UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
MARIA LÚCIA DA SILVA CORDEIRO
CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DO EFEITO
ANTIOXIDANTE E CITOTÓXICO DE EXTRATOS DAS FOLHAS
DE IMBURANA DE ESPINHO (Commiphora leptophloeos) (Mart.)
J.B. Gillett (BURSERACEAE)
NATAL/RN
2018
MARIA LÚCIA DA SILVA CORDEIRO
CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DO EFEITO
ANTIOXIDANTE E CITOTÓXICO DE EXTRATOS DAS FOLHAS
DE IMBURANA DE ESPINHO (Commiphora leptophloeos) (Mart.)
J.B. Gillett (BURSERACEAE)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Orientador: Katia Castanho Scortecci
Co-Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.
NATAL/RN
2018
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Cordeiro, Maria Lúcia da Silva.
Caracterização fitoquímica e avaliação do efeito antioxidante e citotóxico de extratos das folhas de imburana de espinho (Commiphora leptophloeos) (Mart.) J.B. Gillett (Burseraceae) /
Maria Lúcia da Silva Cordeiro. - 2018. 84f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Biociências, Programa de Pós-graduação em
Bioquímica, Natal, 2018.
Orientador: Katia Castanho Scortecci. Coorientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.
1. Prospecção - Dissertação. 2. Extrato - Dissertação. 3. Compostos bioativos - Dissertação. I. Scortecci, Katia Castanho.
II. Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira. III. Título. RN/UF/BCZM CDU 577.1
Dedico esta obra a minha querida família, em especial a minha mãe Mª Rita Ferreira da Silva Cordeiro por todo incentivo, orações e amor incondicional, e ao meu esposo Júnior, por todo
apoio, compreensão, paciência e amor em todos os momentos, que foram indispensáveis durante essa jornada.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte e ao Programa de Pos-graduação em Bioquímica.
A minha orientadora, Profa. Dra Katia Castanho Scortecci pela orientação do trabalho, pela confiança, ensinamentos, e por ter me dado a oportunidade de participar deste projeto e
realizar um sonho. Muito obrigada!
Ao meu Co-orientador Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, pela concessão do uso de seu laboratório e pelos ensinamentos fundamentais para a realização deste trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo financiamento desta pesquisa.
Aos professores do Departamento de Bioquímica pela transmissão de seus conhecimentos e atenção dedicada a mim.
Aos colegas e amigos do grupo de pesquisa do Laboratório de Transformação de Plantas e Análise de Microscopia (LTPAM) pelo carinho, ajuda, palavras de incentivo e apoio sempre que eu precisei, bem como pela divertida convivência. Agradeço em especial a minha amiga
Ana Raquel pela amizade sincera, ensinamentos, cumplicidade, paciência e parceria na condução dos experimentos no laboratório e em todos os momentos. Muito obrigada por
terem me acolhido tão bem!
Aos colegas do Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL) que me ajudaram muito na condução dos testes antioxidantes in vitro (Moacir) e ensaios de
citotoxicidade (Jeferson, Gabriel e Tiago). Muito obrigada!
Ao Laboratório de Produtos Naturais (PNBio) da UFRN, na pessoa da Profa. Dra. Silvana Zucolotto e de sua aluna Larissa Marina Pereira Silva pela colaboração nos ensaios qualitativos de detecção de metabólitos secundários e na realização da Cromatografia em
Ao Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos (LCQMed) na pessoa do Prof. Dr. Cícero Flávio Soares Aragão, pela colaboração na análise por Cromatografia Líquida de
Ultra Eficiência.
Ao Laboratório de Genética Bioquímica (LGB) na pessoa da Profa. Dra. Riva de Paula Oliveira, pela colaboração nos ensaios de toxicidade e de capacidade antioxidante in vivo.
Agradeço em especial aos queridos colegas Ricardo Basílio e Cesar Orlando por toda animação, ensinamentos e disposição em me ajudar sempre que precisei.
Aos meus pais por todo carinho e cuidado, dedicados a mim e aos meus irmãos. Em especial a minha mãe Maria Rita por seu amor incondicional, por sempre acreditar em mim e me
incentivar a lutar pelos meus sonhos.
Aos meus queridos irmãos Marcos, Márcia e Miltom por todo o carinho, incentivo e apoio durante minha jornada acadêmica. Amo vocês!
Ao meu esposo, Júnior por todo companheirismo, compreensão e demonstrações de amor e carinho a mim, sempre me encorajando a prosseguir nessa etapa tão importante em minha
vida.
As minhas amigas Isabella, Carla e Caroline pelo amor e amizade verdadeira. Mesmo distantes fisicamente estão sempre ao meu lado, torcendo pelas minhas vitórias e me fazendo
acreditar que sou capaz. Amo vocês para sempre!
A todos aqueles que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho, meus sinceros agradecimentos!
Agradeço em especial a Deus, que por sua infinita bondade permite coisas maravilhosas em minha vida, como conhecer pessoas que me ajudaram no desenvolvimento desse trabalho e ter
uma família maravilhosa. Sou grata ao Senhor por me conceder paciência, força e coragem para prosseguir diante das dificuldades, me capacitando para a conquista dessa vitória.
CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTIOXIDANTE E CITOTÓXICO DE EXTRATOS DAS FOLHAS DE IMBURANA DE ESPINHO (Commiphora leptophloeos) (Mart.) J.B. Gillett (BURSERACEAE)
RESUMO
Commiphora leptophloeos (Mart.) J. B. Gillett, popularmente conhecida como “Imburana de
espinho” é uma planta nativa da Caatinga que apresenta uma vasta utilização medicinal para o tratamento de diversas patologias. No entanto, foram descritos poucos estudos químicos e farmacológicos sobre esta espécie vegetal. O presente estudo compreendeu a caracterização fitoquimica dos extratos obtidos a partir das folhas frescas da espécie Commiphora leptophloeos, avaliação de seu potencial antioxidante in vitro e in vivo, e seu potencial citotóxico sobre células normais e tumorais. Por meio de uma extração seriada, com solventes em ordem crescente de polaridade, foram obtidos os extratos: hexânico (EH), clorofórmico (EC), etanólico (EE), metanólico (EM) e aquoso residual (EAR). Conjuntamente foi preparado um extrato aquoso (EA), adotando uma metodologia similar ao seu uso popular. Foi realizada a caracterização fitoquímica por meio da quantificação de compostos fenólicos, açúcares e proteínas totais, ensaios qualitativos de detecção de metabólitos secundários, análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (UPLC). Para avaliação das atividades farmacológicas foram realizados ensaios in vitro de atividade antioxidante e o ensaio de citotoxicidade MTT. Os resultados da triagem fitoquímica qualitativa permitiram a observação diferentes grupos de metabólitos secundários. Por meio da CCD foi possível detectar a presença de compostos fenólicos, terpenos, flavonoides, ácidos fenólicos, taninos e saponinas, com destaque para o EE e EM. Com a análise por Co-CCD para os EE e EM foi verificada a presença dos flavonoides isoquercetina e luteolina. A análise por UPLC identificou rutina nessas amostras. Quanto à atividade antioxidante, os ensaios demonstraram que todos os extratos possuem capacidade antioxidante in vitro, com destaque para o EE e EM. Com base nesses resultados, o efeito do EE foi avaliado em ensaios in vivo utilizando o modelo animal Caenorhabditis elegans. Estes ensaios revelaram a ausência de toxicidade e seu potencial em reduzir cerca de 50% dos níveis intracelulares de ERO neste modelo animal. O ensaio MTT celular mostrou que os extratos não foram citotóxicos para as células 3T3 (não tumorais) e foram capazes de reduzir a viabilidade da linhagem de células tumorais B16-F10 em até 45%. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a espécie C. leptophloeos pode ser uma potencial fonte de compostos bioativos com potencial antioxidante e antitumoral.
Palavras-chave: Prospecção, Extrato, Compostos bioativos, Caenorhabditis elegans, cultura celular 3T3 e B16-F10.
