camada de ouro-paládio. Os materiais preparados foram observados através de microscopia eletrônica de varredura (MEV), usando feixe de elétrons de 10 a 15 kV (CS-3500, Shimadzu, Kyoto, Japão). A análise elementar qualitativa de microrregiões das amostras foi realizada, através de espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDS), (CS3200, Oxford, Oxfordshire, Inglaterra).

2.10.2. Microscopia eletrônica de transmissão

Uma suspensão de nanofibrilas de celulose foi obtida a partir de dispersão aquosa (0,01% m/v). As imagens das nanofibrilas foram realizadas através da microscopia eletrônica de transmissão (MET) no equipamento FEI Tecnai G2-Spirit (Hillsboro, Oregon, USA). O material foi depositado em uma grade de cobre de 300 mesh coberta com Formvar/Carbono. As amostras foram, subsequentemente, tratadas com acetato de uranila 2% para aumentar o contraste das microfibrilas à microscopia eletrônica de transmissão.

2.10.3. Difração de raios-X

Amostras dos materiais de cada grupo foram submetidas à difração de raios-X (DRX), no difratômetro (modelo RXD6000 Shimadzu, Kyoto, Japão), com radiação monocromatizada KαCu (1,5406Aº) e tubo operacional com voltagem de 40 kV e corrente de 30 mA com velocidade de varredura e intervalo de 80o.

2.10.4. Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier

Espectros de amostras dos materiais foram obtidos com 32 varreduras, no intervalo entre 675 à 4000 cm-1, com resolução de 4 cm-1 e unidades de absorbância (abs), através de espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) pela técnica da reflectância total atenuada (ATR), (Nicolet 6700, Thermo Electron Scientific Instruments Corp., Madison, WI, USA).

Houve diferença estatisticamente significativa de GC em relação a G1, G2 e G3 para o módulo de elasticidade durante o teste de resistência à compressão (p=0,029) e para o teste de microdureza (p=0,001). O teste post-hoc de Tukey mostrou diferença estatisticamente significativa para o módulo de elasticidade à compressão entre GC e G3 (p=0,016), (Tabela 1), e para o teste de microdureza entre G1 e G3 (p=0,002) e entre G2 e G3 (p=0,003), (Tabela 2).

Houve diferença estatisticamente significativa de GC em relação a G01, G02, G03, G04 e G05 para os testes de resistência à compressão (p<0,001) e seu módulo de elasticidade (p<0,001), resistência à tração diametral (p=0,006), microdureza (p<0,001) e resistência ao desgaste (p=0,017). O teste post- hoc de Tukey para o teste de resistência à compressão mostrou diferença estatística significativa (p<0,001) entre GC e G04, G01 e G04, G02 e G04, G03 e G04, e G04 e G05. Quanto à resistência à tração diametral houve diferença estatisticamente significativa entre GC e G05 (p=0,013) e G03 e G05 (p=0,017). Para o módulo de elasticidade durante o teste de resistência à compressão, mostrou diferença estatisticamente significativa (p<0,001) entre GC e todos os outros grupos (Tabela 1). O teste post-hoc de Tukey para o teste de microdureza mostrou diferença estatisticamente significativa entre GC e todos os outros grupos: GC e G01 (p=0,001), GC e G02 (p=0,001), GC e G03 (p<0,001), GC e G04 (p<0,001) e GC e G05 (p<0,001). Houve diferença estatisticamente significativa para a resistência ao desgaste entre G01 e G04 (p=0,009), (Tabela 2).

As médias e desvios-padrão de cada um dos grupos de CIVmfC e CIVnfC em relação a CIV (controle), quanto a todos os testes realizados, podem ser visualizados nas tabelas 1 e 2.

As micrografias de MEV da fibra de celulose do eucalipto original mostraram um aglomerado de fibras longas, de forma cilíndrica (fig. 1A) e aspecto rugoso, com a presença de estrias e lacunas em toda sua extensão (fig. 1B). As mfC apresentaram-se com tamanho heterogêneo e características semelhantes às fibras originais (fig. 1C e 1D). Algumas delas não mantiveram a forma cilíndrica, apresentaram aspecto laminar (fig. 1D). Na micrografia de MEV as nfC mostraram-se em forma de placas de diferentes tamanhos (fig. 1E) e na micrografia de MET apresentou-se como nanocristais individuais, de tamanho uniforme, e alguns agregados (fig. 1F). A partir de várias outras imagens de MET, os valores médios do comprimento e do diâmetro dos nanocristais isolados foram determinados como sendo 145 (± 25 nm) e 6 (± 1,5 nm), respectivamente, apresentando uma razão de forma aproximada de 24.

