UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS
CLÁUDIA SILVA GOMES BOMFIM
DIVERSIDADE GENÉTICA E POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE
BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS DE SEMENTES DE MILHO (Zea mays L).
PETROLINA – PE
2019
CLÁUDIA SILVA GOMES BOMFIM
DIVERSIDADE GENÉTICA E POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE
BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS DE SEMENTES DE MILHO (Zea mays L).
Dissertação apresentada à Universidade Federal do Vale do São Francisco, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Biociências, para obtenção do título de Mestre em Biociências.
Área de concentração: Farmacologia e
Biologia de Produtos Naturais.
Orientador: Dr. Paulo Ivan Fernandes Júnior
PETROLINA – PE
2019
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas da UNIVASF. Bibliotecário: Fabio Oliveira Lima - CRB-4/2097.
Silva Gomes Bomfim, Cláudia
S586d Diversidade genética e potencial biotecnológico de bactérias endofíticas de sementes de milho (Zea mays L)/Cláudia Silva Gomes Bomfim. – Petrolina-PE, 2019.
XIV, 68 f.: 10 il. ; 29 cm.
Dissertação (Mestrado em Biociências) - Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Petrolina, Petrolina-PE, 2019.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Ivan Fernandes Júnior.
1. Bactérias endofíticas. 2. Promoção do crescimento. 3.Semente de milho (Zea mays). I. Título. II. Fernandes Júnior, Paulo Ivan. III. Universidade Federal do Vale do São Francisco.
CDD 579.3
Aos meus pais (Angelita e Geraldo), aos meus irmãos (Alan, Alexsandro, Edileusa e Priscila) e ao meu marido (Altamirando), por me incentivarem sempre.
E aos meus filhos (Bianca e Davi), por me ensinarem uma forma diferente de amar.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida e por ser minha fortaleza ao longo do caminho, que foi longo e cheio de pedras e espinhos.
Aos meus pais, Angelita e Geraldo, pelo apoio, amor, carinho e incentivo em todos os momentos. E por acolherem meus filhos durante várias noites que precisei para escrever e corrigir a dissertação.
Aos meus irmãos, Alan, Alexsandro, Edileusa e Priscila por todo incentivo, carinho, amor e dedicação. E por estarem sempre prontos a ajudar, em qualquer situação.
Ao meu marido, Altamirando, por sempre me incentivar. Agradeço a Deus por sua compreensão e paciência.
Ao meu orientador, Dr. Paulo Ivan, por ter aceitado me orientar nessa etapa. Obrigada por acreditar em mim, e pelo estímulo de sempre buscar mais conhecimento.
As minhas irmãs de coração, Viviane e Valéria, sou grata a Deus pela amizade de vocês e por ser um presente de Deus em minha vida. Sem vocês, não sei o que seria de mim nessa caminhada. Muito obrigada por tudo.
Aos amigos que fiz no Laboratório de Microbiologia do Solo da Embrapa Semiárido: Pamella, Lucas, Gilmar, Rejane, Marcos, Reginaldo, Viviane, Valéria, Aleksandro, Rafael, Raphael, Ruth, Tailane, Thaise, Paula, Jéssica, Eliomara, Layane, Luiz, Wesley, Jessica Caroline, Gabiane, Sam. Agradeço pela amizade, ajudas e ensinamentos.
A Universidade Federal do Vale do São Francisco pela oportunidade do Mestrado e a todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Biociências pelos ensinamentos;
A FACEPE pela concessão da bolsa;
A Embrapa Semiárido pela disposição de toda a infra-estrutura essencial para realização desse trabalho;
E a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste sonho. Muito Obrigada! Sempre serei grata.
"Comecei por dar GRAÇAS pelas pequenas coisas e, quanto mais grata me tornava, mais a minha abundância aumentava. Isto acontece porque aquilo em que nos concentramos se expande."
RESUMO
As bactérias endofíticas são aquelas que colonizam os tecidos internos das plantas, promovendo o crescimento vegetal por vários mecanismos, como por exemplo, a solubilização de fosfato, produção de ácido indolacético e produção de sideróforos. Dessa maneira, esse trabalho teve por objetivo isolar e caracterizar bactérias endofíticas do milho quanto aos mecanismos de promoção do crescimento vegetal, visando selecionar isolados eficientes. Os ensaios foram realizados no Laboratório de Microbiologia do Solo, da Embrapa Semiárido. Inicialmente as sementes foram sanitizadas e depois semeadas, em triplicata, em frascos contendo solução nutritiva de Norris. Esse ensaio foi realizado em estufa BOD. Após 15 dias da germinação, as plantas foram coletadas e a parte aérea foi separada da raiz, em seguida realizado o isolamento das três partes (aérea, endofíticas da raiz e da rizosfera). Para isolar as bactérias da rizosfera, a raiz foi colocada em um tubo contendo solução salina esterilizada e levado para mesa agitadora. Em seguida foi realizada a diluição seriada até 10-4.Alíquotas de cada diluição foram espalhadas em placas de Petri em três meios de cultura diferentes (Ágar Nutriente, Dyg’s e YMA), em triplicata. Para isolar as bactérias endofíticas da raiz e da parte aérea, as mesmas foram sanitizadas, trituradas em solução salina, em seguida foi feita a diluição seriada até 10-4. Alíquotas de cada diluição foram espalhadas em placas de Petri em três meios de cultura diferentes (Ágar Nutriente, Dyg’s e YMA), em triplicata. As placas foram incubadas até o aparecimento das colônias em seguida purificadas e estocadas. Amostras de sementes do milho foram sanitizadas, trituradas em solução salina estéril, em seguida fez-se a diluição seriada até 10-4. Alíquotas de cada diluição foram espalhadas em placas de Petri em três meios de cultura diferentes (Ágar Nutriente, Dyg’s e YMA), em triplicata. As placas foram incubadas até o aparecimento das colônias em seguida purificadas e estocadas. Os isolados crescidos tiveram o DNA extraído utilizando o kit de extração da Promega, seguindo das instruções do fabricante. A variabilidade genética das cepas isoladas foi avaliada pelas técnicas de (GAC)5, (GTG)5, Box-PCR e ARDRA e o perfil genético
determinado pelo programa Bionumerics. Foi realizado um teste de germinação com 51 bactérias isoladas dos diversos compartimentos do milho, para verificar o efeito dessas bactérias na germinação em sementes de milho. Os isolados também foram caracterizados quanto à capacidade de produção de ácido indolacético, sideróforos e solubilização de fosfato, por meio dos testes bioquímicos. A distribuição dos isolados de acordo com o compartimento foi representado por 51% obtidos das sementes; 20% endofíticas da raiz; 17% da parte aérea e 12% da rizosfera, apresentando grande diversidade genética, confirmadas pelas técnicas moleculares. A partir do teste de germinação, foi selecionadas 29 bactérias, cerca de 55% delas produziram ácido indolacético, 17% solubilizaram fosfato de cálcio e 100% produziram sideróforos. Os isolados demonstraram uma elevada diversidade bacteriana, as mesmas foram identificadas como pertencentes aos gêneros Bacillus,
Paenibacillus e Acinetobacter. As cepas M6 e M19, ambas isoladas da semente,
apresentaram a capacidade de produção de sideróforos, ácido indolácetico e solubilização de fosfato indicando seu potencial como biofertilizante no cultivo do milho no futuro.
