Amostras de MO de doadores saudáveis, pacientes SMD e LMA
Para expansão das MSC, amostras obtidas por punção de MO, foram coletadas de indivíduos saudáveis e pacientes atendidos no Centro de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Estadual de Campinas, com aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (Apêndice I). Foi aplicado um termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) aos pacientes e controles envolvidos na pesquisa (Apêndice II e III). Foram coletadas 08 amostras de medula óssea de controle, sendo 05 homens e 03 mulheres, com idade mediana de 45 anos (28-57 anos). As amostras dos doadores foram obtidas durante o procedimento de coleta da medula óssea para transplante, sem necessidade de nova punção para este estudo.
Só foram incluídos nos estudo pacientes com pelo menos 6 meses sem tratamento e que tiveram a confirmação do diagnóstico de SMD ou LMA através de mielograma, citoquímica, citogenética e biopsia de MO. As características dos pacientes com SMD e LMA, classificados conforme as normas da WHO88, estão descritas na Tabela 1. Os pacientes foram clinicamente agrupados em baixo risco e alto risco para evolução da SMD (baixo risco: CRDU, CRDM e ARSA, alto risco: AREB-1 e AREB-2). Pacientes com diagnóstico de leucemia promielocítica aguda [LPA ou LMA com t(15;17)(q22;q12)] foram excluídos do grupo de pacientes com LMA de novo.
Tabela 1. Características dos pacientes com diagnóstico de SMD e LMA.
SMD LMA-ARM LMA de novo
Pacientes 22 07 12
Gênero (masculino/feminino) 16/06 02/05 06/06
Idade, mediana (range) 71 (16-90) 69 (30-86) 61 (44-82)
Citogenética
Baixo risco (normal/-Y) Intermediário Alto risco (complexo/ cromossomo 7) Não avaliada 16 02 01/02 01 03 00 04/00 00 07 00 05/00 00 Classificação SMD WHO CRDU/CRMD/ARSA AREB-1/AREB-2 IPSS Baixo/Int-1 Int-2/Alto Não classificados 01/11/04 02/04 08/10 01/02 01 --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
SMD: Síndrome mielodisplásica; LMA: Leucemia mieloide aguda; LMA-ARM: LMA com alterações relacionadas à mielodisplasia; CRDU: Citopenia refratária com displasia unilinear, CRDM: Citopenia refratária com displasia multilinear, ARSA: Anemia refratária com sideroblastos em anel, AREB-1: Anemia refratária com excesso de blastos-1, AREB-2: Anemia refratária com excesso de blastos-2, IPSS: International Prognostic Scoring System, INT-1: intermediário-1, INT-2: intermediário-2.
Amostras de sangue periférico (SP) de doadores saudáveis e pacientes com SMD
Para caracterização da expressão de IL32 em células CD3+ de sangue periférico de pacientes com SMD e controles, todas as amostras foram provenientes de um estudo anterior, durante o mestrado do aluno206. Estas amostras foram coletadas entre o período de março de 2005 a junho de 2011, no Hemocentro da Unicamp com aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa e assinatura do termo de consentimento informado.
Foram utilizadas 29 amostras de doadores saudáveis, sendo 23 homens e 06 mulheres, com idade mediana de 39 anos (28-60 anos), e 49 amostras de
pacientes com SMD, com pelo menos 6 meses sem tratamento. As características dos pacientes com SMD estão descritas na Tabela 2, classificados conforme as normas da WHO88. Os pacientes foram clinicamente agrupados em baixo risco e alto risco para evolução da doença. Baixo risco: CRDU, CRDM e ARSA, alto risco: AREB-1 e AREB-2.
Tabela 2. Características dos pacientes com diagnóstico de SMD.
Pacientes 52
Gênero (masculino/feminino) 27/25
Idade, mediana (range) 67 (27-89)
WHO CRDU/CRMD/ARSA AREB-1/AREB-2 09/26/08 07/02 IPSS Baixo/Int-1 Int-2/Alto Não classificado 25/22 02/00 03 Citogenética
Baixo risco (normal/-Y) Intermediário Alto risco (complexo/ cromossomo 7) Não avaliada 43/01 03 02/00 03
SMD: Síndrome mielodisplásica; WHO: World Health Organization, CRDU: Citopenia refratária com displasia unilinear, CRDM: Citopenia refratária com displasia multilinear, ARSA: Anemia refratária com sideroblastos em anel, AREB-1: Anemia refratária com excesso de blastos-1, AREB-2: Anemia refratária com excesso de blastos-2, IPSS: International Prognostic Scoring System, INT-1: intermediário-1, INT-2: intermediário-2.