Nas micrografias de MEV o pó do CIV mostrou-se constituído de partículas irregulares (fig. 2A). Em amostras representativas dos compósitos (fig. 2) observou-se a morfologia do CIV (GC) com matriz envolvendo partículas de tamanho heterogêneo e a presença de algumas bolhas (fig. 2B). As superfícies de fratura de compósitos CIVmfC com 0,010 g de mfC (G2) mostraram presença de mfc e partículas de vidro na matriz do cimento ionomérico modificado (fig. 2C e 2D). A superfície de CIVnfC 0,4% (G04) mostrou nfC de tamanho uniforme e com distribuição aleatória na matriz gelatinosa (fig. 2E). As nfC mostraram-se interligadas, além de aderidas também às partículas de carga do CIV (fig. 2F).

Os espectros de EDS das mfC e nfC foram similares ao das macrofibras de celulose (fig. 1A), que mostraram picos de alta intensidade de Carbono (C) e Oxigênio (O) correspondentes à constituição da celulose. O espectro de EDS do pó de CIV (fig. 2A) apresentou picos de alta intensidade de Cálcio (Ca), Flúor (F), Alumínio (Al) e Silício (Si). O espectro de CIV mostrou os mesmos picos do espectro do pó correspondentes à sua carga inorgânica, além de picos de C e O da matriz orgânica do cimento. Os espectros de CIVmfC e de CIVnfC apresentaram o mesmo padrão do espectro do CIV. Picos de Ouro e de Paládio, provenientes da metalização dos materiais, também podem ser visualizados, entretanto não foram identificados nos espectros.

A estrutura das fibras e dos compósitos foi analisada pelos espectros gerados pela DRX (fig. 3). Na análise qualitativa de DRX das fibras de celulose originais observou-se que seu difratograma mostrou características típicas de um material com fase amorfa e cristalinidade parcial. Os difratogramas das microfibras e, principalmente, das nanofibrilas indicaram diminuição da fase amorfa (fig. 3A). Os compósitos CIVmfC (G1 a G3) apresentaram grande halo nos difratogramas correspondente à fase amorfa, similar àquele do difratograma do cimento ionomérico (GC), (fig. 3B). Os compósitos CIVnfC também mostraram difratogramas característicos, com grande quantidade de material amorfo, como o CIV (GC), com exceção de G04, que praticamente não apresentou fase amorfa e mostrou pico cristalino de baixa intensidade (fig. 3C).

Nos espectros de FTIR da fibra de celulose original (fig. 4) observou-se a presença de bandas de absorção referentes aos grupamentos –0H, em 3409, 3339 e 3276 cm-1; banda referente a –CH3 dos grupamentos metílicos em 2896 cm-1; bandas em 1428 cm-1 dos grupamentos metilênicos (–CH2); bandas em 1370 e 1278 cm-1 referentes a C–H; bandas 1337 e 1206 cm-1 correspondentes a C–OH; e das bandas 1161, 1065 e 1034 cm-1correspondentes aos grupamentos C–O–C da estrutura sacarídea, atribuída a celulose e hemicelulose. As mfC e nfC apresentaram o mesmo padrão de espectros de FTIR da fibra de celulose original. O espectro de FTIR do pó de CIV mostrou banda intensa dos grupamentos COO-, correspondente à presença de ácido poliacrílico liofilizado no pó. O compósito CIV (GC) mostrou bandas dos grupamentos Si–OH livres em 3650 e 3680 cm-1 e Si–OH em 3200 e 3450 cm-1 referentes à água absorvida e/ou referentes a ligações de H aos grupos Si–OH; bandas referentes aos grupamentos C–O em 1637 cm-1; dos grupamentos COO-(n+)(n = Al3+ e Ca2+) em 1585 cm-1 e de COO-Ca+ em 1456 e 1410 cm-1; de Si–OH em 957 a 970 cm-1; e de Si–O–Si em 800 a 810 cm-1. Nos espectros dos compósitos mfC (G1, G2 e G3) e dos compósitos nfC (G01, G02, G03, G04 e G05) observou-se bandas de absorção características de seus materiais precursores.