ABSTRACT
Endophytic bacteria are those that colonize the internal tissues of plants, promoting plant growth through various mechanisms, such as phosphate solubilization, indolacetic acid production, and siderophores production. Thus, this study aimed to isolate and characterize endophytic bacteria from maize evaluating the mechanisms of plant growth promotion to select efficient isolates. The experiments were carried out at Embrapa Semiarid Soil Microbiology Laboratory. Initially the seeds were sanitized and then sown in triplicate in flasks containing Norris nutrient solution. This assay was performed in a BOD. After 15 days of germination, plants were collected and the shoot part was separated from the root, followed by isolation of three parts (shoot, root endophytic, and rhizosphere). To isolate the bacteria from rhizosphere, the root was placed in a tube containing sterile saline solution and taken to shaking table. Then serial dilution to 10-4 was performed. Aliquots of each dilution were spread on Petri dishes in three different culture media (Nutrient Agar, Dyg's and YMA) in triplicate. To isolate the endophytic bacteria from root and shoot, they were sanitized, ground in saline solution, then serially diluted to 10-4. Aliquots of each dilution were spread on Petri dishes in three different culture media (Nutrient Agar, Dyg's and YMA) in triplicate. The plates were incubated until the colonies were purified and stored. Maize seed samples were sanitized, ground in sterile saline solution, and then serially diluted to 10-4. Aliquots of each dilution were spread on Petri dishes in three different culture media (Nutrient Agar, Dyg's and YMA) in triplicate. The isolates grown had the DNA extracted using Promega's extraction kit, following the manufacturer's instructions. The genetic variability of the isolated strains was evaluated by the techniques of (GAC)5, (GTG)5, Box-PCR, ARDRA, and the
genetic profile determined by the Bionumerics program. A germination test was performed with 51 bacteria isolated from the different compartments of maize to verify the effect of these bacteria on germination in maize seeds. The isolates were also characterized for indolacetic acid production capacity, siderophores and phosphate solubilization by biochemical tests. The distribution of isolates according to compartment was represented by 51% obtained from seeds; 20% root endophytic; 17% of the shoot part and 12% of the rhizosphere, presenting great genetic diversity, confirmed by molecular techniques. From the germination test, 29 bacteria were selected, about 55% of them produced indolacetic acid, 17% solubilized calcium phosphate and 100% produced siderophores. The isolates showed high bacterial diversity, they were identified as belonging to the genera Bacillus, Paenibacillus and
Acinetobacter. The strains M6 and M19, both isolated from the seed, presented
siderophores production capacity, indolacetic acid and phosphate solubilization indicating their potential as biofertilizer in maize cultivation in the future.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Esquematização das abordagens metodológicas utilizadas para a
obtenção das bactérias isoladas dos diversos compartimentos do milho (sementes, rizosfera, endofíticas da raiz e parte aérea)... 28 FIGURA 2: Características fenotípicas (tamanho e cor da colônia e quantidade
de muco) das bactérias isoladas das diferentes partes do milho (endofíticas da raiz, parte aérea, rizosfera e sementes) em três meios de cultura (Ágar nutriente, Dyg’s e YMA)... 39
FIGURA 3: Dendrograma de similaridade obtido a partir de perfis gerados por
meio de (GAC)5, (GTG)5 e Box-PCR. Os perfis obtidos foram analisados com o
programa BioNumerics 7.6. (Applied Maths, Bélgica)... 41
FIGURA 4: ARDRA gerado por meio das enzimas de restrição Alu I e Msp I. Os
perfis obtidos foram analisados com o programa BioNumerics 7.6. (Applied Maths, Bélgica)... 43
FIGURA 5: Quantidade das sementes do milho que germinaram, e presença de
raízes primárias e secundárias e pelos radiculares. ... 48
FIGURA 6: Média do comprimento (cm) da raiz dos isolados do milho... 49 FIGURA 7: Representantes dos isolados que obtiveram sucesso no teste de
germinação: A=M4, B=M6, C= M36 e D=M48 comparando (comprimento da raiz e da parte aérea) com a testemunha absoluta e a referência (Ab-V5)... 50
FIGURA 8: Esquema utilizado para cálculo do índice de solubilização [I.S. =
Diâmetro do halo (DH)/ Diâmetro da colônia (DC)]... 51
FIGURA 9: Análise dos mecanismos de promoção do crescimento (Produção de ácido Indolacético, Produção de Sideróforos e Solubilização de Fosfato) dos isolados provenientes do milho. Diagrama de Venn... 54
FIGURA 10: Avaliação da eficiência de promoção do crescimento do milho
(parte aérea). Da esquerda para direita: Tratamentos inoculados com os isolados (A=M35, B=M36 e C=M42), a referência (Ab-V5), a testemunha absoluta, a testemunha com 50% de nitrogênio e a testemunha com 100% de nitrogênio... 58
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Análise do solo quanto as suas características químicas... 34
TABELA 2. Número de isolados obtidos de diversos compartimentos
(endofíticas da raiz, parte aérea, rizosfera e sementes) do milho (Zea mays L.) BRS Gorutuba em três meios de cultura diferentes (Ágar nutriente, Dyg’s e YMA)... 37
TABELA 3. Identificação de 25 isolados bacterianos de milho (Zea mays L.) por
meio de comparações das sequências parciais do gene 16S rRNA com aquelas disponíveis no banco de dados do GenBank... 44
TABELA 4: Produção de Ácido Indolacético sem e com L-triptofano, índice de
solubilização (IS) do fosfato e quantificação da produção de sideróforos pelos isolados endofíticos do milho. ND = Não detectado... 52
TABELA 5: Eficiência na promoção do crescimento vegetal de bactérias
LISTA DE ABREVIATURAS
ADE – Água destilada estéril AIA – Ácido indolácetico ALT – Altura
ANPA – Acúmulo de nitrogênio na parte aérea
ARDRA – Análise de restrição do DNA ribossomal amplificado BOD - Demanda biológica de oxigênio
BOX – tipo de PCR
BPCP – Bactérias promotoras do crescimento de plantas CAS – CromoAzurol
CMISA – Coleção de Cultura de Micro-organismos de Interesse Agrícola da
Embrapa Semiárido
DNA – Ácido desoxirribonucléico DO – Densidade ótica
DYGS - Dextrose Yeast Glucose Sucrose EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-acético FBN – Fixação Biológica de Nitrogênio mL– mililitro
mm– milímetro
mol L-1 – Mol por litro
MMBH – Mineral Mínimo Bushnell-Haas MSPA – Massa seca da parte aérea MSR – Massa seca da Raiz
NCBI – National Center for Biotecnology Information nm– nanômetro
PCR – Reação em cadeia da polimerase rpm– rotações por minuto
TNPA – Teor de nitrogênio na parte aérea YMA – Yeast Manitol Agar
μL –microlitro μm– micrômetro
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 14 2. OBJETIVOS ... 16 2.1 OBJETIVO GERAL ... 16 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 16 3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 17 3.1 CULTURA DO MILHO ... 17
3.2 BACTÉRIAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO VEGETAL ... 18
3.2.1 Mecanismos promotores de crescimento vegetal ... 21
3.3 CARACTERIZAÇÃO DOS ISOLADOS POR MEIO DE TÉCNICAS MOLECULARES ... 23
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 25
4.1 COLETA DAS AMOSTRAS VEGETAIS ... 25
4.2 ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DAS BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS DO MILHO... 25
4.3 CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA ... 29
4.3.1 Extração de DNA ... 29
4.3.2 “Fingerprinting” molecular por (GAC)5, (GTG)5 e Box-PCR ... 29
4.3.3 Análise de Restrição do DNA Ribossomal Amplificado (ARDRA) ... 30
4.3.4 Sequenciamento parcial do gene 16S rRNA ... 30
4.4 TESTE DE GERMINAÇÃO ... 31
4.5 MECANISMOS DE PROMOÇÃO DO CRESCIMENTO VEGETAL ... 32
4.5.1 Produção de compostos indólicos ... 32
4.5.2 Solubilização de Fosfato de Cálcio... 32
4.5.3 Produção de Sideróforos ... 33
4.6. EFICIÊNCIA NA PROMOÇÃO DO CRESCIMENTO VEGETAL ... 33
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 36
5.1 ISOLAMENTO DAS BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS DO MILHO ... 36
5.2 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DOS ISOLADOS ... 38
5.3 CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA ... 39
5.3.1 “Fingerprinting” molecular por (GAC)5, (GTG)5 e Box-PCR ... 39
5.3.2 Análise de Restrição do DNA Ribossomal Amplificado (ARDRA) ... 42
5.3.3 Sequenciamento parcial do gene 16S rRNA ... 44
5.4 AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE ESTIMULAR A GERMINAÇÃO DAS SEMENTES DO MILHO ... 46
5.5 AVALIAÇÃO DOS MECANISMOS DE PROMOÇÃO DO CRESCIMENTO VEGETAL ... 50
5.6 AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA NA PROMOÇÃO DO CRESCIMENTO VEGETAL ... 55
CONCLUSÕES ... 59
1. INTRODUÇÃO
O milho (Zea mays L.) é uma planta da família das gramíneas, de grande importância socioeconômica mundial. Por ser uma excelente fonte de carboidratos, e do seu alto valor nutricional é utilizado tanto na alimentação humana, quanto na alimentação animal (FERNANDES e FILHO, 2014).