METODOLOGIA
Células estromais mesenquimais primárias
Células mononucleares de amostras de medula óssea foram isoladas por centrifugação de gradiente de densidade com Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare), e semeadas na densidade de 106 cells/cm2. Após 3-4 dias de cultura, as células não aderentes foram removidas. As células foram cultivadas
a 37°C, 5% CO2 em meioDMEM contendo 1% Penicilina/ Estreptomicina, 1%
L-Glutamina e 10% de soro fetal bovino. Após atingirem a confluência de 80%, as células foram removidas com tripsina e semeadas novamente, na concentração de 4x103 células/cm2, para sua melhor expansão. Todas as análises das MSC foram realizadas após a 4ª passagem em cultura25.
Cultura de linhagens celulares
As linhagens celulares foram cultivadas em meio RPMI ou DMEM com 10% de soro fetal bovino (SFB), de acordo com recomendações da ATCC ou Invitrogen, e mantidas a 37C e em incubadora de CO2.
Reagentes químicos
As proteínas recombinantes humanas TNF-α e IFN-γ foram adquiridas da empresa PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA). O mitógeno PHA foi obtido da empresa Gibco (Waltham, MA, USA). Citarabina (AraC) foi obtida da Farmacêutica Intas (Ahmedabad, India) e armazenada em solução estoque de 10 mM. O marcador CFSE foi adquirido da empresa Molecular Probes (Eugene, OR, EUA) e diluído em DMSO, conforme recomendações do fabricante, em uma concentração estoque de 5 mM.
Extração de RNA e síntese de cDNA das MSC primárias e de linhagens celulares
O RNA foi extraído com o reagente Trizol (Invitrogen) e posteriormente tratado com DNAse I, para evitar contaminação com DNA genômico. A transcrição reversa do RNA foi realizada a partir de 1μg da amostra de RNA através do kit RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (MBI
Fermentas, Amherst, NY, USA). As amostras de cDNA foram quantificadas em espectrofotômetro NanoDrop e diluídas a 40 ng/μL para serem utilizadas nas reações de PCRq. A qualidade da amostra foi testada por RT-PCR de β2- microglobulina e apenas amostras amplificaram foram incluídas.
Extração de RNA e síntese de cDNA das células CD3+ de sangue periférico
Como já mencionado, estas amostras foram obtidas durante o mestrado do aluno206. Para obtenção das células CD3+ do sangue periférico, foram coletados 14 mL de sangue periférico em tubos com o anticoagulante heparina. As células mononucleares foram isoladas por centrifugação de gradiente de densidade com Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Em seguida, as células CD3+ foram separadas através de colunas de imunoafinidade MIDI-MACS, usando um anticorpo anti-CD3+, de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha). Após purificação, as células foram submetidas à extração de RNA.
O RNA das células CD3+ foi extraído usando o kit RNAspin Mini RNA Isolation Kit, de acordo com as instruções do fabricante (GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, UK).
PCR quantitativo (PCRq)
Amplificação em tempo real foi realizada no ABI 7500 Sequence Detector System (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) utilizando-se SybrGreen PCR Master Mix (MBI Fermentas). Cento e vinte ng de cada amostra de cDNA foram utilizados na reação com os iniciadores. Um controle negativo, sem adição de cDNA, foi realizado para cada par de iniciadores. O protocolo de dissociação foi realizado no final de cada reação para verificar amplificações não específicas. Cada reação foi repetida três vezes no mesmo experimento. A expressão do gene HPRT foi utilizada como controle endógeno. A quantificação relativa da expressão gênica foi calculada utilizando-se a fórmula 2-ΔΔCT 207. A lista de todos os iniciadores utilizados está descrita na Tabela 3.
Tabela 3. Concentração e sequência dos iniciadores.