PHYTOCHEMICAL CHARACTERIZATION AND EVALUATION OF ANTIOXIDANT AND CYTOTOXIC EFFECTS FROM EXTRACTS OBTAINED FROM IMBURANA DE ESPINHO LEAVES (Commiphora leptophloeos) (Mart.) J.B. Gillett (BURSERACEAE)
ABSTRACT
Commiphora leptophloeos (Mart.) J. B. Gillett, folk knwon as “Imburana de espinho”, is a
native plant from Caating. This plant is popular used for diferent patologies. However, few scientific data is available related to its biological activities. In this work, extracts from fresh leaves through a serial extraction using different solvents in growing polarity order were obtained: hexanic (EH), chloroformic (CE) ethanolic (EE), methanolic (EM), residual aqueous (EAR). Besides, it was done another extract called as water extract (EA) similar as the one produced in folk medicine. The phytochemical characterization was done by measuring the phenolic compounds, total proteins and sugars. It was also done a qualitative assay by thin-layer chromatography (TLC) and by ultra-high performance liquid chromatography (UPLC). Furthermore, it was also analyzed in vitro antioxidant activity and in vitro cell viability by MTT assay. The results obtained with TLC showed the presence of phenolic compounds, terpenes, flavonoids, phenolic acids, tannins and saponins in special for the EE and EM. The Co-TLC analysis showed the presence of flavonoids luteolin and isoquercetina for the EE and EM. Moreover, UPLC analysis identified rutin in these samples. The antioxidant assays showed that all extracts have the antioxidant capacity in vitro, in special for the EE and EM. Based on these results, it was analyzed the EE effect on the animal model Caenorhabditis elegans. This in vivo assay showed that the EE was able to reduce in 50% of the ROS
intracellular levels from this animal model. Furthermore, the MTT assay showed that EE was not cytotoxicfor 3T3 cell lineage; on the other hand, for the B16-F10 cell lineage (tumor cell) it was observed a 45% reduction. Taken together, these results propose that C. leptophloeos has a potential source of bioactive compounds with antioxidant and antitumor potential.
Key-words: Prospection, Imburana de espinho, Extract, Bioactive compounds, Caenorhabditis elegans, 3T3 and B16-F10 cell culture.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Distribuição da Imburana de Espinho (Commiphora leptophloeos) no Brasil. ... 21
Figura 2-Espécie Commiphora leptophloeos.. ... 21
Figura 3- Produção e eliminação de ERO e controle da homeostase redox.. ... 23
Figura 4-Ilustração simplificada dos principais processos envolvidos na formação de ERO.24 Figura 5- Exemplos de compostos fenólicos. ... 26
Figura 6- Ciclo de vida do C. elegans. ... 27
Figura 7- Fluxograma esquemático do processo de obtenção dos extratos das folhas de C. leptophloeos.. ... 33
Figura 8-Fluxograma experimental ilustrativo das análises realizadas com os extratos de C. leptopholeos...41
Figura 9- Presença de compostos fenólicos... 47
Figura 10-Reação positiva para a presença de flavonóides.. ... 47
Figura 11- Resultado da reação para pesquisa de cumarinas ... 48
Figura 12- Resultado da reação de Liebermann-Burchard. ... 48
Figura 13- Resultado do ensaio para detecção do núcleo esteróidal nos extratos. ... 49
Figura 14- Detecção de compostos fenólicos em extratos folhas de C. leptophloeos por CCD... 49
Figura 15- Detecção de flavonóides e ácidos fenólicos nas folhas de C. leptophloeos por CCD...50
Figura 16-Presença de compostos terpenos em extratos das folhas de C. leptophloeos detectada por CCD...51
Figura 17- Co-CCD dos extratos de C. leptophloeos ... 52
Figura 18- Análise do perfil cromatográfico dos extratos das folhas de C. leptophloeos por UPLC (360nm).. ... 55
Figura 19- Capacidade Antioxidante Total dos extratos das folhas de C. leptophloeos ... 56
Figura 20- Poder redutor dos extratos das folhas de C.leptophloeos ... 57
Figura 21- Potencial de sequestrodo radical DPPH dos extratos das folhas de C. leptophloeos ... 58
Figura 22- Atividade quelante de cobre dos extratos das folhas de C.leptophloeos ... 59
Figura 23- Atividade quelante de ferrodos extratos das folhas de C.leptophloeos. ... 59
Figura 24- Potencial de sequestro do radical superóxido dos extratos das folhas de C. leptophloeos ... 60
Figura 25- Efeito do extrato etanólico de C. leptophloeos sobre a eclosão dos ovos de C.
elegans. ... 63
Figura 26- Efeito do EE sobre o desenvolvimento do C. elegans. ... 64 Figura 27- Níveis de ERO em C. elegans expostos ao EE de C.leptophloeos. ... 65 Figura 28- Efeito do EE sobre a expressão do gene sod-3::GFP em condições normais em C.
elegans ... 66
Figura 29- Atividade citotóxica dos extratos das folhas de C. leptophloeos sobre a linhagem
normal 3T3 (A) e a linhagem tumoral B16 (B), após 24h de incubação ... 67
Figura 30-Esquema ilustrativo do potencial citotóxico e antioxidante de extratos de C.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Diluição dos extratos em dimetilsulfóxido (DMSO) e em água...33 Tabela 2- Rendimento percentual dos extratos obtidos a partir das folhas de Comminphora
leptophloeos...45
Tabela 3- Teor de três componentes químicos dos extratos das folhas de C.leptophloeos ... 46 Tabela 4- Triagem fitoquímica qualitativa dos extratos de Commiphora leptophloeos ... 46 Tabela 5- Metabólitos presentes nos extratos das folhas de C. leptophloeos detectadas
porCromatografia em Camada Delgada (CCD) ... 53
Tabela 6- Correlação entre o teor de compostos fenólicos e os resultados dos ensaios de
atividade antioxidante, obtidos para os extratos das folhas de C. leptophloeos ... 61
Tabela 7- Correlação entre o teor de açúcares e os resultados dos ensaios de atividade
antioxidante,obtidos para os extratos das folhas de C. leptophloeos ... 61
Tabela 8- Correlação entre o teor de proteínas e os resultados dos ensaios de atividade
LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS
CAT Capacidade Antioxidante Total CCD Cromatografia em Camada Delgada CF Compostos Fenólicos
DMEM Meio de Cultura Eagle modificado Dulbecco DMSO Dimetilsufóxido
DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
EA Extrato Aquoso das folhas de Comminphora leptophloeos
EAR Extrato Aquoso Residual das folhas de Comminphora leptophloeos EC Extrato Clorofórmico das folhas de Comminphora leptophloeos EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EE Extrato Etanólico das folhas de Comminphora leptophloeos EAA Equivalente de ácido ascórbico
EH Extrato Hexânico das folhas de Comminphora leptophloeos EM Extrato Metanólico das folhas de Comminphora leptophloeos ERO Espécies Reativas de Oxigênio
GFP Proteína Verde Fluorescente
H2DCFDA 2,7-Diclorofluoresceína – Diacetato
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium NBT Nitroazul de tetrazólio
NGM Meio de crescimento de nematoides
RNS Espécies Reativas de Nitrogênio RPM Rotações por minuto
SFB Soro fetal bovino
SISBIO Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade TCA Ácido tricloroacético
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...17
1.1 Uso de Plantas medicinais...17
1.2 Burseraceae...18
1.3 Commiphora...19
1.4 Commiphora leptophloeos (Mart.) J. B. Gillett...20
1.5 Radicais livres, Estresse oxidativo e Defesa antioxidante...22
1.6 Metabólitos secundários vegetais como Antioxidantes...25
1.7 Organismo modelo Caenorhabditis elegans...27
1.8 Câncer, ERO e Metabólitos secundários vegetais...28
2 OBJETIVOS ... ...31
2.1 Objetivo Geral ... 31
2.2 Objetivos Específicos ... 31
3 MATERIAL E MÉTODOS ... 32
3.1 Coleta do Material Vegetal ... 32