O Brasil é o terceiro maior produtor de milho, de acordo com os dados da Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB), a produção total do cereal na safra 2017/18 foi de 98,5 milhões de toneladas. A China, na segunda posição, foi responsável por 215 milhões de toneladas na safra 2017/2018. Já os Estados Unidos lideram a produção, com 370 milhões de toneladas na mesma safra (CONAB, 2019).
Por ser uma cultura bastante exigente em nutrientes, são necessárias grandes quantidades de fertilizantes, especialmente os nitrogenados para se alcançar rendimentos máximos nos cultivos. A produtividade média do milho é de 4.857 kg ha-1 e para a cultura alcançar a produtividade satisfatória, são necessários, aproximadamente 90 kg de N ha-1 na região Semiárida. Devido aos custos elevados de fertilizantes químicos, e a constante preocupação com os danos ambientais gerados, têm-se buscado cada vez mais alternativas ecologicamente sustentáveis para alcançar níveis de produtividade satisfatórios, com o mínimo de alterações ou prejuízos ao meio ambiente (HUNGRIA et al., 2010; ALVES et al., 2014).
A identificação de micro-organismos associados às plantas, capazes de promover crescimento vegetal têm-se mostrado uma estratégia promissora. (DÖBEREINER, 1992; SANTI et al, 2013). A inoculação com bactérias aumentam a capacidade de produzir fitormônios, os quais induzem o crescimento radicular, que melhoram a absorção de água e nutrientes pelas plantas (COSTA et al., 2015) e a fixação biológica de Nitrogênio (FBN), que é mais comumente associada às plantas leguminosas por estabelecer relação simbiótica com micro-organismos formando nódulos. Entretanto, uma variedade de plantas não nodulantes também podem desenvolver-se em ambientes naturais com baixo teor de N, devido às associações com micro-organismos promotores de crescimento vegetal e fixadores de N (BALDANI, 1997; DOTY et al., 2016; BOUFFAUD et al., 2016).
Para o milho, as bactérias recomendadas no Brasil pertencem à espécie
reconhecida. Apesar de ser recomendada em todo o Brasil, os experimentos que subsidiaram a recomendação das estirpes de A. brasilense foram realizados fora da região nordeste (HUNGRIA et al., 2010, REIS JUNIOR et al., 2011). As avaliações com estas estirpes estão sendo conduzidos no Nordeste, em um estudo coordenado pela Embrapa Semiárido, onde já se observou que a produtividade das variedades de milho BRS Gorutuba e BRS Caatingueiro foram significativamente maiores, quando inoculadas com as estirpes de A. brasilense e H. seropedicae em condições de baixa fertilização com N (SAMPAIO, 2013).
O estudo de diversidade de bactérias associados a gramíneas, pode revelar grandes associações, com possibilidade de exploração para produção de inoculantes que venham substituir parcialmente a utilização de fertilizantes químicos.
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Isolar e caracterizar bactérias endofíticas do milho BRS Gorutuba quanto aos mecanismos de promoção do crescimento vegetal, visando selecionar isolados eficientes.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Avaliar a diversidade genética por meio de técnicas moleculares; 2. Identificar espécies utilizando as ferramentas moleculares;
3. Avaliar a capacidade de solubilização de fosfato e a produção de AIA e sideróforos destas bactérias;
4. Avaliar o efeito destes isolados na germinação do milho;
5. Verificar a capacidade das bactérias selecionadas em promover o crescimento do milho.
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 CULTURA DO MILHO
O milho (Zea mays L.) é uma monocotiledônea da família Poaceae, produzido e consumido em diversos países. Ocupando o terceiro lugar em área de cultivo entre os cereais, a cultura tornou-se um importante componente da alimentação humana. Além dos aspectos nutricionais, elevado teor de carboidratos, proteínas e vitaminas, que compõem o seu grão, é utilizado pela indústria para a extração de óleo (MILLÉO e CRISTÓFOLI, 2016).
Em 2018 a produção mundial de milho superou 1 bilhão de toneladas, tendo como maiores países produtores os Estados Unidos e China. O Brasil consolidou-se ao longo dos últimos anos como o terceiro maior produtor mundial, e segundo maior exportador deste cereal, além de grande consumidor. Na safra 2018/2019, 96.000 mil t deste foram produzidos em território nacional, com consumo interno de 65.500 mil t (CONAB, 2018).
O aumento do consumo mundial gerou uma demanda produtiva na mesma intensidade, assim esta cultura de grãos, antes destinada à alimentação animal, tornou-se também uma commodity exportável, firmando-se também como uma matriz energética na produção de etanol (CONAB, 2018). No Nordeste brasileiro, o milho é uma cultura de grãos bastante explorada, com grande representatividade na economia para os pequenos e médios agricultores (FERNANDES e FILHO, 2014).
No ano de 2018, em função da competição com a soja em algumas regiões, e a forte estiagem, principalmente nos estados do Paraná, Mato Grosso do Sul, São Paulo e Minas Gerais, houve redução na área nacional plantada de milho. Na Região Nordeste, segunda maior produtora do país, a expectativa é de incremento na área plantada, atingindo 359,2 mil hectares, aumentando em 21,7% ao ocorrido na temporada passada. (CONAB, 2018).
No Nordeste, na safra 2018/2019 a produtividade média foi de 2.535 kg ha-1, bastante inferior à média nacional alcançada, 5.355 kg ha-1 (CONAB, 2019). Entre os fatores que contribuem para essa discrepância entre as produtividades regional e nacional estão os fatores climáticos desta região, marcados pela escassez e irregularidade pluviométrica, altas temperaturas e elevada incidência solar; a predominância de sistema de produção que utilizam pouca ou nenhuma tecnologia
de produção; além de utilização de sementes de baixa qualidade (SILVA et al., 2010).
A busca por tecnologias para minimizar os efeitos das condições climáticas do Semiárido, levou ao desenvolvimento de pesquisas voltadas ao melhoramento genético de cultivares, gerando genótipos com maior capacidade de resistir às adversidades. As cultivares, Cruzeta, Assum preto, Potiguar e BRS Caatingueiro selecionadas e adaptadas às condições edafoclimáticas da região, superprecoces, são amplamente cultivadas na região, Fernandes e Filho (2014). A variedade de milho BRS Gorutuba é uma variedade que apresenta polinização aberta, de ciclo superprecoce, considerada apropriada para a agricultura de baixo investimento tecnológico, podendo ser considerada promissora para o Semiárido brasileiro (CARVALHO et al, 2010).
O incremento da produção do milho na região Nordeste do Brasil também pode ser alcançado pela utilização de outras tecnologias acessíveis e de baixo custo, como inoculação de bactérias promotoras de crescimento vegetal, capazes de direta ou indiretamente, elevar à produtividade de culturas como o milho. Putrie et al (2013), relatam que a inoculação de isolados de Bacillus sp. e Pseudomonas sp. foi capaz de estimular o crescimento em brotos de milho, bem como promover maior resistência à seca às plantas. Essa última, característica de grande importância principalmente em áreas de cultivo dependentes de chuva.
3.2 BACTÉRIAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO VEGETAL
Estudos revelaram que as bactérias que vivem dentro dos tecidos vegetais, chamadas coletivamente de bactérias endofíticas, desempenham um papel crucial no crescimento e adaptação de uma ampla variedade de espécies de plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas. Funções benéficas atribuídas a bactérias endofíticas incluem a promoção do crescimento vegetal através do fornecimento de nutrientes e proteção contra agentes patogênicos. (ZHANG et al, 2019)
Ainda segundo Zhang et al (2019), vários micro-organismos endofíticos foram categorizados como bactérias promotoras de crescimento vegetal e são atualmente usados na formulação de diversos bioprodutos ou para modificar e/ou introduzir bactérias benéficas na planta, para fins agrícolas.