Zonas de inibição não foram observadas nos compósitos CIVmfC e CIVnfC frente a todos os microrganismos utilizados na atividade antimicrobiana. Os compósitos desenvolvidos mostraram o mesmo comportamento do CIV, não apresentando halo de inibição frente aos microrganismos analisados. Já a Clorexidina (controle positivo) apresentou halo de inibição frente a Staphylococcus

aureus (14 mm), Streptococcus mutans (16,5 mm), Enterococcus faecalis (14 mm), Escherichia coli

(15,5 mm), Pseudomonas aeruginosa (6 mm) e Candida albicans (6 mm). 4. Discussão

As propriedades finais dos cimentos ionoméricos são diretamente influenciadas pela proporção pó:líquido, de acordo com a norma ISO 9917-1:2007 [21] e, principalmente, pelas características intrínsecas do agente de reforço e não apenas pelo aumento do seu teor de carga [22-24]. Um aumento da viscosidade desses cimentos pode aumentar sua resistência final, entretanto, pode interferir negativamente na sua manipulação, tempo de trabalho, tempo de presa e adesão [27,28]. Sabe-se que o sucesso no desenvolvimento ou modificação de compósitos depende do equilíbrio entre as propriedades físico-químicas originais e aquelas com desempenho superior às de seus componentes formadores. Para tal, torna-se necessário encontrar uma concentração ideal de fibras, diminuindo assim a friabilidade dos compósitos [10,25,26]. O acréscimo de fibras na constituição do cimento aumentou a resistência dos compósitos desenvolvidos, tanto nos modificados por microfibras (G1 e G2) como em todos aqueles modificados por nanofibrilas, que não apresentaram dificuldades quanto à aglutinação e tempo de trabalho, respeitando as características clínicas relevantes do material. Apenas a concentração de fibras adicionadas na matriz do G3 aumentou negativamente sua viscosidade.

Uma concentração excessiva de fibras, de um modo geral, não melhora as propriedades mecânicas do compósito, ao contrário, funcionam como um ponto crítico para a resistência final do material [29]. Nos testes avaliados neste estudo, os resultados encontrados nos compósitos CIVmfC não diferiram daqueles do CIV, exceto no G3 que apresentou aumento significativo do módulo de elasticidade à compressão. Provavelmente, tanto no G3 como nos outros grupos, que também apresentaram os módulos de elasticidade à compressão e tração aumentados, a adição de fibras ocasionou um aumento da sua energia interna, suportando força maior que a do CIV até o seu limite de proporcionalidade. Entretanto, as concentrações usadas nos compósitos CIVmfC não contribuíram para melhorar as demais propriedades finais dos mesmos. Isto pode estar associado à estrutura mais compacta das mfC com diminuição da área de superfície, dificultando a interação da celulose com os componentes da matriz e a consequente capacidade de transmissão de forças [16,17]. Resultados diferentes foram relatados por Silva et al., 2013 [10], que encontraram aumento no valor de resistência à compressão e ao desgaste de CIV modificado com três concentrações de macrofibras celulósicas. Estas, por apresentarem estrutura oca, foram preenchidas pela matriz ionomérica, ocorrendo maior facilidade de interação entre seus componentes e os do cimento.

Neste estudo, as menores concentrações de nfC acrescidas aos compósitos foram responsáveis pelos melhores resultados de resistência. O aumento do módulo elástico se deve puramente ao fato da incorporação de nanofibrilas de celulose que exibem um módulo de elasticidade de 120-150 GPa [30]. Dentre os grupos de compósitos CIVnfC, o G04 apresentou resistência à compressão equivalente a um

cimento modificado por resina [31] e o G05 aumentou significativamente a tração diametral do compósito, que apresentou resultados muito superiores à cimentos ionoméricos de alta viscosidade [32,33]. Isto pode ser explicado pela natureza significativa de auto associação das nanofibrilas de celulose, o que é vantajoso para a formação de arquiteturas de suporte de carga de percolação dentro da matriz cimentícea, pois apresentam a formação de redes de nanofibrilas rígidas em que a transferência de esforço é facilitada pela ligação do hidrogênio entre elas [34], além da presença de interações de van der Waals [35].

Uma das maiores desvantagens dos cimentos ionoméricos restauradores convencionais é o fato de apresentarem baixa resistência à abrasão e tração diametral, principalmente quando comparados a outros materiais restauradores como resina composta, amálgama e os próprios cimentos ionoméricos modificados por resina. Desse modo evita-se seu uso em restaurações sujeitas a grandes áreas de desgaste e alto esforço mastigatório [25]. O aumento da resistência à tração diametral de materiais friáveis, como o CIV, é extremamente difícil [33,36]. Portanto, o aumento dessa propriedade nos compósitos desenvolvidos neste estudo é um grande achado clínico, visto que os cimentos ionoméricos devem ser suficientemente fortes para resistir aos esforços gerados no interior de sua estrutura, quando carregados com forças oclusais mastigatórias.

