CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DOS ISOLADOS

Quanto às características morfológicas das colônias, 61% dos isolados produziram muito muco; 35% dos isolados apresentam tamanho da colônia <1mm de diâmetro, 30% apresentaram colônia entre 1-2 mm de diâmetro, e 35% apresentam colônia maior que 2mm. Em relação à característica cor da colônia, os isolados apresentaram coloração branca, rosa, creme e amarelo, com predominância da cor creme em número de isolados (80%) (figura 2). A grande variabilidade morfológica das colônias sugere baixa similaridade dos isolados, indicando a presença de isolados bacterianos geneticamente diferentes.

A característica de produção de muito muco é um mecanismo de adaptação e sobrevivência as condições edafoclimáticas, estando diretamente envolvida na capacidade dos isolados em tolerarem condições ambientais adversas, tais como temperaturas elevadas. Os polissacarídeos em sua composição, são eficientes na retenção de água, constituindo reserva de energia em ambientes onde a disponibilidade de nutrientes é limitada (MOREIRA e SIQUEIRA, 2006).

Neste trabalho, o conhecimento da diversidade morfológica dos micro- organismos estudados foi considerado para fins de identificação preliminar da diversidade dos isolados, através da separação das colônias em morfoespécie. Os aspectos morfológicos, possuem importância na identificação preliminar de micro- organismos, servindo como base para prosseguir nos trabalhos de caracterização genotípica (RIBEIRO et al., 2012). No entanto a variabilidade genética foi confirmada através da caracterização molecular através das técnicas de Fingerprinting, ARDRA e posteriormente sequenciamento, para a classificação das bactérias quanto ao gênero.

5.3 CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA

5.3.1 “Fingerprinting” molecular por (GAC)5, (GTG)5 e Box-PCR

A avaliação da variabilidade genética foi realizada a partir das análises do fingerprinting molecular por meio das reações de PCR, utilizando os iniciadores (GAC)5, (GTG)5 e Box-A1.

O dendograma de similaridade baseado no fingerprinting dos isolados, obtido pelos perfis gerados pelos três iniciadores, mostrou grande variabilidade das bactérias obtidas das sementes de milho. Não houve a formação de grupos com 100% de similaridade, demonstrando que na coleção não há cópias e que todas as estirpes são únicas (figura 3). Nas sementes existe uma variedade de bactérias que pode ser instalada por meio de correntes de ar, respingos de chuva, solo, ou mesmo ser transmitida da flor para a semente. Isso explica a grande diversidade de bactérias.

As escolhas dos primers ou iniciadores são decisivas para a boa reprodutibilidade da PCR. Os mais usados são (GTG)5, (GAC)5, (GACA)5 e devido à

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 <1 mm _{1_}2 mm >2m m Bran ca Am ar ela Cre m e Ros a Po u co Mu ito

Tamanho da colônia Cor da colônia Quantidade de muco Fr e q u ê n ci a d o s i solado s (% )

FIGURA 2: Características fenotípicas (tamanho e cor da colônia e quantidade

de muco) das bactérias isoladas das diferentes partes do milho (endofíticas da raiz, parte aérea, rizosfera e sementes) nos três meios de cultura (Ágar nutriente, Dyg’s e YMA).

grande capacidade de detecção de polimorfismos podendo ser usado para uma grande gama de organismos (BASILIO et al, 2008)

A análise de perfil baseada na amplificação de regiões repetitivas distribuídas em todo genoma bacteriano, utilizando um único primer, a exemplo de, (GTG)5 e

Box-PCR, permite a determinação da frequência de um grupo. Os elementos Box e outras regiões repetitivas são utilizadas para métodos de impressão digital (fingerprint), que analisa regiões palindrômicas repetitivas (ANDREOTE et al., 2010).

Foi possível observar que mesmo os isolados obtidos a partir de compartimentos e meios de cultura iguais, não apresentaram mesmo perfil genético, o que sugere que são isolados diferentes entre si. Essa técnica não permite o agrupamento filogenético, sendo utilizada apenas para fins de demonstração da existência de isolados idênticos (ANDREOTE et al., 2010).