As bactérias endofíticas das sementes são herdadas entre gerações de plantas, podendo influenciar dinamicamente na germinação, no desempenho e na sobrevivência das plantas. Essas bactérias endofíticas são um dos principais determinantes da saúde e produtividade das plantas e tem recebido atenção substancial nos últimos anos. A manipulação dessas bactérias tem o potencial de reduzir a incidência de doenças nas plantas, aumentar a produção agrícola, resultando em práticas agrícolas mais sustentáveis. (MITTER et al, 2017)
A inoculação de bactérias promotoras de crescimento pode trazer vários benefícios para gramíneas, pela fixação biológica do nitrogênio atmosférico; solubilização de compostos minerais como fósforo; produção de sideróforos e produção de fitormônios reguladores do crescimento vegetal. Como resultado as plantas podem apresentar o desenvolvimento da raiz, melhorando assim a absorção de nutrientes e água, reduzindo os efeitos dos estresses ambientais, representando aumento significativo na produtividade do milho (ARRUDA et al, 2013; ALVES et al., 2014; COSTA et al., 2015; BOUFFAUD et al., 2016).
Existem diversos tipos de inoculantes disponíveis no mercado, sendo que os mais comuns são produtos líquidos ou sólidos, recomendados na sua grande maioria para inoculação das sementes. Embora a inoculação das sementes seja a forma mais recomendada e utilizada, outros métodos também podem ser empregados, como principalmente a pulverização do produto biológico sobre as plantas e a infestação do solo (ROLLEMBERG, 2013).
O AzoTotal é um inoculante líquido para a cultura do milho, e o primeiro inoculante que obteve registro para o trigo. Contém as estirpes Ab-V5 e Ab-V6 de Azospirillum brasilense e é uma nova opção em inoculante com bactérias promotoras do crescimento de plantas. (EMBRAPA, 2018)
Alguns estudos mostraram sucesso com esse tipo de inoculação. Araújo et al., (2014), observaram que a inoculação com Azospirilum brasilense usando as estirpes Ab-V5 e Ab-V6, aumentou a produtividade do milho. Pereira e Tozoni (2017) observaram que a inoculação com Azospirilum, das estirpes Ab-V5 e Ab-V6 independente do modo de aplicação, via semente ou folha aumentou o rendimento dos grãos.
O BiomaPhos é o primeiro inoculante nacional para solubilização de fósforo, elemento vital para o desenvolvimento das plantas. Os resultados na cultura do milho, conduzidos em regiões brasileiras, mostram aumentos médios de produção
de grãos de cerca de 10%, o que pode corresponder a um ganho médio de até dez sacas por hectare.As bactérias presentes no produto, as cepas BRM 119 (Bacillus
megaterium) e BRM 2084 (Bacillus subtilis), se multiplicam e colonizam a rizosfera
da planta. (EMBRAPA, 2019)
A utilização de bactérias promotoras do crescimento vegetal, para o aumento da produção agrícola, será provavelmente uma das táticas mais importantes para a atualidade no mundo. Isso se deve à demanda emergente para a diminuição da dependência de fertilizantes químicos e a necessidade de desenvolvimento da agricultura sustentável (MOREIRA e SIQUEIRA, 2006).
Dentro dos gêneros de bactérias promotoras do crescimento vegetal (BPCV), estudados por apresentarem potencial na agricultura estão Pseudomonas, Bacillus,
Agrobacterium, Herbaspirillum, Arthrobacter, Azospirillum, Azotobacter,
Gluconacetobacter, Staphylococcus, Burkholderia e Flavobacterium (REIS et al.,
2009; HUNGRIA et al., 2010). Plantas da família Poaceae (Gramíneas) têm sido conhecidas por apresentar grande potencial para estabelecer interação com algumas bactérias que promovem o seu crescimento. Essas bactérias pertencem a diversos gêneros, Azoarcus, Klebsiella, Serratia, Bacillus, Rhizobium, Azospirillum,
Burkholderia, Gluconacetobacter e Herbaspirillum (MONTEIRO, et al., 2012;
VARGAS et al., 2012).
O aumento no rendimento das plantas inoculadas com BPCV inclusive quando cultivadas em campo já foi relatado por diversos autores (PEDRAZA et al., 2009; BHATTACHARYYA et al, 2012; ESTRADA et al., 2012). Essas bactérias podem promover a divisão celular e a extensão das raízes (OLIVEIRA et al., 2009) inclusive das raízes laterais e, em alguns casos, aumentar a biomassa de raiz e folha (REIS JÚNIOR et al., 2000; PEDRAZA et al., 2009).
Estudos com estirpes de Azospirillum brasilense e Azospirillum lipoferum desenvolvidos pela Embrapa Soja, demonstraram que a inoculação com A.
brasilense nas culturas de milho e trigo proporcionou um aumento considerável de
24 a 30% na produção de grãos do milho em relação ao tratamento controle sem inoculação. Esses dados resultaram na identificação das primeiras estirpes autorizadas para a produção de inoculantes comerciais no Brasil (HUNGRIA et al., 2010). Alguns estudos mostraram sucesso com a inoculação com as bactérias de referência sobre a produtividade do milho (ARAÚJO et al., 2014; PEREIRA e TOZONI,2017)
O estudo de diversidade de bactérias associadas às gramíneas pode ajudar a conhecer as comunidades endofíticas, bem como identificar isolados com potencial para produção de inoculantes, que possam a vir substituir, parcialmente, a utilização de fertilizantes químicos. Devido à alta diversidade das bactérias, as plantas de milho podem ser colonizadas ao mesmo tempo por diversas espécies. Dentre as mais estudadas, destacam-se aquelas pertencentes aos gêneros Azospirillum,
Herbaspirillum, Acetobacter, Burkholderiae, Azoarcus. Bactérias do gênero Azosporillum são consideradas endofiticas facultativas (BALDANI et al., 1997), pois
além de colonizarem os hospedeiros podem sobreviver no solo.
3.2.1 Mecanismos promotores de crescimento vegetal
Além da fixação biológica de nitrogênio, os micro-organismos podem apresentar uma vasta gama de processos que podem trazer benefícios para os vegetais. Os hormônios de crescimento vegetal, como as auxinas, são um bom exemplo. O ácido indolacético, é o principal fitormônio relacionado ao alongamento das células, promovendo o crescimento de raízes e caules. Além da sua produção em tecidos vegetais, a síntese de AIA pode ocorrer em bactérias associadas a plantas, cuja principal via metabólica de produção utiliza a molécula de triptofano como precursora (LANA et al, 2017).
A produção de ácido indolacético (AIA) tem aplicação prática como promotora de crescimento vegetal e afeta a morfologia das raízes, aumentando o comprimento e o número de pelos radiculares. Em sementes inoculadas, essa produção pode desbalancear a relação auxina/citocinina, o que leva a diferenciação de tecidos radiculares. O estímulo da promoção de raiz ou parte aérea na planta é determinado pelo balanço entre auxinas e citocininas. Quando há maior concentração de auxinas acarreta em indução do crescimento do sistema radicular, à proporção que, uma maior concentração de citocininas favorece o crescimento da parte aérea (SPAEPEN et al., 2009; KHARE e ARORA,2010).
Bactérias isoladas de gramíneas apresentam a capacidade de produzir AIA em quantidades variáveis a depender das espécies e das estirpes estudadas (KUSS et al., 2007; SILVA et al., 2013).
Diversas bactérias produzem quantidades significativas desses compostos indólicos como um dos principais mecanismos para promoção do crescimento de
plantas juntamente com a fixação biológica de nitrogênio, sendo relatado em diversos trabalhos de caracterização de bactérias isoladas de plantas leguminosas e de gramíneas (BERGAMASCHI et al, 2007; ABD-ALLA et al., 2013; SHARMA et al., 2016; FELESTRINO et al., 2017).
O fósforo é um dos macronutriente importante para planta, pois participa como composto estrutural de ácidos nucléicos, fosfolipídios e da adenosina trifosfato, componente principal no funcionamento do metabolismo celular (SOUZA et al., 2015).
E essas bactérias com capacidade de solubilizar fosfatos quando usadas como inoculantes, representam uma boa alternativa, já que parte do fósforo encontrado no solo está na forma orgânica, indisponível para as plantas (YADAV et al., 2014).
Estas bactérias adquirem o fósforo do solo por meio de vários mecanismos, tendo a capacidade de estimular processos metabólicos que são efetivos na sua solubilização e mineralização (MOREIRA e SIQUEIRA, 2006). Em solos com baixos teores desse mineral, as bactérias além de fixar o nitrogênio, também podem auxiliar na captura de outros nutrientes, que auxiliam no desenvolvimento e na promoção do crescimento vegetal.
O ferro é um micronutriente indispensável para a planta. Os micro-organismos desenvolveram mecanismos especializados para a assimilação de ferro que incluem a produção de compostos quelantes de baixo peso molecular, os sideróforos. Os mesmos estão envolvidos no aumento do crescimento das plantas (MOREIRA e SIQUIERA, 2006).