Apesar de melhorar as propriedades finais de modo geral, percebeu-se que o acréscimo de pequena quantidade de nfC, foi responsável pelo menor desgaste apresentado pelos compósitos CIVnfC em relação ao CIV. Fato semelhante foi observado no teste de microdureza, no qual o acréscimo de uma menor quantidade de nfC no G05 não interferiu no seu valor de microdureza Vickers, diferente daqueles valores apresentados com a adição de concentrações maiores. O resultado de maior dureza superficial apresentado por G05 e de menor desgaste apresentado pelo G05 e pelo G04, embora não estatisticamente significativo, pode ser explicado pela presença de um número maior de partículas de vidro na superfície desses compósitos. Por outro lado, o acréscimo de quantidades mais elevadas de nfC diminuiu os valores de microdureza e de resistência ao desgaste, devido ao enfraquecimento do compósito [37] pela presença de maior quantidade de fibras na superfície [38].

De forma simplificada, pode-se inferir que a dureza, apesar de não ser uma propriedade intrínseca de um material dentário, é a mensuração da sua resistência à penetração e pode ser considerada um indicativo direto da sua resistência ao desgaste na cavidade bucal [25]. Por ser um material friável, o teste padrão mais indicado para verificação da dureza do cimento inomérico é a dureza Vickers. Entretanto, com o aumento de fibras na superfície dos novos compósitos modificados e aumento do seu módulo de elasticidade à tração diametral, novo estudo usando o teste de dureza Knoop pode ser mais interessante, uma vez que este desconsidera a possível deformação elástica que o material pode apresentar durante a penetração por um indentador de diamante [25]. Talvez seja também mais adequada a avaliação da nanodureza, e não microdureza, dos compósitos modificados com nfC [39].

Em comparação com as fibras de celulose originais, o método de obtenção utilizado modificou a superfície das mfC pela diminuição de seu tamanho, como também proporcionou a abertura do seu formato cilíndrico macro. Entretanto, a análise das micrografias de MEV juntamente com as outras caracterizações realizadas não mostrou indícios de maior interação das mfC com a matriz cimentícea, do CIV. Apesar da diminuição das mfC, o tratamento químico não foi suficiente para a quebra da sua estrutura macrofibrilar e microfibrilas. Assim, os compósitos modificados com as concentrações de mfC utilizadas neste estudo, mesmo com a capacidade de apresentar massa de cimento estável e viscosidade adequada para compactação, não se apresentaram como uma boa alternativa para a modificação do CIV.

O formato laminar bem fino das nfC, também relatado por Peng et al., 2012 [40], facilitou sua dispersão homogênea no líquido do CIV e sua inserção e distribuição mais uniforme em toda a massa cimentícea. As micrografias de MEV dos compósitos CIVnfC mostraram um agregado fibrilar de nanopartículas entremeadas na matriz do CIV, conferindo-lhe aspecto de ''teia'' e sugerindo a formação de um único complexo, o que nos remete à completa interação das nanofibrilas com a matriz cimentícea e suas partículas de pó não atacadas. Nos compósitos CIVnfC observou-se formação dessa trama envolvendo nanofibrilas, matriz cimentícea e partículas de carga, sendo que a distribuição de nfC na massa de CIV mostrou-se mais homogênea no compósito CIVnfC 0,4%. A concentração usada nestes compósitos pode ter propiciado uma interação ideal entre os próprios cristais e com a massa cimentícea durante sua reação química, com a formação de uma real rede de reforço, considerando que

o tratamento com ácido sulfúrico proveu a superfície das fibras com grandes quantidades de grupamentos COO-.

O aparecimento de agregados com cristais unidos lateralmente nas imagens de MET provavelmente resulta em diminuição da área superficial e fortes ligações de hidrogênio estabelecidas entre os nanocristais. Estes agregados podem se formar em suspensão e feixes de cristais podem ser ainda mais numerosos, quando o meio de dispersão é removido, como no caso da preparação da amostra para MET [41]. Entretanto, sua dispersão em meio polar torna-se facilitado pelas suas características superficiais, devido ao ácido sulfúrico usado na hidrólise. A mistura, composição, e dispersão uniforme em não-polares ainda é desafiador [26,42]. A adição das nfC ao líquido do CIV se mostrou uma excelente alternativa, com dispersão completa e homogênea, visto que não interferiu na fluidez do líquido e no tempo de trabalho do cimento, fatores clínicos extremamente relevantes.