Oliveira (2012) verificou através da Box-PCR que as gramíneas forrageiras,

Brachiaria decumbens e Brachiaria humidicola, apresentaram elevada diversidade

entre os isolados bacterianos, que foram obtidos da raiz e da rizosfera das referidas espécies.

FIGURA 3: Dendrograma de similaridade obtido a partir de perfis gerados por meio

de (GAC)5, (GTG)5 e Box-PCR. Os perfis obtidos foram analisados com o programa

5.3.2 Análise de Restrição do DNA Ribossomal Amplificado (ARDRA)

Os 51 isolados obtidos nos diferentes compartimentos do milho foram submetidos à Análise de Restrição do DNA Ribossomal Amplificado (ARDRA), para avaliar a diversidade genética da coleção. A análise conjunta dos perfis de restrição do 16S rRNA obtido a partir das endonucleases MspI e AluI, de corte frequente (Figura 4), permitiu a formação de oito grandes grupos filogenéticos com 60 % de similaridade.

O grupo 5, formado apenas por bactérias originadas das sementes do milho, sugerindo uma especificidade da comunidade rizobianas neste compartimento. Foram identificados dois subgrupos com isolados com 100% de similaridade entre si (M18 e M23; M9 e M10), indicando que os isolados podem representar inclusive uma mesma espécie.

A identificação de bactérias endofíticas da semente, de grupo taxonômico específico, distinto dos outros observados nos compartimentos da planta sugerem que não ocorre, necessariamente, uma transferência vertical desses micro- organismos para outros tecidos vegetais. Segundo Azevedo e Araújo (2007), as bactérias podem acessar às plantas por meio de aberturas naturais e colonizar o hospedeiro, podendo ser encontradas em todos os órgãos e tecidos.

Assim como no grupo 5, outros Isolados apresentaram 100% de similaridade entre si dentro dos grupos, como verificado no grupo 6, onde estão as bactérias M6 e M22 também isoladas da semente do milho; e no grupo 4 com as bactérias M34 originadas da parte aérea, e M32 e M36 endofíticas da raiz, indicando que pertencem à grupos taxonômicos próximos.

Em todos os compartimentos de origem e meios de cultivo constatou-se a presença de bactérias com perfis muito diversos. Devido a variabilidade dos perfis gerados pela restrição do fragmento do 16S rRNA, foi possível verificar que esses isolados encontram-se distribuídos por quase todos os grupos.

FIGURA 4: ARDRA gerado por meio das enzimas de restrição Alu I e Msp I. Os

perfis obtidos foram analisados com o programa BioNumerics 7.6 (AppliedMaths, Bélgica).

5.3.3 Sequenciamento parcial do gene 16S rRNA

Para o posicionamento taxonômico, os isolados selecionados pelo melhor desempenho no teste de germinação foram submetidos à amplificação do fragmento do gene 16S rRNA, purificação e sequenciamento. Foram obtidas 25 sequências que foram comparadas às sequências depositadas no GeneBank (tabela 3).

A similaridade dos isolados variou de 96,41% a 99,71% para aqueles que apresentaram similaridade com o gênero Bacillus; 96,87% a 99,13% para os isolados próximos ao gênero Acinetobacter; e 96,94% a 98,97% para os isolados similares ao gênero Paenibacillus. Levando em consideração os isolados submetidos ao sequenciamento, Bacillus(18) foi o gênero com maior número de isolados, seguido de Acinetobacter(5) e Paenibacillus(2) (tabela 3).

TABELA 3. Identificação dos bacterianos de milho (Zea mays L.) BRS Gorutuba por

meio de comparações das sequências parciais do gene 16S rRNA com aquelas disponíveis no banco de dados do GenBank.