A palavra sideróforos vem do Grego e significa “carreadores de ferro”. Dessa maneira, são quelantes com função de se ligar ao Fe (III), em condições de baixo ferro livre. Vários micro-organismos sintetizam sideróforos, como por exemplo, micro-organismos do solo, bactérias fixadoras de nitrogênio, alguns tipos de leveduras e até certas espécies de plantas (fitosideróforos) (FEDRIZZI, 2006;)
A produção e utilização de sideróforos é a estratégia mais eficaz dos micro-organismos para adquirir ferro (BENITE & MACHADO, 2002). A identificação de novas estirpes, com potencial na produção de sideróforos, em associação com uma diversidade de culturas de gramíneas, indicam resultados positivos quanto a capacidade na promoção do crescimento vegetal, sendo a principal função desses compostos quelar o ferro, diminuindo assim a disponibilidade para patógenos, além
de serem considerados importantes componentes tecnológicos para fitorremediação pelo mecanismo de proteção contra toxicidade de metais (SCHALK et al., 2011; WANG et al., 2014; CHEN et al., 2016).
3.3 CARACTERIZAÇÃO DOS ISOLADOS POR MEIO DE TÉCNICAS MOLECULARES
A identificação de um micro-organismo, geralmente, se inicia com a caracterização fenotípica por fornecer informações básicas capazes de associar o micro-organismo de interesse a um indivíduo já conhecido. No entanto, estudos de diversidade com apenas essas características não são suficientes para reconhecer as diferenças entre as espécies.
Assim, a alternativa mais eficiente para estudos de diversidade é o uso de técnicas da biologia molecular, estas são usadas para a caracterização da diversidade e identificação de bactérias. Os avanços com as técnicas de extração de DNA, amplificação por PCR e sequenciamento, têm possibilitado a identificação de novos micro-organismos.
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica que permite a obtenção de várias cópias de um determinado segmento de DNA. Consiste em uma reação catalisada por uma enzima termoestável: a DNA polimerase e componentes como desoxirribonucleotideos (dNTP’s) e primers, ou oligonucleotídeos. A reação de PCR se processa automaticamente em um aparelho termociclador programado para a realização de ciclos repetidos de três etapas: desnaturação, anelamento e extensão. Por sua versatilidade, rapidez e sensibilidade, a PCR é uma poderosa ferramenta em uma variedade de estudos genéticos moleculares e largamente empregadas nos estudos de micro-organismos. (EISEINSTEIN, 1990)
A PCR impulsionou os estudos relacionados ao genótipo dos organismos. Uma das aplicações da PCR na classificação e identificação de micro-organismos é a utilização de “fingerprints” genômicos, como por exemplo, a utilização de iniciadores correspondentes a regiões repetitivas (rep) no genoma. A análise de Box-PCR, é um tipo de avaliação por rep-PCR (repetitive-sequence-based PCR), que consiste na avaliação de perfis de DNA em regiões repetitivas e conservadas do material genético (VERSALOVIC et al, 1991; BRUIJN, 1992).
A técnica conhecida como ARDRA (Análise de restrição de DNA ribossomal amplificado) é baseada em padrões de restrição enzimática usando enzimas selecionadas com base na sua habilidade de revelar polimorfismo nos fragmentos de DNA analisados. É útil para análise da diversidade genética (REIS JUNIOR et al, 2004).
4. MATERIAL E MÉTODOS
Foram realizadas duas abordagens distintas, conforme descrito abaixo e esquematizado na figura 1, com intuito de isolar a comunidade bacteriana presente em um lote de sementes de milho (Zea mays L.), cultivar BRS Gorutuba, produzida pela Embrapa Produtos e Mercados em Petrolina no ano de 2018. Os experimentos foram realizados no Laboratório de Microbiologia do Solo na Embrapa Semiárido.
4.1 COLETA DAS AMOSTRAS VEGETAIS
As sementes de milho foram adquiridas na Embrapa Produtos e Mercados, localizada na cidade de Petrolina, PE. As sementes foram produzidas comercialmente no ano de 2018 em sistema irrigado com pivô central de acordo com os protocolos para boas práticas de produção de sementes da Embrapa.
As amostras bacterianas foram obtidas das sementes de milho e dos diferentes compartimentos das plântulas de milho (rizosfera, endofíticas da raiz e parte aérea), cultivado em meio e condições estéreis, realizado no laboratório de microbiologia do solo, na Embrapa Semiárido.
Inicialmente, as sementes de milho foram sanitizadas em álcool 96° GL por 30 segundos, hipoclorito de sódio a 3% por 5 minutos, seguidos de 10 lavagens sucessivas com água destilada estéril (ADE), e semeadas em frascos de 500 mL contendo solução nutritiva de Norris com ¼ de força, em triplicata. Em cada frasco foram semeadas três sementes. As plantas cresceram por 15 dias em estufa tipo BOD (Demanda Biológica de Oxigênio), a temperatura de 28 °C e com fotoperíodo de 12 horas. Após esse período as plantas foram coletadas e tiveram as raízes separadas da parte aérea para fazer o isolamento das bactérias.
4.2 ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DAS BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS DO MILHO
As amostras bacterianas foram obtidas das diferentes partes do milho: sementes, rizosfera, endofíticas da raiz e parte aérea.
Inicialmente, as sementes de milho selecionadas foram sanitizadas imersas em álcool 96° GL por 30 segundos, hipoclorito de sódio a 3% por 5 minutos, seguidos de 10 lavagens sucessivas com água destilada estéril (ADE). Em seguida, utilizando um “mixer” sanitizado, 20g de sementes foram trituradas em 180 mL de solução salina (NaCl a 0,85% p/v) autoclavada. As sementes trituradas + solução salina (diluição 10-1), foram diluídas seriadamente com 1mL da solução mais concentrada em 9 mL de solução salina descrita acima, seguido por homogeneização por vortexação, antes da diluição posterior.A diluição seriada foi realizada até a diluição 10-4.
Alíquotas de 100 µL de todas as diluições foram semeadas por técnica de espalhamento, em triplicata, em placas de Petri contendo os meios de cultura Ágar nutriente, Dyg’s (Rodrigues Neto et al., 1986) e YMA (Vincent, 1970) e incubadas a 28ºC por 72 horas. As colônias bacterianas foram diferenciadas e caracterizadas, com base na morfologia colonial, pigmentação, tamanho e textura. As colônias foram subcultivadas nos meios originais da primeira inoculação, por técnica de esgotamento sucessivas vezes até a obtenção de monoculturas (colônias puras). Os isolados foram estocados em meio líquido Dyg’s com glicerol, armazenados em ultrafreezer a -80 °C e depositados na Coleção de Cultura de Micro-organismos de Interesse Agrícola da Embrapa Semiárido (CMISA).
Para isolamento das bactérias da rizosfera, 3 g de raiz foram acondicionadas em um tubo de centrífugo tipo Falcon (esterilizados) contendo 27 mL de solução salina (NaCl a 0,85% p/v) esterilizada. Os tubos foram acomodados em agitador orbital e submetidos a agitação de 200 rotações por minuto (rpm) por 10 minutos. Essa solução concentrada obtida (10-1), foi diluída seriadamente até a diluição 10-4, conforme descrito anteriormente. Uma alíquota de 100µL da suspensão em todas as diluições foi inoculada nos mesmos meios de cultura descritos no experimento anterior. O ensaio também foi realizado em triplicata. As placas foram incubadas a 28ºC e repicadas sucessivas vezes até o aparecimento de colônias puras.
As bactérias endofíticas das raízes foram obtidas a partir da trituração das raízes. Para esse isolamento, os 3g de raízes utilizados para a obtenção das bactérias rizosféricas foram sanitizadas conforme descrito para as sementes. Em seguida foram trituradas em solução salina (NaCl a 0,85% p/v) esterilizadas, utilizando um “mixer”. Em seguida foi realizada a diluição seriada e a inoculação, como descrito no experimento de isolamento das bactérias da rizosfera. As placas
foram incubadas a 28ºC até o aparecimento das colônias que foram purificadas e estocadas.
