3.3.1 Determinação do teor de açúcares, proteínas e compostos fenólicos 3.3.1.1 Dosagem de Açúcares Totais
A dosagem de açúcares foi realizada por meio da reação de fenol-H2SO4, com base em
uma curva de calibração, preparada a partir de uma solução padrão de D-glucose (Sigma- Aldrich), sendo realizada a leitura da absorbância em espectrofotômetro a 490 nm (DUBOIS et al., 1956).
3.3.1.2 Dosagem de Compostos Fenólicos Totais
A quantificação dos compostos fenólicos totais presentes nos extratos foi realizada utilizando o método colorimétrico de Folin-Ciocalteau, utilizando ácido gálico como padrão de referência. O reagente Folin-Ciocalteau oxida os compostos fenólicos presentes na amostra resultando em uma mudança de coloração que pode ser medida em espectrofotômetro a 760 nm (ATHUKORALA et al., 2006).
3.3.1.3 Dosagem de Proteínas
O teor total de proteínas foi estimado pelo método de Bradford, usando a proteína Albumina sérica bovina (Sigma) como padrão, com leitura da absorbância realizada a 595 nm (BRADFORD, 1976).
3.3.2 Reações de Caracterização Qualitativa de Metabólitos Secundários
As reações qualitativas para o reconhecimento de metabólitos secundários foram realizadas em colaboração com a Profa. Dra. Silvana Zucolotto, do Departamento de Farmácia/ UFRN e da mestranda Larissa Marina Pereira. Os ensaios de triagem fitoquímica dos extratos de C. leptophloeos foram desenvolvidos de acordo com Matos (1997) com algumas adaptações. Foi investigada a presença de compostos fenólicos, taninos, saponinas, flavonoides, antraquinonas, triterpenos e esteroides, alcaloides e cumarinas. A presença destas clases de metabólitos secundários foi verificada por meio do desenvolvimento de coloração específica, formação de precipitado e formação de espuma persistente, conforme especificado em cada teste.
3.3.2.1 Avaliação da presença de compostos fenólicos
Uma alíquota de 0,5 mL de cada extrato a 10 mg/mL, foi transferida para um tubo de ensaio e, posteriormente, foram adicionadas 2 gotas de solução metanólica de cloreto férrico a
2,5% (reação geral para detecção de fenóis) e então verificado o desenvolvimento de coloração característica, verde-escuro, violeta e azul.
3.3.2.2 Avaliação da presença de flavonoides
O ensaio para detecção da presença de flavonoides nos extratos foi realizado por meio da Reação de cianidina ou Shinoda. Para isto, 1 mL do extrato (10 mg/mL) filtrado foi transferido para uma cápsula de porcelana e aquecido até secura em banho-maria (50 ºC).
Após obtenção do extrato seco e frio, foi adicionado 0,2 mL de clorofórmio, esse líquido foi desprezado para eliminação da clorofila. Posteriormente, o extrato foi redissolvido com 1 mL de etanol 70% e transferido para um tubo de ensaio, 1 mL de HCl concentrado foi adicionado cuidadosamente ao tubo de ensaio, seguido pela adição de 50 mg de magnésio metálico em pó e posterior homogeneização. A reação positiva para presença de flavonoides é caracterizada pelo desenvolvimento de coloração vermelha.
3.3.2.3 Avaliação da presença de taninos
Para a detecção da presença de taninos nos extratos vegetais, 1 mL de extrato (10 mg/mL) foi transferido para um tubo de ensaio ao qual foi adicionado uma solução aquosa de gelatina a 2,5%, gota a gota, e então verificada a formação de um precipitado indicativo da presença de taninos.
3.3.2.4 Avaliação da presença de saponinas
Para a identificação da presença de saponinas, foi utilizado 0,5 mL de extrato (10 mg/mL) que foi transferido para um tubo de ensaio e, então, foi adicionado 1 mL de água destilada, o tubo de ensaio foi agitado verticalmente e vigorosamente durante 2 minutos. Posteriormente, o tubo foi deixado em repouso e foi observado se ocorria o aparecimento de espuma persistente, característica da reação positiva para a presença de saponinas.
3.3.2.5 Avaliação da presença de antraquinonas
A presença ou ausência de antraquinonas nos extratos vegetais foi verificada por meio da Reação de Bornträger direta, que tem como finalidade a detecção de antraquinonas livres. Para isso, 0,5 mL (10 mg/mL) de cada extrato foi adicionado tubos de ensaio e adicionado hidróxido de amônio diluído (10%) volume suficiente para cobrir o líquido. Posteriormente, foi então observado o desenvolvimento de coloração róseo-avermelhada, característica da presença de antraquinonas livres.
3.3.2.6 Avaliação da presença de cumarinas
Para a detecção de cumarinas nas amostras, foram adicionadas 2 gotas de cada extrato (10mg/mL) em um papel filtro, lado a lado e então adicionado sob cada extrato da direita 1 gota de KOH a 10%. Após aproximadamente três minutos, o papel filtro foi colocado na câmara escura sob luz ultravioleta. A presença de cumarinas é evidenciada pela formação de uma fluorescência de coloração verde-azulada.
3.3.2.7 Avaliação da presença de esteróides e/ou triterpenos
Em cápsulas de porcelana, foram adicionados 1 mL de cada um dos extratos brutos e levados à secura em banho-maria. O resíduo foi ressuspendido em metanol e diluído com 0,5 mL de diclorometano. Cada extrato foi então dividido em dois tubos de ensaio, o solvente evaporado novamente em banho-maria, e obteve-se a formação de resíduos nos tubos com os quais foram realizadas as reações de Liebermann-Burchard (núcleos triterpênicos e esteroidas) e Salkowski (núcleo esteroidal).