Gene Concentração Sequência dos Iniciadores
IL32 150 nM 5’ GAACTTTTGGCCGCCATGT 3’ 5’ GGGCCTTCAGCTTCTTCATGT 3’ IL32α 150 nM 5’ GACAGTGGCGGCTTATTATGAG 3’ 5’ GCTCCGTAGGACTTGTCACAAA 3’ IL32β 300 nM 5’ CTGTCTCTCTCGGCTGAGTATTTGT 3’ 5’ TCTTCATGTCATCAGAGAGGACCTT 3’ IL32γ 300 nM 5’ GTAATGCTCCTCCCTACTTC 3’ 5’ GCAAAGGTGGTGTCAGTATC 3’ IL32δ 150 nM 5’ GACGTGGACAGGACGACTTCA 3’ 5’ CCTCGGCACCGTAATCCAT 3’ VEGFA 300 nM 5’ AGCCTTGCCGCCTTGCTGCTCTA 3’ 5’ GTGCTGGCCTTGGTGAGG 3’ CXCL12 150 nM 5’ GAGCTACAGATGCCCATGC 3’ 5’ CTTTAGCTTCGGGTCAATGC 3’ IDO 300 nM 5’ TTGGAGAAAGCCCTTCAAGTG 3’ 5’ TGCCTTTCCAGCCAGACAA 3’ RPGE2 150 nM 5’ CCCCCAGTATTGCAGGAG 3’ 5’ TAGACGAAGCCCAGGAAAAG 3’ IL10 300 nM 5’ GCTGAGAACCAAGACCCAGA 3’ 5’ AAATCGATGACAGCGCCGT 3’ TGFβ1 150 nM 5’ GCGTGCTAATGGTGGAAACC 3’ 5’ GCTTCTCGGAGCTCTGATGTG 3’ HGF 300 nM 5’ TGACTCCGAACAGGATTCTTTCA 3’ 5’ GCAGGGCTGGCAGGAGTT 3’ IL1β 300 nM 5’ CTTTGAAGCTGATGGCCCTAAA 3’ 5’ AGTGGTGGTCGGAGATTCGT 3’ IL6 150 nM 5’ GGTACATCCTCGACGGCATCT 3’ 5’ GTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC 3’ HPRT 150 nM 5’ GAACGTCTTGCTCGAGATGTGA 3’ 5’ TCCAGCAGGTCAGCAAAGAAT 3’
Padronização dos iniciadores para amplificação por PCRq
Como exemplo da padronização dos iniciadores utilizados para avaliação da expressão gênica escolhemos as sequências da IL-32 e suas diferentes isoformas.
Iniciadores para o gene da IL-32 total foram desenhados de forma que fossem específicos e abrangentes para as principais isoformas da IL-32 já descritas de acordo com os dados publicadas no banco de dados NCBI, para análise das isoformas do gene selecionamos as frações α, β, γ e δ de acordo com publicações e todas as sequências tiveram sua especificidade confirmada de acordo com o banco de dados do NCBI (Tabela 3).
A padronização da concentração e verificação de sua eficiência foi realizada por PCRq, usando o reagente Sybr Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) em amostras de cDNA da linhagem leucêmica Jurkat, exceto para isoforma IL-32β, na qual foi utilizada a linhagem estromal HS5 .
Para verificar qual a concentração ideal dos iniciadores do gene IL32 e de suas isoformas foi realizada uma curva de concentrações de 150 nM, 300 nM, 450 nM e 600 nM. Uma vez utilizada a mesma quantidade de amostra em todas as reações, os ciclos de Threshold (Cts) não deveriam variar. Assim, a IL-32 total e das isoformas IL-32α e IL-32δ a concentração ótima escolhida foi de 150nM para os pares de iniciadores, enquanto que para as isoformas IL-32β e IL-32γ a concentração ótima escolhida foi de 300 nM. As concentrações escolhidas correspondem a menor concentração na qual não ocorre variação de Ct. Os valores dos Cts e as curvas de dissociação (melting) dos genes analisados nas concentrações utilizadas estão ilustrados na Figura 3, respectivamente. As reações de PCRq foram realizadas no equipamento 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystem). O gene HPRT foi selecionado como controle endógeno das reações.
Figura 3. Ciclos de amplificação e curva de dissociação dos seguinte genes: IL32 total (A-B), IL32α (C-D), IL32β (E-F), IL32γ (G-H) e IL32δ (I-J) nas diferentes concentrações dos iniciadores.