Para o isolamento das bactérias da parte aérea, foi utilizada a abordagem semelhante à descrita para as bactérias endofíticas das raízes. A parte aérea foi sanitizada como descrito acima, em seguida, utilizando um “mixer” esterilizado, a parte aérea foi triturada em solução salina (NaCl a 0,85%p/v) autoclavada. Essa solução concentrada (diluição 10-1), foi diluída seriadamente até a diluição 10-4.
Alíquotas de 100 μL de cada diluição seriada foram inoculados, em triplicata, em placas de Petri contendo três meios de cultura diferentes (Ágar nutriente, Dyg’s e YMA). Com auxílio da alça de Drigalski o caldo de cultivo inoculado foi espalhado nas placas que foram incubadas a 28ºC até o aparecimento das colônias. As colônias foram reinoculadas no mesmo meio sucessivas vezes até a obtenção de colônias puras.
A caracterização morfológica colonial foi realizada após a purificação dos isolados. Nas colônias obtidas nas placas foram feitas as seguintes avaliações: o tamanho das colônias em (<1; 1-2; >2)mm de diâmetro, a cor da colônia (creme, amarela, branca e rosa) e a quantidade de muco produzida (pouco ou muito).
Todos os isolados obtidos foram estocados em meio líquido Dyg’s com glicerol, armazenados em ultrafreezer a -80 °C e CMISA. Em seguida prosseguiu-se a extração de DNA e as análises moleculares.
Figura 1: Esquematização das abordagens metodológicas utilizadas para a
obtenção das bactérias isoladas dos diversos compartimentos do milho (sementes, rizosfera, endofíticas da raiz e parte aérea)
Sementes do milho
Sanitizadas
Semeadas em frascos com solução nutritiva de
Norris
Levadas para a BOD por 15 dias
Plântulas coletadas e parte aérea e raiz
separadas. Parte aérea Sanitizada e trituradas em solução salina. Diluição seriada até 10-4 Inoculação em placa de Petri (três meios de cultura ) Incubadas, purifica das e estocadas. Raiz Agitadas em tubo com solução salina
Diluição seriada até 10-4 Inoculação em placa de Petri (três meios de cultura ) Incubadas, purific adas e estocadas. Sanitizada e trituradas em solução salina. Diluição seriada até 10 Inoculação em placa de Petri (três meios de cultura ) Incubadas, purifica das e estocadas. Trituradas em solução salina Diluição seriada até 10-4 Inoculação em placa de Petri (três meios de cultura ) Incubadas, purifica das e estocadas.
4.3 CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA
4.3.1 Extração de DNA
Para a extração do DNA as bactérias foram cultivadas em meio Dyg’s líquido e mantidas por 72h em agitador orbital a a 100 rpm. Após o período de crescimento, o DNA foi extraído utilizando o kit de extração de DNA genômico Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega), seguindo as instruções do fabricante. O DNA foi armazenado a -20 ºC para manipulações futuras.
4.3.2 “Fingerprinting” molecular por (GAC)5, (GTG)5 e Box-PCR
A variabilidade genética das bactérias foi avaliada a partir da análise do “fingerprinting” molecular por meio de reações de PCR, utilizando os iniciadores (GAC)5 (GADANHO e SAMPAIO, 2002), (GTG)5 (GOMEZ-GIL et al, 2004) e Box A1
(VERSALOVIC et al, 1994). Para os oligos(GAC)5 e (GTG)5 as reações de PCR e
os“mixes” foram preparado com Buffer 1X, 3,0 mol L-1
MgCl2, dNTP 1,2 mol L-1, 0,40
μM dos iniciadores (GAC ou GTG) e 0,75 U Taq DNA polimerase,1μL de DNA e o volume completado para 10 μL com água ultrapura autoclavada. As condições da reação utilizadas foram: desnaturação inicial a 94 ºC por 2 min, 40 ciclos de desnaturação a 94°C por 45 seg, anelamento 50°C por 1 min e de extensão 72 ºC por 1 min e 1 ciclo de extensão final a 72 ºC por 6 minutos.
Para a Box-PCR o mix foi preparado utilizando Buffer 1X, 3,0 mM MgCl2,
dNTP 1,5 mM, 1,0 μM do iniciador BOX A1 e 1,0 U Taq DNA polimerase, 1μL de DNA e o volume completado para 20 μL com água ultrapura autoclavada. As condições da PCR foram: desnaturação inicial a 94 ºC por 10 min, 40 ciclos de desnaturação a 94°C por 1 min, anelamento 52°C por 1 min e de extensão 72 ºC por 7 min e 1 ciclo de extensão final a 72 ºC por 14 minutos.
Os produtos de PCR foram submetidos a eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,0% (p/v) a 100 V por 120 minutos. Posteriormente o gel foi visualizado em transiluminador sob luz UV e fotografado em fotodocumentador. Todos os perfis avaliados com auxílio do programa Bionumerics 7.6 (Applied Maths, Bélgica).
4.3.3 Análise de Restrição do DNA Ribossomal Amplificado (ARDRA)
Para a realização do ARDRA foi amplificado o gene 16S, o gene 16S rRNA, região de alta conservação nas bactérias de maneira geral, foi amplificado utilizando os iniciadores universais Y1 (TGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGC) e Y3 (TACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTC) (YOUNG et al., 1991). Nas reações de amplificação o mix foi preparado com Buffer 1X, 1,5 mol L-1 MgCl2, dNTP 0,5 mol L-1,
0,20 μM dos iniciadores e 1,0 U Taq DNA polimerase,3,0 μL de DNA e o volume completado para 30 μL com água ultrapura autoclavada. As condições da reação utilizadas foram: desnaturação inicial a 94 ºC por 5 min, 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 1 min, anelamento 60°C por 45 seg e de extensão 72 ºC por 2 min e 1 ciclo de extensão final a 72 ºC por 5 minutos.O tamanho dos fragmentos foi determinado utilizando o marcador molecular 1 kb DNA Ladder (ThermoScientific).
O produto da amplificação foi digerido utilizando as endonucleases: Alu I e
MspI (ThermoScientific). O volume das reações de restrição foi de 10 μL, contendo:
5 μL da reação de PCR e 5 μL do mix de reação contendo as endonucleases. Cada enzima foi preparada adotando-se as recomendações do fabricante. As soluções contendo o DNA e as respectivas enzimas foram incubadas em estufa tipo BOD a 37°C onde permaneceram overnight para completa digestão do DNA. O produto foi corado e submetido à eletroforese e em gel de agarose a 1% em tampão TBE 0,5X a 100 V por 120 min.
As imagens dos géis foram analisadas com auxílio do programa BioNumerics 7.6 (Applied Maths, Bélgica). Foi construído um dendrograma de similaridade, utilizando o coeficiente de similaridade de Dice e o método de agrupamento UPGMA.
4.3.4 Sequenciamento parcial do gene 16S rRNA
Para identificação dos 29 isolados selecionados a partir do teste de germinação foi utilizado o gene 16S rRNA. Para amplificação foram utilizadas as mesmas condições e iniciadores descritos anteriormente. Os produtos da PCR foram purificados utilizando o kit comercial de purificação GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific), liofilizados e, em seguida, enviados para serem sequenciados na empresa Macrogen (Seul, Coréia do Sul).
Após a obtenção das sequências, a avaliação da qualidade foi realizada utilizando o programa SeqScanner1.0 (Applied Biosystems). As sequências obtidas foram comparadas com aquelas disponíveis no banco de dados GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) a fim de verificar a similaridade com as sequências de estirpes tipo.
4.4 TESTE DE GERMINAÇÃO
Foi realizado um teste de germinação com as 51 bactérias isoladas das sementes e dos diferentes compartimentos das plântulas de milho. As bactérias foram crescidas em meio de cultivo Mineral Mínimo Bushnell-Haas (MMBH), Busnnell e Haas (1941), modificado pela ação de três fontes de carbono, tendo a seguinte composição final: 0,2g de MgSO4; 0,02g de CaCl2; 1,0g de KH2PO4; 1,0g
de K2HPO4; 1,0g de NH4NO3; 0,05g de FeCl3; 4,66g de ácido málico; 4,66g de
glicose; 4,66g de manitol e 1,0 L de H2O destilada. Depois de verificado o
crescimento das mesmas, em torno de 7 dias, a densidade ótica (DO) dos caldos de cultivo foram ajustadas em espectrofotômetro a 540 nm para a absorbância 0,2 (DO540=0,2). As sementes foram sanitizadas como descrito anteriormente e a
inoculação foi feita por microbiolização por meio da imersão por 15 minutos das sementes nos caldos de cultivo ajustados para DO540=0,2. As sementes inoculadas
(foram transferidas para placas de Petri com Ágar-água (10 sementes/placa). O teste foi realizado em triplicata com 51 isolados bacterianos isolados neste trabalho, além de uma bactéria da referência Azospirillum brasilense Ab-V5, recomendada oficialmente para a produção de inoculantes para a cultura do milho (Hungria et al., 2010) e a testemunha (controle), 7 dias após a germinação foi feita a seguinte análise: quantidade de sementes que germinaram, presença de raízes primárias e secundárias, presença de pêlos radiculares e o comprimento da parte aérea e da raiz principal.