A análise qualitativa por difração de raios-X é um poderoso método de análise química, considerando que toda estrutura cristalina possui um padrão de difração e que a mesma substância sempre apresenta o mesmo modelo [43]. Assim, de acordo com relatos da literatura, na análise dos difratogramas dos materiais estudados observou-se que a celulose [44] e o cimento de ionômero de vidro [45] apresentaram picos padronizados. A presença de grande quantidade de fase amorfa no difratograma das fibras de celulose originais deve-se à sua natureza polimérica, que mostrou características típicas do grupo denominado celulose I de estrutura alomórfica, constituinte básico das fibrilas de celulose da madeira [46]. Nos difratogramas apresentados pelas mfC e, mais especificamente, pelas nfC observou-se uma maior cristalinidade, que está relacionada com a quebra das ligações químicas das hemiceluloses e os nanocristais, após tratamento químico das fibras. Apesar do CIV apresentar partículas de carga, que são partículas de vidro, a partir do ataque do ácido poliacrílico às suas superfícies durante sua reação de presa, há formação de grande quantidade de gel de sílica. Esta matriz orgânica circunda as partículas atacadas e envolve as partículas do pó de CIV não atacadas. Assim, o difratograma de CIV (GC) mostrou-se também característico de material amorfo. Os compósitos desenvolvidos, consequentemente, apresentaram o mesmo padrão de difratogramas mostrado para a celulose e CIV. Apenas G04 apresentou difratograma de material cristalino, com alguns picos de baixa intensidade, mas bem definidos, fato que pode estar relacionado com a concentração de 0,4% de nfC no total da massa do CIV, devido a uma maior interação química.

Os gráficos resultantes da energia absorvida pela amostra em razão do número de onda em que esta energia foi absorvida são representados pelo espectro de FTIR. A estrutura molecular da celulose e dos compósitos desenvolvidos apresentou excitações vibracionais resultantes das ligações covalentes dos grupos funcionais específicos presentes nos materiais [47]. As mfC e nfC mantiveram características primordiais do CIV e das fibras de celulose originais. Neste estudo não foi possível identificar nenhuma ligação química diferente nos novos compósitos, apesar do tratamento químico das mfC e nfC durante sua preparação.

Neste estudo observou-se que os compósitos com a presença de fibras comportaram-se da mesma forma que o CIV, nenhum dos grupos apresentou atividade antimicrobiana. Provavelmente, o deslocamento de íons como, F-, Na+, Ca+2 e Al+3, com possível liberação para o meio, não influenciou na atividade antimicrobiana em nenhum dos grupos avaliados. Ao contrário dos resultados relatados em outros estudos [48,49], o CIV apresentou atividade antimicrobiana frente aos diversos microrganismos estudados. Talvez este fato esteja relacionado com a metodologia empregada, pois os autores testaram os cimentos imediatamente após a manipulação, através da “técnica do poço”. Isto propicia maior superfície de contato e, consequentemente, maior difusão, favorecendo assim a formação de halos de inibição com diâmetros maiores. Outro estudo [50] atribuiu à atividade antimicrobiana ao fluoreto que é libertado dentro de um curto intervalo de tempo. Por conseguinte, o desenvolvimento de novos cimentos ionoméricos com propriedades antibacterianas é essencial para obtenção de benefícios terapêuticos que possam aumentar a longevidade das restaurações.

A Odontologia tem focado em diferentes tecnologias para o desenvolvimento de novos materiais restauradores [51]. Com esse objetivo, o uso de fibras celulósicas, em especial microfibras e nanofibrilas de celulose de eucalipto vão de encontro a essa idéia de desenvolvimento de biomateriais, biotecnologia e desenvolvimento sustentável [12,13,15].

A cárie dentária e seus efeitos continuam a ser um sério problema de saúde pública, apresentando uma elevada incidência na população mais necessitada que não tenha acesso ao tratamento curativo ou preventivo em nosso país [2]. No Brasil, é responsável pela perda de dentes em toda a população,

independentemente da idade, com uma tendência maior em população de baixa renda [52]. O Tratamento Restaurador Atraumático (TRA) constitui um excelente exemplo da filosofia da Dentística Minimamente Invasiva (DMI), diferindo-se de suas demais abordagens operatórias por fazer uso unicamente de instrumentos manuais tanto para escavação da dentina quanto para a ampliação do acesso à cavidade [1,3]. No entanto, no Brasil, o custo elevado dos cimentos de ionômero de vidro indicados para esta técnica limita sua aplicação.

O uso do CIV modificado por fibras nas indicações e técnicas corretas do TRA pode alcançar a simplificação do procedimento restaurador, somado aos benefícios sociais. Dessa forma, será possível aumentar a cobertura de uma população não assistida, auxiliando na redução das perdas dentárias. Outro resultado esperado refere-se ao custo-benefício do TRA com o uso do CIV modificado com fibras, o que deverá proporcionar sua aceitação por parte de uma comunidade assistida nos moldes