Isolado Parte das

plantas

Gênero Nº

Acesso

M2 Semente Não identificado -

M3 Semente Bacillus safensis NBRC 100820 (98,92%) AF234854

M4 Semente Bacillus zhangzhouensis MCCC 1A08372

(99,40%)

JX680133

M5 Semente Bacillus zhangzhouensis MCCC 1A08372

(99,57%)

JX680133

M6 Semente Não identificado -

M11 Semente Bacillus tequilensis 10b (97,37%) HQ223107

M12 Semente Bacillus aerius 24K (99,70%) AJ831843

M13 Semente Bacillus tequilensis 10b (98,09%) HQ223107

M19 Semente Não identificado -

M20 Semente Paenibacillus polymyxa NBRC 15309

(98,97%)

D16276

M22 Semente Bacillus mojavensis NBRC 15718 (99,00%) AB021191

M24 Semente Bacillus mojavensis NBRC 15718 (98,63%) AB021191

M30 Raiz End. Bacillus tequilensis 10b (97,63%) HQ223107

M31 Raiz End. Bacillus subtilis IAM 12118 (96,76%) AJ276351

M32 Aérea Bacillus tequilensis 10b (96,41%) HQ223107

M34 Aérea Bacillus subtilis IAM 12118 (97,61%) AJ276351

M35 Aérea Acinetobacter variabilis NIPH

2171 (97,38%)

KP278590

M36 Raiz End. Não identificado -

M38 Rizosfera Acinetobacter schindleri LUH5832

(98,46%)

AJ278311

M39 Rizosfera Bacillus safensis NBRC 100820 (98,88%) AF234854

M40 Aérea Bacillus albus MCCC 1A02146 (99,52%) KJ812440

M41 Rizosfera Acinetobacter variabilis NIPH 2171 (97%) KP278590

M42 Rizosfera Bacillus tequilensis 10b (98,15%) HQ223107

M44 Aérea Acinetobacter variabilis NIPH 2171

(99,13%)

KP278590

M45 Aérea Acinetobacter variabilis NIPH 2171

(96,87%)

KP278590

M47 Raiz End. Bacillus subtilis IAM 12118 (99,28%) AJ276351

M48 Semente Bacillus vallismortis DSM 11031 (99,71%) AB021198

M49 Aérea Paenibacillus illinoisensis NBRC

15959 (96,94%)

AB073192

Bacillus é um dos gêneros mais promissores para serem usados em

bioinoculantes comerciais devido à sua capacidade de formação de esporos, aumentando assim a adaptação da linhagem na formulação comercial e aplicação de campo (AYSHA et al, 2012).

Entre os Bacillus, as linhagens de B. subtilis são as mais amplamente utilizadas como promotoras de crescimento devido a sua capacidade de reduzir doenças pela produção de antibióticos quando aplicadas em sementes. O gênero

Bacillus é relatado como promotor de crescimento em algumas culturas. Araújo

(2008) observou que B. subtilis promoveu crescimento e disponibilização de nutrientes para o milho em experimento em casa de vegetação.

Paenibacillus podem promover o crescimento vegetal através da fixação

biológica de nitrogênio, solubilização do fosfato, produção do ácido indolacético (AIA) e produção de sideróforos que permitem a aquisição de ferro. Ao longo do tempo, Paenibacillus desempenhará papéis cada vez mais importantes na agricultura sustentável (GRADY, et al 2016)

Sheela e Usharani (2013) verificaram que Paenibacillus polymyxa, inoculadas em Zea mays tem efeitos significativos (comprimento da parte aérea e comprimento da raiz) na planta, superiores ao controle. Estes resultados mostram o potencial do uso dessas bactérias, a fim de melhorar a produtividade do milho nos campos.

Sandhya e Shaik (2018), mostram o potencial da Acinetobacter baumannii no alívio dos efeitos do estresse hídrico no milho. E Uniyal et al (2016) demonstraram que Acinetobacter calcoaceticus e Acinetobacter oleivorans podem servir como cepas promissoras na biorremediação de solos contaminados com fipronil.

Poucas informações foram levantadas até o momento a respeito da diversidade e do potencial para promoção do crescimento dos micro-organismos endofíticos associados ao milho. A abordagem metodológica utilizada nesse estudo permitiu além de observar a grande diversidade genética desses isolados da semente do milho, avaliar a capacidade de promoção de crescimento, quando inoculados na planta.

5.4 AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE ESTIMULAR A GERMINAÇÃO DAS