4.5 MECANISMOS DE PROMOÇÃO DO CRESCIMENTO VEGETAL
4.5.1 Produção de compostos indólicos
A produção de compostos indólicos (auxinas) foi quantificada para 29 isolados selecionados a partir do teste de germinação, tendo Azospirillum brasilense Ab-V5 como bactéria de referência. A avaliação foi feita de acordo com o método colorimétrico desenvolvido por Sarwar e Kremer (1995), com adaptações. O caldo de cultivo teve sua densidade ótica corrigida para DO540= 0,2, conforme descrito
anteriormente. A partir desse pré-inóculo, as bactérias foram inoculadas em 3 mL do meio líquido MMBH com e sem L-triptofano, e incubadas sob agitação constante durante sete dias a 100 rpm a temperatura ambiente. Após o período de crescimento a densidade ótica (DO) dos isolados foi avaliada ajustada para DO540=0,2.
Posteriormente alíquotas de 1 mL dos caldos de cultivos ajustados centrifugados por 5 min a 6000g. Uma alíquota de 150 μL do sobrenadante foi adicionado em microplaca de Elisa e sobre este 150 μL de reagente Salkowski (1 mL de FeCl3.6H2O 0,5M em 49 mL de HClO4), em seguida foram incubadas no escuro por
30 min, após esse período as amostras foram lidas em espectrofotômetro a 540 nm. Uma curva padrão foi previamente obtida de concentrações conhecidas de AIA sintético para estimativa de produção de auxinas pelos isolados.
4.5.2 Solubilização de Fosfato de Cálcio
Para avaliar a capacidade de solubilizar fosfato de cálcio pelas bactérias utilizou o meio de cultura GL (10 g de glicose, 2g de extrato de levedura, 15 g de ágar e 1L de água destilada), segundo a metodologia descrita por Sylvester-Bradley et al. (1982). Antes da distribuição do meio nas placas, foram adicionadas, para cada litro de meio 50 mL de K2HPO4 10 % p/v e 100 mL de CaCl2 10% p/v e em
seguida homogeneizados. Os isolados foram cultivados em meio líquido MMBH e 10 μL dos caldos de cultivo ajustados para DO540=0.2 foram inoculados no meio sólido
e em triplicata. As placas foram incubadas por 5 dias e a capacidade de solubilização do fosfato foi avaliada por meio da formação do halo ao redor das colônias. O índice de solubilização foi verificado pela razão do diâmetro do halo pelo
diâmetro da colônia que foram medidos com auxílio de uma régua milimetrada (BERRAQUERO et al. 1976).
4.5.3 Produção de Sideróforos
A produção de Sideróforos foi quantificada pela metodologia em microplaca descrito por Arora e Verma (2017), com modificações. As bactérias foram crescidas em meio MMBH líquido por 7 dias sob agitação constante (100 rpm) e a densidade ótica ajustada para DO540=0.2, conforme descrito anteriormente. Uma alíquota de 1
mL da cultura foi centrifugada (a 9.500 g por 5 minutos) e 150 μL do sobrenadante adicionado em nos poços de microplacas de Elisa. Sobre o sobrenadante150 μL do reagente CAS (6 mL de Brometo de Hexadeciltrimetilamônio-HDTMA 10 mM; 1,5 mL de FeCl3.6H2O 1 mM preparada em HCl 0,01 mol L; 7,5 mL da solução aquosa de
CAS 2 mM; 4,307 g de piperazina anidra; 6,25 mL HCl concentrado, volume final 100 mL). A microplaca foi incubada por 30 minutos em ambiente escuro para estimular a produção de sideróforo. Em seguida, a quantificação de sideróforos foi detectada por espectrofotômetro a 630 nm e comparado à curva padrão de EDTA.
4.6. EFICIÊNCIA NA PROMOÇÃO DO CRESCIMENTO VEGETAL
Para avaliar a eficiência na promoção do crescimento vegetal foi realizado um ensaio em viveiro na Embrapa Semiárido, localizado em Petrolina-PE no período de Junho a Agosto de 2019. A variedade de milho BRS Gorutuba foi utilizada.
O ensaio foi realizado com 29 bactérias, selecionadas a partir do teste de germinação e isoladas das sementes e dos diferentes compartimentos das plântulas de milho. Foram avaliados todos os isolados que apresentaram efeitos positivos no aumento do comprimento radicular e foram superiores na analise estatística pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). As bactérias foram crescidas em meio de cultivo Mineral Mínimo Bushnell-Haas (MMBH). Depois de verificado o crescimento das mesmas, em torno de 3 dias, a densidade ótica (DO) dos caldos de cultivo foram ajustadas em espectrofotômetro a 540 nm para a absorbância 0,3 (DO540=0,3). As
sementes foram sanitizadas como descrito anteriormente e a inoculação foi feita por microbiolização por meio da imersão por 15 minutos das sementes nos caldos de cultivo ajustados para DO540=0,3.
Após a imersão das sementes no caldo nutritivo as mesmas foram transferidas para vasos com capacidade de 5 L contendo amostras de solos do horizonte superficial de um Argissolo Vermelho-Amarelo coletado no Campo Experimental de Bebedouro, nas dependências da Embrapa Semiárido em Petrolina, PE.
Uma amostra de solo foi analisada quanto as suas características químicas segundo os métodos descritos no Manual de Análises Químicas de Solos, Plantas e Fertilizantes da Embrapa (EMBRAPA, 1997), (Tabela 1). O solo foi peneirado para eliminação de materiais indesejáveis.
TABELA 1. Análise do solo quanto as suas características químicas.
C.E pH C P K Na Ca Mg Al H+Al SB CTC V
mS cm-1 - g kg-1 mg dm-3 cmolc dm-3 %
0,92 5,2 0,0 20,44 0,32 0,12 2,2 0,9 0,05 0,7 3,5 4,3 83,1
C.E: Condutividade elétrica; pH: Potencial hidrogeniônico. C: Carbono; P: fósforo; K:
potássio; Na: sódio; Ca: cálcio; Mg: magnésio; Al: alumínio; H+Al: acidez potencial;
SB: saturação de bases; CTC: capacidade troca de cátions; V: saturação por bases.
Além dos 29 isolados, foi avaliado o tratamento inoculado com a estirpe de referência Ab-V5, Azospirillum brasilense, dois tratamentos sem inoculação e com a adubação nitrogenada (50% e 100% do nitrogênio demandado pela cultura, correspondendo a doses de 50 mg/planta e 100 mg/planta dividido em 4 aplicações a cada 7 dias) e a testemunha absoluta (sem inoculação e sem adubação) em quatro repetições. Foram semeadas três sementes por vaso e 10 dias após a emergência das plantas um desbaste foi realizado deixando uma planta por vaso.
As plantas foram irrigadas uma vez ao dia. Aos 45 dias de cultivo as plantas foram coletadas separando-se raiz e parte aérea para secagem a 65 ºC em estufa. Foram determinadas as massas das raízes e partes aéreas secas por pesagem. Foi realizado a quantificação do teor de nitrogênio na parte aérea, as mesmas foram moídas em moinho e realizado uma digestão sulfúrica, pelo método semi-microKjeldahl (KJELDAHL, 1883).
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para os ensaios de avaliação da capacidade de promoção do crescimento vegetal, os dados foram submetidos à análise de variância e comparação de médias por meio do teste de Scott-Knott com significância de p>0,05% utilizando-se o programa Sisvar.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ISOLAMENTO DAS BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS DO MILHO
Essa abordagem metodológica permitiu a obtenção de 51 bactérias endofíticas isoladas dos tecidos vegetais do milho com características morfológicas distintas. Apesar de comumente as raízes abrigarem uma grande diversidade de bactérias, sendo considerada porta de entrada de micro-organismos endofíticos (WELBAUM et al., 2004; LODEWYCKX et al., 2002), o maior número de isolados desse estudo, foi obtido no compartimento nas sementes.