3.2 Obtenção dos Extratos Vegetais ... 32
3.3 Caracterização Fitoquímica ... 34
3.3.1 Determinação do teor de açúcares, proteínas e compostos fenólicos ... 34
3.3.1.1 Açúcares Totais ... 34
3.3.1.2 Dosagem de Compostos Fenólicos Totais ... 34
3.3.1.3 Dosagem de Proteínas...34
3.3.2 Reações de Caracterização Qualitativa de Metabólitos Secundários...34
3.3.2.1 Avaliação da presença de Compostos Fenólicos...34
3.3.2.2 Avaliação da presença de Flavonoides...35
3.3.2.3 Avaliação da presença de Taninos...35
3.3.2.4 Avaliação da presença de Saponinas...35
3.3.2.5 Avaliação da presença de Antraquinonas...35
3.3.2.6 Avaliação da presença de Cumarinas...36
3.3.2.7 Avaliação da presença de esteróides e/ou triterpenos...36
3.3.2.8 Avaliação da presença de Alcaloides...36
3.3.3 Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)...37
3.3.4 Determinação de Compostos fenólicos por UPLC ... 37
3.4.1 Avaliação da atividade antioxidante in vitro...38
3.4.1.1 Capacidade Antioxidante Total (CAT)... 38
3.4.1.2 Poder Redutor...38
3.4.1.3 Ensaio de sequestro de radicais DPPH...39
3.4.1.4 Quelação de ferro... 39
3.4.1.5 Quelação de Cobre...39
3.4.1.6 Sequestro do radical superóxido... 40
3.4.2 Avaliação da toxicidade e efeito antioxidante do extrato etanólico (EE) de C. leptophloeos sobre Caenorhabditis elegans...40
3.4.2.1 Linhagens, cultivo e sincronização do modelo in vivo C. elegans...41
3.4.2.2 Avaliação da toxicidade do EE de C. leptophloeos sobre a reprodução e o crescimento de Caenorhabditis elegans...42
3.4.2.2.1 Efeito do EE sobre a eclosão dos ovos de C. elegans...42
3.4.2.2.2 Efeito do EE sobre o crescimento de C. elegans...42
3.4.2.3 Avaliação do potencial antioxidante in vivo...42
3.4.2.3.1 Mensuração dos nível intracelular de espécies reativas de oxigênio...42
3.4.2.3.2 Análise da expressão genética de sod-3::GFP...43
3.4.3 Avaliação da atividade citotóxica dos extratos de C. leptophloeos...43
3.5 Análise Estatística ... 44
4 RESULTADOS ... 45
4.1 Rendimento do processo de extração ... 45
4.2 Caracterização Fitoquímica ... 45
4.2.1 Determinação do conteúdo total de açúcar, proteínas e compostos fenólicos...45
4.2.2 Reações de Identificação de Metabólitos Secundários...46
4.2.3 Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ... 49
4.2.4 Análise dos extratos das folhas de C. leptophloeos por UPLC...53
4.3 Avaliação de Atividades Farmacológicas ... 56
4.3.1 Avaliação da atividade antioxidante in vitro ... 56
4.3.1.1 Capacidade Antioxidante Total (CAT)... 56
4.3.1.2 Poder Redutor...57
4.3.1.3 Sequestro do radical DPPH...57
4.3.1.4 Atividade Quelante de Cobre ... 58
4.3.1.5 Atividade Quelante de Ferro... 59
4.3.1.7 Coeficiente de Correlação Linear de Pearson (r2)...60
4.3.2 Avaliação da toxicidade e atividade antioxidante do EE no modelo animal Caenorhabditis elegans...62
4.3.2.1 Ensaios de Toxicidade...62
4.3.2.1.1 Análise da eclosão dos ovos...62
4.3.2.1.2 Análise do tamanho dos animais...63
4.3.2.2 Atividade antioxidante in vivo, no modelo animal C. elegans...64
4.3.2.2.1 Análise do nível intracelular de ERO...64
4.3.2.2.2 Quantificação de expressão de sod-3::GFP...65
4.3.3 Atividade citotóxica dos extratos de C. leptophloeos sobre células não tumorais e tumorais...66
5 DISCUSSÃO...68
5.1 Caracterização fitoquímica dos extratos de C.leptophloeos...68
5.2 Atividade antioxidante dos extratos de C. leptopholeos in vitro...70
5.3 Avaliação da toxicidade e das propriedades antioxidantes in vivo do EE C. leptophloeos em C. elegans...72
5.4 Efeito citotóxico dos extratos de C. leptopholeos...74
6 CONCLUSÕES ... 77
7 PERSPECTIVAS ...78
1. INTRODUÇÃO
1.1 Uso de Plantas medicinais
As plantas medicinais destacam-se como uma importante alternativa terapêutica para a recuperação e manutenção da saúde das pessoas, especialmente, para a população de baixa renda, sendo amplamente utilizadas com o objetivo de substituir ou auxiliar as terapias convencionais no tratamento de várias doenças (LIMA et al., 2013). O seu potencial curativo e baixo custo têm contribuído para o aumento da sua utilização pelas sociedades industrializadas ao longo dos anos (DUTRA, 2009).
O uso de plantas para fins medicinais é tão antigo quanto o aparecimento da espécie humana na Terra. Como o homem primitivo era dependente essencialmente da natureza para manter a sua sobrevivência, ele fazia uso principalmente das plantas medicinais para curar-se e com sua evolução foram então surgindo novas terapias (ALMEIDA, 2011). De acordo com Lima (2006), os chineses, egípcios, hindus e gregos foram os primeiros a catalogar ervas medicinais, classificando-as de acordo com sua forma, cor, sabor e aroma. Acreditando que estas possuíam atributos mágicos, esses povos manipulavam e utilizavam as plantas para muitos fins terapêuticos.
Plantas com propriedades medicinais foram muito utilizadas em quase todos os países ao longo da história. Sua eficiência foi sendo demonstrada por povos antigos ao utilizá-las no combate a diferentes doenças (BADKE et al., 2011). Esse conhecimento empírico sobre a utilização medicinal de plantas foi adquirido, acumulado com o passar dos anos e transmitido de maneira tradicional através da cultura popular, até os dias atuais, o que contribui muito para a divulgação das propriedades terapêuticas das plantas (PASA; AVILA, 2010).
As plantas são capazes de sintetizar várias substâncias com propriedades terapêuticas a partir de seu metabolismo, o que as torna uma potencial fonte para a obtenção de novos medicamentos. Assim, as pesquisas com vegetais podem contribuir com o desenvolvimento de novos fitoterápicos, bem como favorecer a elucidação de substâncias isoladas com potencial terapêutico contra muitas doenças (MARIOT; BARBIERI, 2007; PHILIPPSEN, 2010). Muitos fármacos obtidos a partir de plantas encontram-se disponíveis no mercado. Além disso, diversos fitoquímicos foram identificados e estudados tendo em vista a produção de novos fármacos (NETO, 2009).
No Brasil, a utilização de plantas medicinais pela população é frequente (BOCHNER et al., 2012). Por ser detentor da mais diversa flora do mundo, este país concentra alto nível de biodiversidade, possuindo alguns dos biomas mais ricos do planeta em número de espécies vegetais, bem como a maior taxa de endemismo (CORADIN, 2011). Apesar da riqueza e do potencial medicinal que apresentam, muitas espécies de plantas nativas do país ainda são utilizadas de forma empírica na medicina popular, sem base científica quanto à eficácia e segurança, demonstrando que em um país de biodiversidade enorme como o Brasil, existe um déficit de pesquisas, frente a uma elevada quantidade de moléculas a serem descobertas (FOGLIO et al., 2006; SANTOS et al., 2011).
Dentre os biomas brasileiros destaca-se a Caatinga, único bioma exclusivo do país e o mais expressivo da região Nordeste, compreendendo cerca de 80% da área geográfica do Semiárido brasileiro. Caracteriza-se pela adaptação de espécies vegetais a fatores típicos da região como déficit hídrico e altas temperaturas associadas à alta intensidade luminosa, que provocam uma demanda evaporativa alta, resultando na dessecação do solo (TROVÃO et al., 2007; ARAÚJO FILHO, 2013), fatores relacionados com o aumento da produção e acumulação de vários compostos antioxidantes em plantas (KASOTE et al., 2015). Apesar do crescente número de estudos científicos associando composição fitoquímica e atividades farmacológicas, numerosas espécies de plantas endêmicas e de comum uso medicinal permanecem pouco conhecidas e negligenciadas pela comunidade científica (MEDEIROS et al., 2013).