Estabelecida a concentração ótima dos iniciadores, foi determinada a eficiência de cada reação. Foram realizadas reações em escala logarítmica de uma diluição de cDNA na ordem 1: 2 com 5 ou 4 pontos sendo a concentração inicial de 240 ng (Figura 4). A eficiência ideal é de 100 por cento (valor ideal = 1) com valores toleráveis de 10 por cento a mais ou a menos. Após a análise, os iniciadores foram considerados eficientes e os valores para cada um dos iniciadores são ilustrados na Figura 5.
Figura 4. Curva de eficiência dos seguintes genes: IL32 total (A), IL32α (B), IL32β (C), IL32γ (D) e IL32δ (E) nas diferentes concentrações de cDNA.
Figura 5. Gráfico da curva de eficiência dos seguintes genes: IL32 total (A), IL32α (B), IL32β (C), IL32γ (D) e IL32δ (E), nas diferentes concentrações de cDNA, que apresentaram valores eficientes por volta de 1 (correspondente a 100%).
Citometria de fluxo
Para imunofenotipagem das MSC, foram utilizadas células após a 4ª passagem na cultura. À suspensão celular, ajustada para a concentração de 1x106 células e lavada com PBS, foram adicionados os respectivos anticorpos marcados: anti-CD45 FITC, anti-CD34 APC, anti-CD73 PE, anti-CD31 FITC, anti-HLADR FITC, antiCD45 PercP, anti-CD90 PeCy5 e anti-CD105 PE. A mistura foi homogeneizada e incubada por 30 minutos à temperatura ambiente ao abrigo da luz. Após essa etapa, as células foram lavadas duas vezes em PBS e realizada a aquisição. A linhagem celular leucêmica U937 foi marcada para detecção de células apoptóticas (população anexina V-APC positiva/ iodeto de propídeo (PI) negativa) após cocultura com células HS5. Foram adquiridos 10.000 eventos no citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton– Dickinson, CA, USA). A análise foi realizada através do programa FACSDiva (version 4.0.1, Becton–Dickinson, CA, USA) ou FlowJo software (Treestar, Inc., San Carlos, CA, USA).
Ensaio de proliferação de linfócitos CD3+
Para o ensaio de proliferação de células T, linfócitos T CD3+ alogênicos, purificados a partir de bolsas de leucoredução (n=26) de doadores saudáveis por separação magnética (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany), foram marcados com CFSE. Essas células foram semeadas na concentração de 100.000 células/poço em placas de 96 poços, juntamente com as MSC, na razão MSC/células T de 1:2, 1:5, 1:10, 1:50 e 1:100. A estimulação dos linfócitos T foi induzida por PHA (2,5 μg/mL). Como controles negativo e positivo, foram usados poços com cocultivo sem adição de PHA e poços somente com células T com PHA, respectivamente. Após 4 dias de cultura, a intensidade de fluorescência do CFSE foi analisada por citometria de fluxo (Becton-Dickinson).
Inibição de IL-32
Clonagem dos miRNA nos vetores do sistema de Lentivírus
O sistema BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector com EmGFP (Invitrogen) utilizando sequências de microRNA (miRNA) desenhadas com auxílio de BLOCK-IT™ RNAi Designer (Invitrogen) foi utilizado para produção dos vetores de lentivírus para a transferência da sequências de miRNA específica para silenciamento do gene alvo (Tabela 4).
Tabela 4. Sequências alvo usadas para inibição.
miControle 5’-AAATCGCTGATTTGTGTAGTC-3’
miIL32#1 5’- GAGACAGTGGCGGCTTATTAT -3’
miIL32#2 5’- AGAGGGCTACCTGGAGACAGT -3’
O sistema BLOCK-iT facilita a expressão de miRNA para uso em análise de RNA de interferência (RNAi) de um gene alvo eficaz para a inibição proteica em células leucêmicas em suspensão e células aderentes. RNAi são homólogos de RNA de dupla fita que induzem uma inibição potente e específica da expressão gênica eucariótica via degradação do RNAm208, 209.
A produção do vetor foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Para manuseio desse tipo de vetores é sugerido o nível de biossegurança 2, de acordo com o NIH (National Institutes of Health). Nosso trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia Molecular e Celular do Hemocentro/UNICAMP, conforme todas as normas de biossegurança.
Além da sequência de inibição a construção possui sítios de ligação attB1 e attB2, que permitem uma clonagem recombinante no vetor de destino. Possui uma sequência proteica GFP (Green Fluorescent Protein) que permite rastrear visualmente as células transduzidas ou selecionar as células utilizando um citômetro de fluxo. Além de conter gene de resistência ao antibiótico espectinomicina para seleção em bactérias E. coli e gene de resistência ao antibiótico blasticidina possibilitando a seleção das células transduzidas (Figura 6).
Figura 6. Características dos vetores do sistema BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector.
Adaptado do manual do usuário (Invitrogen – Código K4934-00).
Através do sistema BLOCK-iT, oligonucleotídeos de fita dupla (oligos ds) foram gerados com anelamento dos oligos sense e antisense. Depois da formação dos oligos ds foi realizada a ligação de entrada no vetor pcDNA™6.2- GW/+EmGFP-miR (Invitrogen) e a transformação da reação em bactérias E.coli TOP10 quimio-competentes. Colônias resistentes isoladas foram cultivadas em meio ágar LB contendo o antibiótico espectinomicina. A extração do plasmídio bacteriano foi realizada com o kit MiniPrep (Quiagen), em seguida o material foi sequenciado para confirmação da presença da sequência do vetor de inibição.
Uma vez que o vetor de expressão pcDNA™6.2-GW/+EmGFP-miR
contém sítios de ligação attB, a sequência pré-miRNA não pode ser transferida diretamente para o vetor de destino através de uma única reação de recombinação. Assim, para transferir o cassete do clone de expressão pcDNA™6.2-GW/+EmGFP-miR para o vetor de destino, é necessário realizar duas reações de recombinação, primeiro é preciso gerar um clone de entrada através da realização de uma reação de recombinação BP entre o substrato attB (clone de expressão) e um substrato attP (vetor pDONR™221), em seguida, deve-se executar uma reação de recombinação LR entre o clone de entrada resultante da recombinação BP (substrato attL), um clone de entrada 5'
(substrato attL) transportando um promotor específico e o vetor pLenti6.4/R4R2/V5-DEST (substrato attR) (Figura 7).
Figura 7. Modelo do sistema de recombinação através do sistema Gateway.
Adaptado do manual do usuário (Invitrogen – Código K493400).
Para transferir o vetor de entrada (pcDNA™6.2-GW/+EmGFP-miR) para o vetor de destino foi utilizado o sistema Gateway (Invitrogen). A tecnologia Gateway é um método de clonagem universal que se aproveita de propriedades de recombinação sítio-específicas do bacteriófago lambda para fornecer uma maneira rápida e altamente eficiente de mover a sequência de DNA de interesse (a sequência miRNA) em diversos sistemas de vetores.
A primeira reação de recombinação realizada é denominada de reação BP e ocorreu entre o substrato attB (clone de expressão) e um substrato attP (vetor pDONR™221). Após a realização da recombinação BP, foi realizada a transformação da reação em bactérias E.coli TOP10 quimio-competentes. Colônias resistentes isoladas foram cultivadas em meio ágar LB contendo o antibiótico kanamicina. A extração do plasmídio bacteriano foi realizada com o kit MiniPrep (Quiagen), em seguida o material foi digerido com a enzima Dra I (resultado esperado 2 bandas, sendo a menor com aproximadamente 700pb) para confirmação da efetividade da recombinação BP (Figura 8).
Figura 8. Confirmação da efetividade da recombinação BP.
A reação foi realizada através da digestão com a enzima Dra I. M. Eletroforese em gel de agarose 2% contendo brometo de etídeo. Marcador de 100 pb. O controle da reação é a respectiva amostra antes da reação de digestão.
Após a obtenção do clone intermediário contendo o sítio de ligação attL (reação BP) foi realizada uma reação de recombinação LR entre os dois clones de entrada (resultado da recombinação BP e um clone de entrada 5' transportando um promotor específico) e um vetor de destino (pLenti6.4/R4R2/V5-DEST). A reação foi transformada em bactérias E.coli Stbl3 quimio-competentes para selecionar os clones de expressão. Colônias resistentes isoladas foram cultivadas em meio ágar LB contendo o antibiótico ampicilina. A extração do plasmídio bacteriano foi realizada com o kit MiniPrep (Quiagen), em seguida o material foi digerido com a enzima Sal I (resultado esperado 2 bandas, sendo a menor com aproximadamente 1500pb) para confirmação da efetividade da recombinação LR (Figura 9).
miIL32#1
miIL32#2
Figura 9. Confirmação da efetividade da recombinação LR.
A reação foi realizada através da digestão com a enzima Sal I. M. Eletroforese em gel de agarose 1% contendo brometo de etídeo. Marcador de 1 Kb. O controle da reação é a respectiva amostra antes da reação de digestão.
A análise do resultado da digestão com a enzima Sal I mostrou diferentes padrões, principalmente para sequência da miIL32#1, o esperado era a presença de duas bandas (obtido nas colônias 4 e 5 para miIL32#1 e nas colônias 1 e 2 para miIL32#2). Decidimos realizar um novo teste para confirmação do resultado, escolhemos o teste de semeadura em placas com antibiótico cloranfenicol, visto que as colônias onde a recombinação LR foi eficiente são sensíveis ao antibiótico, enquanto o vetor de entrada resultante da recombinação BP é resistente ao cloranfenicol (Figura 10). Com esse resultado complementar escolhemos a colônia 5 para miIL32#1 e a colônia 1 para miIL32#2 para prosseguir com a extração plasmidial pelo kit MaxiPrep (Quiagen).
Figura 10. Teste de sensibilidade ao cloranfenicol.
As colônias selecionadas após a transformação da recombinação LR foram semeadas em placas contendo meio LB com o antibiótico cloranfenicol. O controle da reação foi as respectivas amostras semeadas em meio LB com o antibiótico ampicilina (vetor de destino contém sequência de resistência à ampicilina).
Produção e titulação de partículas virais
Para produção de vírus as construções de pLenti-miRNA produzidas foram cotransfectadas com ViraPower Packing Mix (conjunto de plasmídeos que expressam proteínas virais de empacotamento) em células produtoras de partículas virais 293FT. Para isto, células HEK-293FT foram semeadas em placas (106 células/placa) contendo antibiótico geneticina (10 µg/mL na concentração de 50 mg/mL) em meio de cultura DMEM (GIBCO) suplementado com 10% de SFB, 1% de MEM (SIGMA), 1% de piruvato e 1% de L-glutamina. Os sobrenadantes celulares contendo as partículas virais foram coletados após 48h e armazenados.
A titulação para determinar a quantidade de partículas virais produzidas foi realizada através da transdução de células HT1080 com diluições seriadas (10-2 a 10-6) de cada sobrenadante viral, na presença de Polybrene. Após transdução, as células foram selecionadas com blasticidina (10 µg/mL) por 15 dias. A concentração de blasticidina descrita na literatura como ideal para linhagens celulares leucêmicas é de 10 μg/mL210.
O número de colônias resistentes foi determinado para cada diluição através da coloração com violeta cristal (Figura 11). Esta análise indicará a unidade de transdução (TU, transducing unit) por mL de sobrenadante viral.
Figura 11. Titulação dos lentivírus em células HT1080, coradas com violeta cristal.
A: diluição 1:2, B: diluição 1:50, C: diluição1:100, D: diluição 1:1000, E diluição 10000 e F: ausência de lentivírus.
Transdução de células com os vírus de silenciamento
Após a titulação, o número de partículas virais por célula (multiplicity of infection ou MOI), escolhidos para realização da inibição foi igual 1 para ambas as sequências de inibição. Células HS5 foram semeadas (5x104 células/poço) e transduzidas com vetores lentivirais com as sequências de inibição LacZ (denominado miControle) ou com as sequências de inibição de IL-32 (denominadas de miIL32#1 e miIL32#2). A transdução foi realizada na presença de 6 mg/mL de polybrene (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), após as células estarem aderidas por mais de 24 horas. Posteriormente elas foram selecionadas com blasticidina (10 µg/ml) por 15 dias. A confirmação da inibição de IL-32 foi feita por Western blotting.
miIL32#1
Western Blotting
Ao extrato celular contendo 5x106 a 1x107 célula foi acrescentado tampão de extração de proteínas. Ao produto do extrato total proteico, foi adicionado tampão de Laemmli contendo 100 mmol/L de ditiotreitol e aquecido em água fervente por 4 minutos. A eletroforese foi realizada em gel de poliacrilamida 12%-SDS-PAGE em aparelho de eletroforese (Mini-Protean, Bio- Rad Laboratories, Richmond, Ca). A eletrotransferência das proteínas do gel para a membrana foi realizada por 90 minutos a 120 V (constante) em aparelho miniaturizado de transferência da Bio-Rad. A membrana de nitrocelulose foi então incubada com anticorpos específicos diluídos em tampão de bloqueio.