A distribuição dos isolados de acordo com o compartimento foi representado por 51%, obtidos das sementes; 20% endofíticas da raiz; 17% da parte aérea; e 12% da rizosfera.
A superioridade no número de isolados obtidos a partir das sementes do milho, bem como sua grande diversidade pode esta relacionada aos fatores abióticos, aos quais a planta foi exposta no desenvolvimento das espigas no campo. Alguns trabalhos mostram que a diversidade nessa composição pode ser influenciada pelo genótipo da planta, como também por fatores abióticos (BARRET et al, 2015; HARDOIM et al, 2012; JOHNSTON-MONJEE e RAIZADA, 2011).
Os estudos já realizados com bactérias promotoras do crescimento vegetal, foram feitos com bactérias isoladas de raízes, rizosfera e partes aéreas (colmo e folhas), enquanto que no presente estudo essas bactérias com capacidade para a promoção do crescimento vegetal foram isoladas das sementes do milho.
A variação na população microbiana dos diferentes compartimentos da planta pode variar ainda em função das exigências nutricionais da planta, podendo ser modificada em seus diferentes estádios de desenvolvimento (REIS JUNIOR et al., 2000). Portanto, a população microbiana pode ser maior, inicialmente, no reservatório semente, posteriormente na região onde se encontram as raízes, migrando, no decorrer do seu desenvolvimento vegetal, podendo vir a se estabelecer em nos outros compartimentos da planta, pelo deslocamento de nutrientes, ou pela sua colonização preferencial de tecidos específicos.
Apesar de em áreas cultivadas a colonização preferencial de bactérias endofíticas ocorra na região das raízes, devido a disponibilidade de nutrientes no
TABELA 2. Número de isolados obtidos de diversos compartimentos (endofíticas da
raiz, parte aérea, rizosfera e sementes) do milho (Zea mays) BRS Gorutuba em três meios de cultura diferentes (Ágar nutriente, Dyg’s e YMA).
solo, os quais podem ser utilizados para o crescimento e metabolismo bacterianos, as condições estéreis nas quais o estudo foi desenvolvido sugere que a principal região de entrada dos endófitos sejam sementes e a partir daí, elas se disseminam no interior da planta.
As bactérias preexistentes no interior da semente fornecem a base para o crescimento bem-sucedido das plantas, antes que o mesmo seja aumentado pelas bactérias encontradas no solo (MITTER et al, 2017 e TRUYENS et al, 2014). No segundo ensaio, realizado em condições assépticas, essa hipótese pode ser confirmada já que as sementes de milho geraram plântulas saudáveis sem fazer uso de nenhuma inoculação e colonizadas com as bactérias oriundas das sementes.
Em relação aos diferentes meios de cultivo onde foram isolados, 49% foram obtidos em meio Ágar nutriente, 33% em Dyg’s e 18% em YMA (tabela 2).
O crescimento dos isolados nos diferentes meios de cultivo pode ter sido limitado pelas diferentes composições nutricionais dos meios nos quais foram crescidos, principalmente pela capacidade limitada de metabolizar fontes de carbono específicas. Muitas fontes de carbono são secretadas pelos vegetais e depositadas na rizosfera, no entanto muitos micro-organismos não apresentam a versatilidade metabólica para utilizar as mais diversas fontes de carbono presentes no ambiente (NUNES et al., 2018). MEIO DE CULTURA ENDOFÍTICAS DA RAIZ PARTE
AÉREA RIZOSFERA SEMENTE TOTAL
Ágar Nutriente 7 3 2 13 25
Dyg’s 2 4 2 9 17
YMA 1 2 2 4 9
5.2 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DOS ISOLADOS
Quanto às características morfológicas das colônias, 61% dos isolados produziram muito muco; 35% dos isolados apresentam tamanho da colônia <1mm de diâmetro, 30% apresentaram colônia entre 1-2 mm de diâmetro, e 35% apresentam colônia maior que 2mm. Em relação à característica cor da colônia, os isolados apresentaram coloração branca, rosa, creme e amarelo, com predominância da cor creme em número de isolados (80%) (figura 2). A grande variabilidade morfológica das colônias sugere baixa similaridade dos isolados, indicando a presença de isolados bacterianos geneticamente diferentes.
A característica de produção de muito muco é um mecanismo de adaptação e sobrevivência as condições edafoclimáticas, estando diretamente envolvida na capacidade dos isolados em tolerarem condições ambientais adversas, tais como temperaturas elevadas. Os polissacarídeos em sua composição, são eficientes na retenção de água, constituindo reserva de energia em ambientes onde a disponibilidade de nutrientes é limitada (MOREIRA e SIQUEIRA, 2006).
Neste trabalho, o conhecimento da diversidade morfológica dos micro-organismos estudados foi considerado para fins de identificação preliminar da diversidade dos isolados, através da separação das colônias em morfoespécie. Os aspectos morfológicos, possuem importância na identificação preliminar de micro-organismos, servindo como base para prosseguir nos trabalhos de caracterização genotípica (RIBEIRO et al., 2012). No entanto a variabilidade genética foi confirmada através da caracterização molecular através das técnicas de Fingerprinting, ARDRA e posteriormente sequenciamento, para a classificação das bactérias quanto ao gênero.
5.3 CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA
5.3.1 “Fingerprinting” molecular por (GAC)5, (GTG)5 e Box-PCR
A avaliação da variabilidade genética foi realizada a partir das análises do fingerprinting molecular por meio das reações de PCR, utilizando os iniciadores (GAC)5, (GTG)5 e Box-A1.
O dendograma de similaridade baseado no fingerprinting dos isolados, obtido pelos perfis gerados pelos três iniciadores, mostrou grande variabilidade das bactérias obtidas das sementes de milho. Não houve a formação de grupos com 100% de similaridade, demonstrando que na coleção não há cópias e que todas as estirpes são únicas (figura 3). Nas sementes existe uma variedade de bactérias que pode ser instalada por meio de correntes de ar, respingos de chuva, solo, ou mesmo ser transmitida da flor para a semente. Isso explica a grande diversidade de bactérias.
As escolhas dos primers ou iniciadores são decisivas para a boa reprodutibilidade da PCR. Os mais usados são (GTG)5, (GAC)5, (GACA)5 e devido à
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 <1 mm 1_2 mm >2m m Bran ca Am ar ela Cre m e Ros a Po u co Mu ito
Tamanho da colônia Cor da colônia Quantidade de muco Fr e q u ê n ci a d o s i solado s (% )
FIGURA 2: Características fenotípicas (tamanho e cor da colônia e quantidade
de muco) das bactérias isoladas das diferentes partes do milho (endofíticas da raiz, parte aérea, rizosfera e sementes) nos três meios de cultura (Ágar nutriente, Dyg’s e YMA).
grande capacidade de detecção de polimorfismos podendo ser usado para uma grande gama de organismos (BASILIO et al, 2008)
A análise de perfil baseada na amplificação de regiões repetitivas distribuídas em todo genoma bacteriano, utilizando um único primer, a exemplo de, (GTG)5 e
Box-PCR, permite a determinação da frequência de um grupo. Os elementos Box e outras regiões repetitivas são utilizadas para métodos de impressão digital (fingerprint), que analisa regiões palindrômicas repetitivas (ANDREOTE et al., 2010).
Foi possível observar que mesmo os isolados obtidos a partir de compartimentos e meios de cultura iguais, não apresentaram mesmo perfil genético, o que sugere que são isolados diferentes entre si. Essa técnica não permite o agrupamento filogenético, sendo utilizada apenas para fins de demonstração da existência de isolados idênticos (ANDREOTE et al., 2010).
Oliveira (2012) verificou através da Box-PCR que as gramíneas forrageiras,
Brachiaria decumbens e Brachiaria humidicola, apresentaram elevada diversidade
entre os isolados bacterianos, que foram obtidos da raiz e da rizosfera das referidas espécies.
FIGURA 3: Dendrograma de similaridade obtido a partir de perfis gerados por meio
de (GAC)5, (GTG)5 e Box-PCR. Os perfis obtidos foram analisados com o programa