1.2 Burseraceae
A Burseraceae é formada por aproximadamente 700 espécies e abrange 18 gêneros (WEEKS et al., 2005). Suas espécies estão disseminadas em todas as regiões tropicais e subtropicais do mundo, principalmente em regiões áridas do nordeste da África, Arábia, América tropical, Ásia, Austrália e Madagascar (RUIZ; SUSUNAGA, 2000). No Brasil sete diferentes gêneros pertencentes à Burseraceae foram identificados (Commiphora, Bursera,
Crepidospermum, Dacryodes, Protium, Tetragastris e Trattinnickia), além de 100 espécies,
das quais 20 são endêmicas, sendo encontradas nos biomas, Amazônia, Caatinga, Cerrado e Mata Atlântica (SILVA, 2012).
Burseraceae é composta por plantas com potencial medicinal cujas folhas e cascas são utilizadas pela população como anti-inflamatório, antitumoral e adstringente (QUEIROZ et al., 2006). Algumas culturas indígenas utilizam ainda as plantas pertencentes à Burseraceae no tratamento de feridas, como potentes cicatrizantes, em tratamentos para asma, diarreia, cálculos
renais, picada de cobra, tuberculose, hemorroidas e hérnias (OLIVEIRA, 2005; LEMUS, 2011). Além do uso medicinal, as resinas e as folhas apresentam outras aplicações, como na fabricação de vernizes e tintas, cosméticos, repelentes de insetos e calafetação de barcos (LIMA, 2001).
Esta família é composta por arbustos e árvores, e se caracteriza pela exsudação de uma resina aromática, principalmente de seu tronco. Popularmente conhecida como copal, maaliol, breu, gugul e mirra, esta resina exala um aroma que contribui para a utilização das espécies que compõem essa família (RUDIGER, 2012). Encontrada em quase todas as partes da planta, é uma importante fonte de linalol, um monoterpeno presente na composição de alguns perfumes (QUEIROZ et al., 2006).
Estudos das resinas obtidas a partir de diferentes partes de espécies Burseraceae, como folhas, frutos e madeira, demonstram uma composição química principalmente terpênica, com grandes quantidades de monoterpenos, sesquiterpenos e triterpenos. Além disso, foram identificados outros metabólitos secundários, como, cumarinas, flavonoides e lignoides (RUDIGER et al., 2007; GADIR; AHMED, 2014).
1.3 Commiphora
O gênero inclui mais de 150 espécies de plantas, que são comumente utilizadas na medicina tradicional e estão distribuídas em regiões áridas tropicais e subtropicais do mundo, principalmente, no norte da África oriental, no sul da Arábia e na Índia (MOHAMED et al., 2015; GERMANO et al., 2017), sendo a espécie Commiphora leptophloeos (Mart.) J. B. Gillett nativa e endêmica do Brasil.
Espécies de Commiphora são caracterizadas como pequenas árvores ou arbustos com ramos espinhosos, cascas de cor pálida-acinzentada e presença de exsudatos resinosos avermelhados (SULEIMAN, 2015). Esses exsudatos são extraídos frequentemente por nativos, por meio de incisões no caule, que permitem a liberação de uma oleorresina amarelada que quando exposta ao ar, seca, endurece e torna-se marrom avermelhada (HANUS et al., 2005).
A resina perfumada produzida por espécies de Commiphora, conhecida popularmente como mirra, é parcialmente solúvel em etanol, água e éter, e tem sido utilizada há muito tempo na medicina tradicional em toda a Índia, China, Roma, Grécia e Babilônia (HANUS et al., 2005; SHEN et al., 2012). Comunidades fazem seu uso medicinal para tratar resfriados, febre, malária, dores, fraturas, inflamações, reumatismo, infecções, congestão nasal, dor de garganta, febre, além de utilizá-la como repelente (PARASKEVA et al., 2008; SHEN et al., 2012).
Diversas aplicações farmacológicas são encontradas na literatura reportando ação de plantas do gênero Commiphora com comprovado potencial antioxidante e anti-inflamatório (DEEPA et al.,2009; KHANNA et al., 2010; FRATERNALE et al., 2011; SILVA et al., 2013), repelente e larvicida (DA SILVA, 2015) antibacteriano e antifúngico (FRATERNALE et al., 2011; GADIR; AHMED, 2014; IBRAHIM et al., 2016; PEREIRA et al., 2017), cicatrizante, analgésico e antipirético (SHEN et al., 2012; CABRAL; PITA; SALGUEIRO, 2014), anti-hiperglicêmico e hipolipidêmico (KHANNA et al., 2010; RAMESH; SARALAKUMARI, 2012) antitumoral (PARASKEVA et al., 2008; SHEN et al., 2012).
Investigações fitoquímicas anteriores do gênero Commiphora sugeriram a presença de terpenos, flavonoides, lignanas e esteroides. Ainda que mais de 300 moléculas tenham sido identificadas neste gênero, terpenos, principalmente, sesquiterpenos e triterpenos são os constituintes mais abundantes (SHEN et al., 2012; SULEIMAN, 2015; EL-GAMAL et al., 2017; PEREIRA et al., 2017).
Embora existam estudos químicos e farmacológicos envolvendo espécies deste gênero, a resina do caule é em sua maioria o alvo das investigações, havendo ainda uma deficiência de estudos envolvendo as demais partes da planta (SHEN et al., 2012).
1.4 Commiphora leptophloeos (Mart.) J. B. Gillett
Commiphora leptophloeos (Mart.) J. B. Gillett, conhecida popularmente como
imburana, imburana de espinho, imburana de cambão e imburana do sertão, é uma espécie pertencente à Burseraceae, endêmica, nativa da Caatinga e do Pantanal. Esta espécie encontra-se amplamente distribuída no Nordeste Brasileiro, ocorrendo também em estados das regiões Centro-Oeste e Sudeste (Figura 1) (CARVALHO, 2009; PEREIRA et al., 2017).
Figura 1- Distribuição da Imburana de Espinho (Commiphora leptophloeos) no Brasil. Os círculos em verde representam os locais onde foi documentada a presença dessa espécie. Fonte: Carvalho, 2009
C. leptophloeos apresenta um porte arbustivo, podendo atingir cerca 12 metros de
altura e 60 cm de diâmetro quando na idade adulta. Apresenta copa esgalhada, tronco tortuoso com espinhos agudos e fortes, pequenas flores e folhas de coloração verde clara, fruto oleífero e comestível quando maduro (CARVALHO, 2009; COELHO, FARGNOLI, ROCHA, 2015). Pode ser prontamente reconhecida pelo seu tronco de coloração avermelhada e suas cascas esfoliantes que se soltam em lâminas (Figura 2) (SILVA et al., 2012).
Estudos etnobotânicos relatam o uso medicinal da espécie C. leptophloeos com diferentes finalidades terapêuticas. Atualmente a população utiliza preparações como infusão, decocção e maceração obtidas a partir da casca e das folhas da planta para tratar gastrite, diarreia, como cicatrizante, anti-inflamatório e anti-cancerígeno (ROQUE, 2008; NETO et al., 2014; COELHO; FARGNOLI; ROCHA, 2015). O xarope (lambedor) da casca também é utilizado popularmente para tratar gripe, inflamação de garganta, asma e bronquite (FREITAS; COELHO, 2014; RIBEIRO et al., 2014). Baseado no exposto sugere-seque esta espécie seja uma fonte de compostos com potencial farmacológico. Portanto, estudos de composição fitoquímica assim como, possíveis achados de ordem farmacológica para Commiphora
leptophloeos, tornam-se de grande relevância.
1.5 Radicais livres, Estresse oxidativo e Defesa antioxidante
Os radicais livres são átomos, moléculas ou íons que possuem elétrons não emparelhados, fato que os torna altamente instáveis e capazes de reagir rapidamente com outras moléculas. Estes agentes podem derivar principalmente do oxigênio, dando origem às espécies reativas de oxigênio (ERO) como é o caso do radical superóxido, e do nitrogênio, originando espécies reativas de nitrogênio (ERN) como o oxido nítrico, entre outros (CAROCHO; FERREIRA, 2013; SILVEIRA, 2014).
Os radicais livres apresentam importantes funções no organismo e são produzidos normalmente pelo metabolismo celular, desempenhando papéis benéficos em processos fisiológicos celulares, como na defesa contra agentes infecciosos, mecanismos de sinalização celular e na indução de uma resposta mitogênica (JIMÉNEZ et al., 2016). Níveis baixos a moderados de ERO são, inclusive, essenciais para proliferação, diferenciação e sobrevivência celular (TRACHOOTHAM et al., 2009). No entanto, o desbalanço entre a produção e degradação desses agentes gera quantidades excessivas do mesmo que podem danificar diretamente muitas moléculas das células, incluindo lipídios, proteínas, açúcares e ácidos nucléicos, como apresentado na figura 3 (GUIMARÃES et al., 2010; CRAFT et al., 2012). Além disso, níveis de radicais livres que excedem os níveis fisiológicos adequados, podem levar a interrupção das atividades celulares resultando em doenças e até em morte (TRACHOOTHAM et al., 2009; SINGH et al., 2010).
Figura 3- Produção, eliminação de ERO e controle da homeostase redox. Nas células a permanência do desbalanço redox, causado pela superprodução ou pelo declínio na capacidade do organismo de eliminar ERO, é uma condição conhecida como estresse oxidativo que está associada com o desenvolvimento de muitas doenças. Adaptado de Panieri e Santoro, 2016.
Embora as espécies reativas de oxigênio sejam produzidas na célula de forma endógena, principalmente, a partir da mitocôndria, retículo endoplasmático e peroxissomos (MOLDOVAN; MOLDOVAN, 2004), sua produção nas também se dá em resposta a diferentes estímulos exógenos, como radiação ultravioleta, radiação ionizante, fumaça do tabaco, infecções por patógeno, toxinas ambientais e exposição do organismo a herbicidas ou inseticidas (CAROCHO; FERREIRA, 2013; AYALA et al., 2014).Vale lembrar que fatores relacionados ao estilo de vida, tais como tabagismo, obesidade, álcool, atividade física e dieta podem contribuir com o aumento nos níveis de espécies reativas (BARBOSA et al., 2010).
O equilíbrio entre a produção e a neutralização de ERO por antioxidantes é muito delicada. O desequilíbrio permanente causado pela produção excessiva de espécies reativas de oxigênio ou a incapacidade do organismo de reduzir as ERO que são produzidas normalmente por suas células, representa o processo conhecido como estresse oxidativo (Figura 3), que apresenta como consequência lesão às células, tecidos e órgãos (WIERNSPERGER, 2003; AYALA et al., 2014).
O estresse oxidativo é amplamente reconhecido como um fator que contribui para o desenvolvimento de doenças crônicas (SINGH et al., 2010). Já se sabe inclusive que este está criticamente associado com o desenvolvimento de muitas doenças graves como câncer, doenças cardiovasculares, artrite, diabetes, inflamação e doenças renais, distúrbios hepáticos, hipertensão, Alzheimer, Parkinson, úlceras gástricas, dentre outras (TRACHOOTHAM et al., 2009).
De acordo com Lu e colaboradores (2010), visando conter o dano oxidativo induzido por ERO, o corpo humano e outros organismos desenvolveram um sistema de defesa
antioxidante que integra a ação de enzimas, substâncias com atividade quelante de metais, e agentes eliminadores de radicais livres, para neutralizar esses radicais após sua formação. Os autores afirmam ainda que a ingestão de antioxidantes por meio da alimentação contribui para a manutenção de um estado antioxidante adequado no organismo. Esses agentes podem atuar eliminando ERO diretamente e/ou indiretamente por meio da regulação das defesas antioxidantes ou inibindo a produção de novas espécies reativas (PAIVA et al., 2015; KASOTE et al., 2015).
O sistema integrado de defesa antioxidante desenvolvido pelo organismo humano para lidar com o estresse oxidativo pode ser dividido em dois grandes grupos, o sistema antioxidante enzimático, composto pelas enzimas superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase (Figura 4) e, o não enzimático, que inclui diversas substâncias antioxidantes de origem endógena ou obtidas pela dieta, como glutationa, vitamina E, vitamina C e carotenoides, além de uma categoria grande e heterogênea de fitoquímicos (McLEAN et al., 2005; CAROCHO; FERREIRA, 2013).
Figura 4- Ilustração simplificada dos principais processos envolvidos na formação de ERO. O radical superóxido (O2•-) por dismutação espontânea, ou enzimática pela ação da superóxido dismutase (SOD), gera H2O2 que por meio da reação de Fenton (linha laranja) que envolve a participação de metais de transição, pode produzir o radical hidroxila (OH•- representado em vermelho). Este corresponde a uma espécie química extremamente reativa capaz de causar diversos danos celulares. O radical superóxido também pode reagir com a forma oxidada de metais de transição pela reação de Haber-Weiss gerando a forma reduzida destes metais contribuindo com a manutenção do ciclo redox. Finalmente o peróxido de hidrogênio pode ser convertido em água pelas enzimas catalase (CAT) ou glutationa peroxidade (GPx). Adaptado de Samoylenko et al. (2013) e Losada-Barreiro; Bravo-Díaz (2017).
As plantas possuem uma capacidade inata de sintetizar compostos antioxidantes não enzimáticos. Em condições de estresse biótico ou abiótico, a produção de espécies reativas de oxigênio aumenta nas plantas, induzindo o estresse oxidativo. Como resposta, há um aumento na produção e acumulação de vários antioxidantes, que podem atuar eliminando radicais livres diretamente, e por meio do sequestro e quelação de metais de transição (como ferro e cobre), que participam ativamente da geração de novos radicais por meio das reações de Fenton e Haber-Weiss (Figura 4). Esse fato faz das plantas medicinais uma das principais fontes naturais para a obtenção de moléculas com potencial antioxidante (AYALA et al., 2014; KASOTE et al., 2015).
1.6 Metabólitos secundários vegetais como antioxidantes
As plantas produzem uma grande diversidade de componentes orgânicos conhecidos como metabólitos secundários ou intermediários, que variam conforme a família e a espécie. Diferente dos metabólitos primários (proteínas, ácidos nucléicos, açúcares e lipídeos) essas substâncias não parecem influenciar de forma direta o crescimento e o desenvolvimento da planta. Além disso, também apresentam distribuição específica em uma espécie vegetal ou em um grupo de espécies que estejam relacionadas (KASOTE et al., 2015; MATSUURA et al., 2017).
Embora não sejam necessariamente essenciais ao processo de formação de novas células e produção de energia do organismo que os produz, esses compostos desempenham um papel significativo nas plantas, atuando na defesa contra herbívoros e patógenos, servindo como atraente para polinizadores e em competições com outros vegetais, que contribuem para sua sobrevivência e conservação da espécie em seu ecossistema (LIN et al., 2016; SHAHIDI; YEO, 2016).
A quantidade e a natureza dos metabólitos secundários produzidos pelas plantas são influenciadas por diversos fatores. A sazonalidade, ritmo circadiano, idade da planta, temperatura, disponibilidade hídrica e de nutrientes, radiação ultravioleta, poluição atmosférica, altitude, estímulos mecânicos ou até mesmo a herbivoria e o ataque de patógenos alteram a síntese de metabólitos secundários no tecido vegetal (GOBBO-NETO e LOPES, 2007).
A grande quantidade e diversidade dos metabólitos secundários vegetais os tornam fontes, particularmente, promissoras para a pesquisa em diferentes campos da ciência. De modo geral, esses metabólitos podem ser divididos em três grupos: terpenos, compostos fenólicos e alcaloides. Além de terem um impacto benéfico para as plantas, essas substâncias
podem também ser eficazes no tratamento de uma variedade de desordens em seres humanos, para as quais já foram descritas suas propriedades antioxidante, anti-inflamatória, antimutagênica, anticancerígena, gastroprotetora, antimicrobiana, entre outras (DZIAŁO et al., 2015, PINHO et al., 2016).
Dentre os grupos de metabólitos secundários, os compostos fenólicos são considerados os principais responsáveis pela atividade antioxidante de plantas, como já foi observado em diversas investigações in vivo e in vitro (CHEN et al., 2013; KASOTE et al., 2015; PINHO et al., 2016; YEN et al., 2017). Seu potencial antioxidante é conferido por sua estrutura química rica em grupos hidroxila, como pode ser visto nos exemplos de polifenóis apresentados na figura 5. A presença desses grupos permite que estes atuem eliminando radicais livres e quelando metais de transição, como por exemplo, ferro e cobre, que participam ativamente de reações de formação de novos radicais livres (BROWN e RICE-EVANS, 1998; KASOTE et al., 2015; PINHO et al., 2016). Além disso, os produtos intermediários formados pela ação antioxidante dos compostos fenólicos são relativamente estáveis por causa da ressonância do anel aromático apresentada pelos polifenois (SOARES, 2002).
Figura 5- Exemplos de compostos fenólicos. (a). luteolina, (b). ácido gálico, (c). ácido cafeico, (d). quercetina. Os compostos fenólicos apresentam em sua estrutura, um ou mais anéis aromáticos com vários grupos hidroxila. A propriedade antioxidante através da eliminação de ERO por esses compostos é, principalmente, atribuída aos seus grupos hidroxila fenólicos. Adaptado de Del Rio et al.(2013).
Estudos recentes demonstram o potencial antioxidante de extratos de plantas atribuindo essa propriedade à presença de metabólitos secundários, com destaque para os compostos fenólicos (SAJKOWSKA-KOZIELEWICZ et al., 2016; HAMID et al., 2017; YEN et al., 2017). Assim, a exploração de substâncias extraídas de plantas, na forma de
extratos buscando utilizar-se de suas propriedades farmacológicas, tem se mostrado uma alternativa para a obtenção de novos medicamentos.
Embora estudos demonstrem suas propriedades antioxidantes in vitro, vale ressaltar a importância da eficácia e baixa toxicidade de extratos vegetais e fitoquímicos isolados in vivo (CARVALHO, 2004). O modelo animal Caenorhabditis elegans tem se tornado uma excelente alternativa experimental, para avaliação de toxicidade e das propriedades antioxidantes de compostos in vivo (PEIXOTO et al., 2016; HUNT, 2017).
1.7 Organismo modelo Caenorhabditis elegans
Caenorhabditis elegans é um nematoide de vida livre encontrado no solo que tem sido
explorado como um animal modelo em várias linhas de pesquisa. Seu ciclo de vida é composto pelo estágio embrionário, seguido por quatro estádios larvais (L1, L2, L3 e L4) e idade adulta (Figura 6). Embora possua estrutura física aparentemente simples, o nematoide desenvolve comportamentos que incluem locomoção, alimentação, defecação, colocação de ovos, formação de larvas Dauer, respostas sensoriais ao toque, cheiro, sabor e temperatura, além de alguns comportamentos complexos como o acasalamento masculino, o comportamento social, aprendizagem e memória (WORMATLAS, 2017). Essas características permitem sua utilização em estudos envolvendo doenças infecciosas, neurodegenerativas, metabólicas, além do processo de envelhecimento (PALLAUF et al., 2013).
Figura 6- Ciclo de vida do C. elegans. O adulto hemafrodita grávido coloca os ovos que eclodem após cerca de 9 horas. Após a eclosão dos ovos, as larvas passam por quatro estágios de desenvolvimento (L1, L2, L3 e L4) até chegar à fase adulta. Os números representados em verde ao longo das setas indicam o período de tempo em horas que o C. elegans passa em um determinado estágio de desenvolvimento. Adaptado de Caneschi (2014).
Este pequeno animal apresenta uma série de vantagens que o tornam uma importante ferramenta para aplicação em ensaios experimentais. Além de seu pequeno tamanho, o C. elegans apresenta manutenção em laboratório fácil e de baixo custo, possui um genoma pequeno que já foi completamente sequenciado (SIN et al., 2014; LEE e KANG, 2017).
Outra característica que o torna um excelente modelo experimental in vivo é que como o C. elegans possui um ciclo de vida de cerca de 3 dias e, cada adulto hermafrodita apresenta uma capacidade reprodutiva de aproximadamente 300 progênies por autofecundação, milhões de animais podem ser gerados rapidamente. Além disso, este animal posssui uma cutícula resistente, mas transparente, que permite a visualização de estruturas internas sem dissecação o que facilita o rastreamento de corantes organelares e a expressão de genes específicos em linhagens transgênicas (HUNT, 2017). Outra vantagem é que muitos genes e vias de sinalização são conservados entre C. elegans e humanos. Cerca de 60-80% de homólogos de genes humanos foram identificados em C. elegans, tornando-o um importante organismo modelo para estudos farmacológicos, por ser possível a realização de comparações com o organismo humano (KALETTA; HENGARTNER, 2006; SIN et al., 2014).
A utilização do modelo animal C. elegans permite o estudo dos efeitos de compostos naturais sobre um organismo como todo, e tem possibilitado a identificação de muitos produtos naturais com propriedades antioxidantes in vivo. Estudos conduzidos com este modelo animal demonstraram que extratos ou substâncias obtidas de plantas medicinais como chá-da-índia, chá verde, carqueja, Rooibos, alho, Pau-Brasil-da-índia, pau-mulato (CHEN et al., 2013; ABBAS; WINK, 2014; PAIVA et al., 2015; OGAWA et al., 2016; LEE, XING, KIM, 2017; PEIXOTO et al., 2018) bem como extratos obtidos a partir de frutos açaí, siriguela, azeitona-preta (BEZERRA et al., 2014; BONOMO et al., 2014; VILLA-HERNANDEZ, et al., 2017) são capazes de reduzir o estresse oxidativo e aumentar a duração da vida de C. elegans.
1.8 Câncer, ERO e Metabólitos secundários vegetais
O câncer é uma das principais causas de morte em todo o mundo. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, cerca de 8,8 milhões de pessoas morreram em decorrência dessa doença apenas em 2015 (OMS, 2018). A carcinogênese é um processo complexo que resulta de alterações genéticas iniciais que podem levar a inativação de genes supressores de tumor e o posterior acúmulo de alterações genéticas durante a progressão tumoral (MEJIA; DIA, 2010).
O estresse oxidativo é um fator importante para o desenvolvimento e progressão do câncer (TRACHOOTHAM; ALEXANDRE; HUANG, 2009; PANIERI; SANTORO, 2016). Esse processo pode promover a formação de tumores por causar danos ao DNA, instabilidade genômica e mutações em genes supressores de tumor. Além disso, estudos demonstram que as células tumorais podem possuir alterações genéticas que promovem uma produção contínua e elevada de espécies reativas de oxigênio, que embora sejam prejudiciais às células não tumorais, facilitam o crescimento tumoral reprogramando o metabolismo das células cancerígenas (PAN et al., 2015; PANIERI; SANTORO, 2016).
Embora avanços recentes na terapia tenham melhorado consideravelmente a qualidade de vida dos pacientes com câncer, o estabelecimento de resistência aos medicamentos anticancerígenos e os efeitos colaterais da quimioterapia têm limitado a eficiência do tratamento contra a doença (DE SÁ JUNIOR, 2017). Assim, a descoberta de novos agentes terapêuticos efetivos, com menores efeitos colaterais tem se tornado uma importante busca cientifica. Muitos medicamentos anticancerígenos comumente utilizados são desenvolvidos a partir de potentes fitoquímicos derivados de plantas, fato que torna as plantas medicinais fonte potencial de novos agentes anticancerígenos (DAI et al., 2016).
Metabólitos secundários vegetais têm mostrado resultados potenciais na prevenção e combate ao câncer, atuando em diferentes estágios da carcinogênese (MUTALIB et al., 2016). Estudos relatam a capacidade quimiopreventiva de polifenois antioxidantes como, por exemplo, luteolina, ácido elágico, ácido cafeico, rutina, resveratrol e miricetina, e sua capacidade em modular diretamente vias de sinalização induzindo a morte ou inibindo a proliferação de células cancerígenas (AMIN et al., 2009; MUTALIBet al., 2016; YEN et al., 2018). Compostos terpênicos como lupeol e ácido oleanólico, comumente encontrados em frutas, legumes e várias plantas medicinais, também têm sido extensivamente investigados graças a seu efeito promissor contra diferentes tipos de câncer (LIU et al., 2015; ZIBERNAet al., 2017). A literatura também relata o efeito citotóxico de extratos derivados de plantas contendo antioxidantes naturais sobre células tumorais (NASCIMENTO et al., 2013; MOATTARet al., 2015; YEN et al., 2018). Para Hussain, Kumar e Ghosh (2016) a eficácia terapêutica antitumoral de um extrato vegetal pode ser o resultado de efeitos sinérgicos ou aditivos de seus vários componentes ativos presentes. Assim, a busca contínua de novos compostos naturais em extratos de plantas medicinais com propriedades antitumorais pode ser uma estratégia promissora para prevenção e tratamento do câncer.
Diante do exposto, buscou-se com este estudo realizar a caracterização fitoquímica de extratos vegetais obtidos a partir das folhas da espécie medicinal Commiphora leptophloeos, e investigar sua capacidade antioxidante e citotóxica sobre em células tumorais e não tumorais.
2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral
Caracterizar e investigar o potencial antioxidante e citotóxico dos extratos obtidos a partir das folhas de Commiphora leptophloeos.
2.2 Objetivos Específicos
Obter os extratos vegetais das folhas de Commiphora leptophloeos por extração seriada, utilizando solventes em ordem crescente de polaridade;
Determinar conteúdo total de compostos fenólicos, açúcares e proteínas presentes nos extratos e identificar grupos de metabólitos secundários e compostos fenólicos individuais presentes nos extratos das folhas de Commiphora leptophloeos;
Avaliar a capacidade antioxidante in vitro e a citotoxicidade dos extratos das folhas de
Commiphora leptophloeos sobre linhagens celulares;
Analisar o potencial antioxidante e a toxicidade do extrato etanólico in vivo, utilizando o modelo animal Caenorhabditis elegans.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Coleta do Material Vegetal
Foram coletadas folhas de um único indivíduo Commiphora leptophloeos (Mart.) J. B. Gillett em julho de 2016, no período da tarde. A coleta foi realizada no lote 4 do Perímetro Irrigado do município de Sumé/PB, com coordenadas 7°40'08.6"S 36°51'09.0"W. Um exemplar da espécie foi identificado pelo botânico Dr. Leonardo de Melo Versieux e foi depositado no herbário da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, sob o número de voucher 022353. A coleta do material vegetal foi autorizada pelo SISBIO (56509-1).
3.2 Obtenção dos Extratos Vegetais
Após a coleta, 100 gramas de folhas frescas foram trituradas e maceradas durante 24 h sob refrigeração e agitação a 150 rpm em mesa agitadora, para a extração dos princípios ativos. O processo extrativo empregado foi realizado de acordo com Nascimento et al. (2013). Foi realizada uma extração seriada, utilizado solventes de polaridade crescente na seguinte disposição: hexano, clorofórmio, etanol, metanol e água destilada. Conjuntamente, foi preparado um extrato aquoso, adotando uma metodologia semelhante ao seu uso popular (Figura 7). Os extratos obtidos foram denominados extrato hexânico (EH), extrato clorofórmico (EC), extrato etanólico (EE), extrato metanólico (EM), extrato aquoso residual (EAR) e extrato aquoso (EA). A proporção usada para a extração foi de 1 g de material vegetal para 10 mL de solvente.
Figura 7-Fluxograma esquemático do processo de obtenção dos extratos das folhas de C. leptophloeos. Por meio de uma extração seriada em ordem crescente de polaridade foram obtidos os extratos hexânico (EH), clorofórmico (EC), etanólico (EE), metanólico (EM) e aquoso residual (EAR). A partir de outra amostra de folhas frescas foi obtido um extrato aquoso (EA).
Posteriormente, os extratos foram filtrados em papel Whatman n° 1 e o solvente evaporado em rota evaporador, a 40 °C, após secos os extratos foram então solubilizados em Dimetilsulfóxido (DMSO), diluídos em água para a concentração final de 10 mg/mL (solução de extrato estoque) e armazenados a -20ºC para o uso subsequente nos ensaios em laboratório (Tabela 1). O rendimento total dos extratos foi calculado, de acordo com Rodrigues et al. (2011), utilizando a seguinte fórmula: Re = (Pext /Pfolhas) x 100. Onde: Re = Rendimento total do extrato (%); Pext = Peso do extrato seco (g); P folhas = Peso das folhas frescas (g).
3.3 CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA
3.3.1 Determinação do teor de açúcares, proteínas e compostos fenólicos 3.3.1.1 Dosagem de Açúcares Totais
A dosagem de açúcares foi realizada por meio da reação de fenol-H2SO4, com base em
uma curva de calibração, preparada a partir de uma solução padrão de D-glucose (Sigma-Aldrich), sendo realizada a leitura da absorbância em espectrofotômetro a 490 nm (DUBOIS et al., 1956).
3.3.1.2 Dosagem de Compostos Fenólicos Totais
A quantificação dos compostos fenólicos totais presentes nos extratos foi realizada utilizando o método colorimétrico de Folin-Ciocalteau, utilizando ácido gálico como padrão de referência. O reagente Folin-Ciocalteau oxida os compostos fenólicos presentes na amostra resultando em uma mudança de coloração que pode ser medida em espectrofotômetro a 760 nm (ATHUKORALA et al., 2006).
3.3.1.3 Dosagem de Proteínas
O teor total de proteínas foi estimado pelo método de Bradford, usando a proteína Albumina sérica bovina (Sigma) como padrão, com leitura da absorbância realizada a 595 nm (BRADFORD, 1976).
3.3.2 Reações de Caracterização Qualitativa de Metabólitos Secundários
As reações qualitativas para o reconhecimento de metabólitos secundários foram realizadas em colaboração com a Profa. Dra. Silvana Zucolotto, do Departamento de Farmácia/ UFRN e da mestranda Larissa Marina Pereira. Os ensaios de triagem fitoquímica dos extratos de C. leptophloeos foram desenvolvidos de acordo com Matos (1997) com algumas adaptações. Foi investigada a presença de compostos fenólicos, taninos, saponinas, flavonoides, antraquinonas, triterpenos e esteroides, alcaloides e cumarinas. A presença destas clases de metabólitos secundários foi verificada por meio do desenvolvimento de coloração específica, formação de precipitado e formação de espuma persistente, conforme especificado em cada teste.
3.3.2.1 Avaliação da presença de compostos fenólicos
Uma alíquota de 0,5 mL de cada extrato a 10 mg/mL, foi transferida para um tubo de ensaio e, posteriormente, foram adicionadas 2 gotas de solução metanólica de cloreto férrico a
2,5% (reação geral para detecção de fenóis) e então verificado o desenvolvimento de coloração característica, verde-escuro, violeta e azul.
3.3.2.2 Avaliação da presença de flavonoides
O ensaio para detecção da presença de flavonoides nos extratos foi realizado por meio da Reação de cianidina ou Shinoda. Para isto, 1 mL do extrato (10 mg/mL) filtrado foi transferido para uma cápsula de porcelana e aquecido até secura em banho-maria (50 ºC).
Após obtenção do extrato seco e frio, foi adicionado 0,2 mL de clorofórmio, esse líquido foi desprezado para eliminação da clorofila. Posteriormente, o extrato foi redissolvido com 1 mL de etanol 70% e transferido para um tubo de ensaio, 1 mL de HCl concentrado foi adicionado cuidadosamente ao tubo de ensaio, seguido pela adição de 50 mg de magnésio metálico em pó e posterior homogeneização. A reação positiva para presença de flavonoides é caracterizada pelo desenvolvimento de coloração vermelha.
3.3.2.3 Avaliação da presença de taninos
Para a detecção da presença de taninos nos extratos vegetais, 1 mL de extrato (10 mg/mL) foi transferido para um tubo de ensaio ao qual foi adicionado uma solução aquosa de gelatina a 2,5%, gota a gota, e então verificada a formação de um precipitado indicativo da presença de taninos.
3.3.2.4 Avaliação da presença de saponinas
Para a identificação da presença de saponinas, foi utilizado 0,5 mL de extrato (10 mg/mL) que foi transferido para um tubo de ensaio e, então, foi adicionado 1 mL de água destilada, o tubo de ensaio foi agitado verticalmente e vigorosamente durante 2 minutos. Posteriormente, o tubo foi deixado em repouso e foi observado se ocorria o aparecimento de espuma persistente, característica da reação positiva para a presença de saponinas.
3.3.2.5 Avaliação da presença de antraquinonas
A presença ou ausência de antraquinonas nos extratos vegetais foi verificada por meio da Reação de Bornträger direta, que tem como finalidade a detecção de antraquinonas livres. Para isso, 0,5 mL (10 mg/mL) de cada extrato foi adicionado tubos de ensaio e adicionado hidróxido de amônio diluído (10%) volume suficiente para cobrir o líquido. Posteriormente, foi então observado o desenvolvimento de coloração róseo-avermelhada, característica da presença de antraquinonas livres.
3.3.2.6 Avaliação da presença de cumarinas
Para a detecção de cumarinas nas amostras, foram adicionadas 2 gotas de cada extrato (10mg/mL) em um papel filtro, lado a lado e então adicionado sob cada extrato da direita 1 gota de KOH a 10%. Após aproximadamente três minutos, o papel filtro foi colocado na câmara escura sob luz ultravioleta. A presença de cumarinas é evidenciada pela formação de uma fluorescência de coloração verde-azulada.
3.3.2.7 Avaliação da presença de esteróides e/ou triterpenos
Em cápsulas de porcelana, foram adicionados 1 mL de cada um dos extratos brutos e levados à secura em banho-maria. O resíduo foi ressuspendido em metanol e diluído com 0,5 mL de diclorometano. Cada extrato foi então dividido em dois tubos de ensaio, o solvente evaporado novamente em banho-maria, e obteve-se a formação de resíduos nos tubos com os quais foram realizadas as reações de Liebermann-Burchard (núcleos triterpênicos e esteroidas) e Salkowski (núcleo esteroidal).
Na reação de Liebermann-Burchard o reagente de Liebermann-Burchard (2 mL de anidrido acético e 7 gotas de H2SO4 concentrado) foi adicionado lentamente pelas paredes do
tubo 1. Após 10 minutos de repouso, foi observada a formação de coloração característica azul ou verde, indicativa da presença de esteróides, ou a coloração vermelha, rosa, púrpura ou violeta, indicativa da presença de triterpenos
Realizou-se a reação de Salkowski para a determinação de núcleo esteroidal, para isso 1 mL do reativo de Salkowski (H2SO4 concentrado) foi adicionado pelas paredes do tubo 2
contendo o resíduo do extrato, e então foi observado o desenvolvimento da coloração característica castanho-escuro-avermelhado, indicativa da presença de núcleo esteroidal insaturado.
3.3.2.8 Avaliação da presença de alcaloides
Para a pesquisa da presença de alcaloides nos extratos das folhas de C. leptophloeos, 2 gotas dos extratos (10 mg/mL) foram depositadas sobre uma placa de vidro e posteriormente foram adicionadas 2 gotas de cada reagente utilizado para a detecção de alcalóides, foram eles: Dragendorff (iodo bismutato de potássio), Mayer (cloro-iodo mercurato de potássio) , Wagner (iodo iodeto de potássio) e Bertrand (ácido sílico túngstico ) tendo como reação positiva a formação de um precipitado alaranjado, branco, marrom e branco, respectivamente.
3.3.3 Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
A análise por cromatografia em camada delgada (CCD) foi realizada em colaboração com a Profa. Dra. Silvana Zucolotto, do Departamento de Farmácia/ UFRN e da mestranda Larissa Marina Pereira. Os extratos de C.leptophloeos foram analisados por CCD utilizando como fase estacionária cromatoplacas de sílica gel 60 F254 e como fases móveis, foram
utilizados sistemas eluentes específicos, ajustados de acordo com a classe de metabólitos de interesse (WAGNER; BLADT, 2001): acetato de etila: ácido fórmico: metanol: água (10: 0,5: 0,6: 0,2; v/v/v/v), tolueno: metanol: água (9: 1: 0,1; v/v/v/v) e acetato de etila: ácido fórmico: água (8: 1: 1; v/v/v).
Após a eluição, as cromatoplacas foram reveladas utilizando os reagentes: Vanilina Sulfúrica (0,5 g de vanilina, 2 mL de H2SO4, 80 mL de MeOH), como revelador universal;
Cloreto Férrico (1 g de FeCl3, 100 mL de MeOH), para detecção de compostos fenólicos;
Reagente Natural A (0,2 g de Difenilborato, 100 mL de MeOH), específico para flavonoides sendo a visualização sob luz UV a 365 nm em câmara escura e reagente de Dragendorff (solução A: 0,85 g de nitrato básico de bismuto, 10 mL de CH3COOH glacial, 40 mL de água
destilada; solução B: 16 g de KI, 40 mL de água destilada) para alcaloides. Para a detecção dos compostos fenólicos presentes nos extratos foram utilizados padrões de referência adquiridos da Sigma Aldrich (pureza ≥95%): ácido gálico, ácido elágico, ácido clorogênico, ácido ascórbico, isorientina, canferol, luteolina, quercetina, saponina, catequina, isoquercetina e vitexina.
3.3.4 Determinação dos Compostos Fenólicos por UPLC
A análise dos extratos das folhas de C. leptophloeos por Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (UPLC) foi realizada no Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos (LCQMed) do Departamento de Farmácia da UFRN, em colaboração com o Prof. Dr. Cícero Flávio Soares Aragão.
Para a análise e a separação dos compostos fenólicos nos extratos foi utilizado um cromatógrafo líquido de ultra eficiência da marca Shimadzu, composto por bomba analítica binária (LC-20A3 XR), injetor automático (SIl-20AD XR), desgaseificador (DGU- 20A3),
forno para colunas (CTO- 20AC) e detector de arranjo de diodos (SPD-M20A), com sistema controlado pelo software LC Solution®. Foi utilizada uma coluna Poroshell 120 EC-C18, da Agilent®, C18 (50 x 4,6 mm; 2,7 µm). As amostras foram injetadas na concentração de 10 mg/mL, o volume de injeção foi 2 µL. O fluxo utilizado na cromatografia foi de 0,5 mL/min A fase móvel utilizada foi um gradiente de eluição com os solventes ácido fórmico 0,1% (A) e
acetonitrila com ácido fórmico 0,1% (B), na seguinte disposição: 99% A e 1% B aos 0 min, 91% A e 9% B aos 3 min, 52% A e 48% B aos 19 min, 5% A e 95% B aos 23 min, 99% A e 1% B aos 24 min, 99% A e 1% B aos 30 min (FRACASSETTI et al., 2013).
A identificação dos compostos fenólicos foi efetuada por meio da comparação entre os espectros de absorção no UV-vísivel (280 nm e 360 nm) e tempo de retenção do pico referente ao da amostra com o padrão desta substância. Foram utilizados os padrões de ácido gálico, rutina, canferol, pirogalol (Sigma Aldrich- pureza ≥95%) e quercetina (USP- pureza 98,8%), na concentração de 10 mg/mL.
3.4 ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS 3.4.1 Avaliação da atividade antioxidante in vitro
Os ensaios de atividade antioxidante in vitro foram realizados em colaboração com o Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, no Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais- BIOPOL da UFRN.
3.4.1.1Capacidade Antioxidante Total (CAT)
A capacidade antioxidante dos extratos vegetais foi avaliada por meio de um teste colorimétrico e expressa em equivalente de ácido ascórbico (EAA/g). Esse teste se baseia na redução de Molibdênio+6 a Molibdênio+5 pelos extratos de C. leptophloeose, subseqüente, formação de um complexo verde fosfato/Mo+ 5 em pH ácido (PRIETO, PINEDA; AGUILAR, 1999). Os tubos contendo os extratos vegetais nas concentrações 50, 100 e 250 µg/mL e a solução reagente (ácido sulfúrico a 0,6 M, Fosfato de sódio 28 mM, e molibdato de amônio 4 mM) foram incubados a 95 °C durante 90 min. Após o resfriamento dos tubos a temperatura ambiente, a absorbância foi medida em espectrofotômetro (FEMTO Ltda) a 695 nm e os resultados comparados com um controle negativo denominado branco (tubos contendo os mesmos componentes, sem amostra e sem padrão).
3.4.1.2 Poder Redutor
O poder redutor das amostras foi estimado conforme descrição de Athukorala, Kim e Jeon (2006) e Wang et al. (2008). Os extratos vegetais nas concentrações de 50, 100 e 250 µg/mL de foram incubados com uma solução contendo tampão fosfato (0,2 M, pH 6,6) e ferricianeto de potássio (1%), a 50 °C durante 20 min, com um volume final de 4 mL. A reação foi finalizada pela adição da solução de TCA (10%) e posterior homogeneização com água destilada e cloreto férrico (0,1%). Posteriormente, foi realizada a leitura da absorbância em espectrofotômetro a 700 nm.