Na reação de Liebermann-Burchard o reagente de Liebermann-Burchard (2 mL de anidrido acético e 7 gotas de H2SO4 concentrado) foi adicionado lentamente pelas paredes do
tubo 1. Após 10 minutos de repouso, foi observada a formação de coloração característica azul ou verde, indicativa da presença de esteróides, ou a coloração vermelha, rosa, púrpura ou violeta, indicativa da presença de triterpenos
Realizou-se a reação de Salkowski para a determinação de núcleo esteroidal, para isso 1 mL do reativo de Salkowski (H2SO4 concentrado) foi adicionado pelas paredes do tubo 2
contendo o resíduo do extrato, e então foi observado o desenvolvimento da coloração característica castanho-escuro-avermelhado, indicativa da presença de núcleo esteroidal insaturado.
3.3.2.8 Avaliação da presença de alcaloides
Para a pesquisa da presença de alcaloides nos extratos das folhas de C. leptophloeos, 2 gotas dos extratos (10 mg/mL) foram depositadas sobre uma placa de vidro e posteriormente foram adicionadas 2 gotas de cada reagente utilizado para a detecção de alcalóides, foram eles: Dragendorff (iodo bismutato de potássio), Mayer (cloro-iodo mercurato de potássio) , Wagner (iodo iodeto de potássio) e Bertrand (ácido sílico túngstico ) tendo como reação positiva a formação de um precipitado alaranjado, branco, marrom e branco, respectivamente.
3.3.3 Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
A análise por cromatografia em camada delgada (CCD) foi realizada em colaboração com a Profa. Dra. Silvana Zucolotto, do Departamento de Farmácia/ UFRN e da mestranda Larissa Marina Pereira. Os extratos de C.leptophloeos foram analisados por CCD utilizando como fase estacionária cromatoplacas de sílica gel 60 F254 e como fases móveis, foram
utilizados sistemas eluentes específicos, ajustados de acordo com a classe de metabólitos de interesse (WAGNER; BLADT, 2001): acetato de etila: ácido fórmico: metanol: água (10: 0,5: 0,6: 0,2; v/v/v/v), tolueno: metanol: água (9: 1: 0,1; v/v/v/v) e acetato de etila: ácido fórmico: água (8: 1: 1; v/v/v).
Após a eluição, as cromatoplacas foram reveladas utilizando os reagentes: Vanilina Sulfúrica (0,5 g de vanilina, 2 mL de H2SO4, 80 mL de MeOH), como revelador universal;
Cloreto Férrico (1 g de FeCl3, 100 mL de MeOH), para detecção de compostos fenólicos;
Reagente Natural A (0,2 g de Difenilborato, 100 mL de MeOH), específico para flavonoides sendo a visualização sob luz UV a 365 nm em câmara escura e reagente de Dragendorff (solução A: 0,85 g de nitrato básico de bismuto, 10 mL de CH3COOH glacial, 40 mL de água
destilada; solução B: 16 g de KI, 40 mL de água destilada) para alcaloides. Para a detecção dos compostos fenólicos presentes nos extratos foram utilizados padrões de referência adquiridos da Sigma Aldrich (pureza ≥95%): ácido gálico, ácido elágico, ácido clorogênico, ácido ascórbico, isorientina, canferol, luteolina, quercetina, saponina, catequina, isoquercetina e vitexina.
3.3.4 Determinação dos Compostos Fenólicos por UPLC
A análise dos extratos das folhas de C. leptophloeos por Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (UPLC) foi realizada no Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos (LCQMed) do Departamento de Farmácia da UFRN, em colaboração com o Prof. Dr. Cícero Flávio Soares Aragão.
Para a análise e a separação dos compostos fenólicos nos extratos foi utilizado um cromatógrafo líquido de ultra eficiência da marca Shimadzu, composto por bomba analítica binária (LC-20A3 XR), injetor automático (SIl-20AD XR), desgaseificador (DGU- 20A3),
forno para colunas (CTO- 20AC) e detector de arranjo de diodos (SPD-M20A), com sistema controlado pelo software LC Solution®. Foi utilizada uma coluna Poroshell 120 EC-C18, da Agilent®, C18 (50 x 4,6 mm; 2,7 µm). As amostras foram injetadas na concentração de 10 mg/mL, o volume de injeção foi 2 µL. O fluxo utilizado na cromatografia foi de 0,5 mL/min A fase móvel utilizada foi um gradiente de eluição com os solventes ácido fórmico 0,1% (A) e
acetonitrila com ácido fórmico 0,1% (B), na seguinte disposição: 99% A e 1% B aos 0 min, 91% A e 9% B aos 3 min, 52% A e 48% B aos 19 min, 5% A e 95% B aos 23 min, 99% A e 1% B aos 24 min, 99% A e 1% B aos 30 min (FRACASSETTI et al., 2013).
A identificação dos compostos fenólicos foi efetuada por meio da comparação entre os espectros de absorção no UV-vísivel (280 nm e 360 nm) e tempo de retenção do pico referente ao da amostra com o padrão desta substância. Foram utilizados os padrões de ácido gálico, rutina, canferol, pirogalol (Sigma Aldrich- pureza ≥95%) e quercetina (USP- pureza 98,8%), na concentração de 10 mg/mL.
3.4 ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS