FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
MATHEUS RODRIGUES LOPES
CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS ESTROMAIS MESENQUIMAIS DERIVADAS DE MEDULA ÓSSEA DE PACIENTES COM SÍNDROMES MIELODISPLÁSICAS E LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA E O ESTUDO DA
BIOLOGIA DA INTERLEUCINA-32 NO MICROAMBIENTE MEDULAR
Campinas 2016
CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS ESTROMAIS MESENQUIMAIS DERIVADAS DE MEDULA ÓSSEA DE PACIENTES COM SÍNDROMES MIELODISPLÁSICAS E LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA E O ESTUDO DA
BIOLOGIA DA INTERLEUCINA-32 NO MICROAMBIENTE MEDULAR
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Ciências.
ORIENTADORA: DRA. PATRICIA MARIA BERGAMO FAVARO COORIENTADORA: DRA SARA TERESINHA OLALLA SAAD
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO
MATHEUS RODRIGUES LOPES, E ORIENTADO PELA PROFA. DRA. PATRICIA MARIA BERGAMO FAVARO.
Campinas 2016
MATHEUS RODRIGUES LOPES
Orientador (a) PROF(A). DR(A). PATRÍCIA MARIA BERGAMO FAVARO Coorientador (a) PROF(A). DR(A). SARA TERESINHA OLALLA SAAD
MEMBROS:
1. PROF(A). DR(A). ERICH VINICIUS DE PAULA
2. PROF(A). DR(A). KÁTIA BORGIA BARBOSA PAGNANO 3. PROF(A). DR(A). MARINA PEREIRA COLELLA
4. PROF(A). DR(A). FERNANDO LUIZ AFFONSO FONSECA 5. PROF(A). DR(A). WAGNER LUIZ BATISTA
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho àqueles que me
apoiaram nessa trajetória, em especial a
Deus, minha família, minha noiva e minha
orientadora, sem eles nada disso seria
possível...
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me guiar nos momentos difíceis, me dar força interior para superar as dificuldades e mostrar os caminhos nas horas incertas.
A minha mãe Leni, que por vezes mesmo sem entender minhas escolhas, me apoiou sempre e incondicionalmente. Por me ensinar a dar valor nas pequenas realizações e principalmente pelo amor e carinho de todos os dias.
A minha companheira de todas as horas Lívia, por suportar meus momentos de ansiedade e estresse, entender minhas ausências e sempre oferecer apoio e compreensão.
A minha família, pelo constante apoio, incentivo, carinho, amizade e compreensão. Agradeço por compartilharem de minhas conquistas, dos momentos de incertezas e de alegria.
A minha orientadora Profa. Dra. Patricia Favaro, por sua grande orientação, confiança e apoio para a realização deste trabalho, principalmente por ser um exemplo como pesquisadora e me permitir adquirir ensinamentos que levarei por toda vida.
À Profa. Dra. Sara Saad, pela competência científica e acompanhamento do trabalho, pela disponibilidade e generosidade reveladas ao longo destes anos de trabalho, assim como pelas críticas, correções e sugestões relevantes e por ser um modelo de liderança e conhecimento.
À Dra Fabíola Traina e Dra Mariana Lazarini, pelo inestimável apoio na preparação e elaboração desse trabalho, pela disponibilidade sempre manifestada e pela amizade.
Aos amigos João Agostinho e João Kleber, que muito me ajudaram nos experimentos, pela amizade e aprendizados na bancada.
Aos meus amigos, pelas alegrias, tristezas, aventuras, conversas, pela companhia e principalmente apoio, fundamentais nessa etapa de minha vida.
À Tereza Sueko, pela ajuda, amizade e ensinamentos essenciais no laboratório.
A todos os alunos, Isabella, Victor, Vanessa, Juliana, Laure, Andrana, Aline, Renata, Ada, Marisa, Fernando, Paula, Cris, Anamika, Luciana, Mariana,
Moisés, agradeço a oportunidade de compartilhar as experiências, frustrações e as alegrias de todos os dias.
À minhas companheiras de aventuras, Bruna, Rita, Flávia e Fernanda Roversi, obrigado por serem essas pessoas tão especiais que me acompanharam em diversas viagens e desafios, me guiaram por terras estrangeiras e foram pessoas essenciais no dia-a-dia e na construção desse trabalho.
Aos funcionários Karla, Fernanda, Simone, Adriana, Lena, Irene, Ana Leda e Audrey por me auxiliarem durante o desenvolvimento desse trabalho com competência e paciência para ajudar em todos os percalços.
Aos médicos, que nos dão todo o suporte necessário. Em especial ao Fernando Pericole por todas ajudar na obtenção das amostras e facilitar nosso trabalho. A Paula pelas infindáveis classificações de pacientes e ser um exemplo de profissionalismo.
Aos funcionários da coleta, transplante e fracionamento pelo suporte e ajuda na obtenção das amostras de doadores.
Aos docentes da disciplina de Hematologia da UNICAMP pelo apoio e estrutura na realização deste trabalho.
Aos pacientes, um agradecimento especial, pois sem eles este trabalho não teria sido idealizado e nem realizado.
À Dra. Nicola Conran pelo auxílio na correção ortográfica do inglês. Aos funcionários do apoio didático, em especial ao Michel, pelo auxílio durante a realização deste trabalho.
À secretária Patrícia e à analista administrativa Raquel pela disponibilidade em ajudar e pela amizade.
À secretária da pós-graduação Regina pela disponibilidade no serviço burocrático.
Ao coordenador da Fisiopatologia, Dr. Marcondes por sua imensa ajuda na parte burocrática nessa reta final de trabalho.
Aos membros da banca examinadora da minha defesa, por aceitarem fazer parte desta grande etapa da minha vida.
EPÍGRAFE
"Descobrir consiste em olhar para
o que todo mundo está vendo e
pensar uma coisa diferente"
Roger Von Oech
RESUMO
Evidências sugerem uma interação entre o microambiente da medula óssea e células hematopoiéticas malignas, o que pode resultar na proteção das células leucêmicas à quimioterapia, entre outros efeitos, tanto nas síndromes mielodisplásicas (SMD) quanto nas leucemias mieloides agudas (LMA). Portanto, compreender como o microambiente da medula óssea contribui para a patogênese destas doenças é importante para o desenvolvimento de novas terapia. Neste trabalho, nós caracterizamos a função e o perfil de citocinas e moléculas inflamatórias em células estromais mesenquimais (MSC) de medula óssea de pacientes com SMD, LMA com alterações relacionadas à mielodisplasia (LMA-ARM), um subtipo clínico bem reconhecido de LMA secundária, e LMA de novo. Além disso, estudamos a função biológica de IL-32 na linhagem celular estromal HS5 e caracterizamos sua expressão em células
CD3+ de sangue periférico de pacientes com SMD. Observamos que as MSC
de pacientes com SMD apresentam crescimento, função imunossupressora e expressão de moléculas inflamatórias semelhante às MSC do grupo controle. Por outro lado observamos que as MSC de pacientes com LMA foram capazes de suprimir significativamente a proliferação de células T apenas nas maiores concentrações de MSC/T. Quando comparado com o grupo controle, as MSC derivadas de LMA-ARM apresentaram um aumento na expressão de IL6, ao passo que as MSC de LMA de novo apresentaram uma menor taxa de crescimento e um aumento significativo nos níveis de expressão de VEGFA, CXCL12, RPGE2, IDO, IL1β, IL6 e IL32, seguido de uma diminuição de IL10. Nossos dados sugerem que as MSC derivadas de SMD não são o fator principal responsável pela resposta imune alterada, observada em alguns grupos de pacientes com SMD. Além disso, que as MSC derivadas de pacientes com LMA-ARM apresentem uma menor função na manutenção do nicho leucêmico, enquanto as MSC derivadas de pacientes com LMA de novo, pelo menos no inicio da doença antes de qualquer tratamento, promovam um nicho permissivo para leucêmogenese, em detrimento da hematopoieses normal. Também demonstramos que a inibição da citocina IL-32 em células HS5 aumenta a proliferação das células estromais, resulta num menor
potencial quimiotático sobre células T CD4+, aumenta a quimioproteção sobre células de linhagem leucêmica U937 em resposta à apoptose induzida pelo AraC, diminui a secreção de diversas citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento, além de diminuir a ativação das vias moleculares MAPK e NF-kB. Nossos resultados sugerem que a IL-32 participa na regulação da rede de citocinas na medula óssea, ao menos em parte, através da sinalização MAPK e NF-κB. Assim, nossos resultados sugerem que as diferenças entre LMA-ARM e LMA de novo se estendam ao nicho de células-tronco leucêmicas e que a citocina multifuncional IL-32 participa da regulação do microambiente hematopoiético.
Palavras-chave: Leucemia mieloide aguda, Síndromes Mielodisplásicas, Nicho de Células-Tronco, Células Mesenquimais Estromais, Interleucina-32.
ABSTRACT
Accumulating evidence has suggested an interaction between bone marrow microenvironment and malignant hematopoietic cells, which could result in the protection of leukemia cells from chemotherapy in both myelodysplastic syndromes (MDS) and acute myeloid leukemia (AML), among other effects. Therefore, understanding how the bone marrow microenvironment directly contributes to the pathogenesis of these diseases is important for the development of targeted therapy. We herein, characterized the changes in cytokine and inflammatory molecule expression changes and the function of mesenchymal stromal cells (MSC) from the bone marrow of patients with MDS, AML with myelodysplasia-related changes (MRC), a well-recognized clinical subtype of secondary AML, and de novo AML. In addition, we studied the biological function of IL-32 in stromal cell line HS5 and characterized the expression of IL-32 in CD3+ cells from the peripheral blood of MDS patients. We observed a significant inhibitory effect of MDS-MSC on T-lymphocyte proliferation, similar to that of control cells, followed by no significant differences in any of the cytokines tested. Both AML-MSC were able to significantly inhibit T-cell proliferation, however only at very low MSC/T cell ratios. When compared to the control, AML-MRC-derived MSC presented a significant increase in IL6 expression, whereas de novo AML MSC presented a significant increase in the expression levels of VEGFA, SDF1, RPGE2, IDO, IL1β, IL6 and IL32, followed by a decrease in IL10 expression. Our data suggest that MSCs derived from MDS are not the main factor responsible for the altered immune response observed in some groups of MDS patients. In addition, the MSC derived from patients with AML-MRC presented a minor role in the maintenance of leukemic niche, whereas the MSCs derived from de novo AML, at least at an early stage of disease before any treatment, promoted a permissive niche for leukemogenesis, instead of the normal hematopoieses. We also showed that IL32 regulates stromal cell proliferation, has a chemotactic potential and participates in stromal cell crosstalk with leukemia cells, which could result in chemoresistance. Our results suggest that IL-32 participates in the regulation of the cytokine network in the bone marrow, at least in part, by signaling MAPK
and NF-kB. Our results suggest that the differences between AML-MRC and de novo AML also extend into the leukemic stem cell niche and that IL32 participates in the regulation of the bone marrow cytokine milieu.
Keywords: Acute myelogenous leukemia, Myelodysplastic Syndromes, Stem Cell Niche, Mesenchymal Stromal Cells, Interleukin-32.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Modelo com os principais componentes do nicho hematopoiético. ... 23 Figura 2. Modelo esquemático das principais funções imunossupressoras das
MSC. ... 26 Figura 3. Ciclos de amplificação e curva de dissociação dos seguinte genes:
IL32 total (A-B), IL32α (C-D), IL32β (E-F), IL32γ (G-H) e IL32δ (I-J) nas diferentes concentrações dos iniciadores. ... 45 Figura 4. Curva de eficiência dos seguintes genes: IL32 total (A), IL32α (B),
IL32β (C), IL32γ (D) e IL32δ (E) nas diferentes concentrações de cDNA. 46 Figura 5. Gráfico da curva de eficiência dos seguintes genes: IL32 total (A),
IL32α (B), IL32β (C), IL32γ (D) e IL32δ (E), nas diferentes concentrações de cDNA, que apresentaram valores eficientes por volta de 1 (correspondente a 100%). ... 47 Figura 6. Características dos vetores do sistema BLOCK-iT Pol II miR RNAi
Expression Vector. ... 50 Figura 7. Modelo do sistema de recombinação através do sistema Gateway. . 51 Figura 8. Confirmação da efetividade da recombinação BP. ... 52 Figura 9. Confirmação da efetividade da recombinação LR. ... 53 Figura 10. Teste de sensibilidade ao cloranfenicol. ... 54 Figura 11. Titulação dos lentivírus em células HT1080, coradas com violeta
cristal. ... 55 Figura 12. Tempo médio durante as 4 passagens para atingir a confluência de
80% nas MSC. ... 61 Figura 13. Proliferação de células CD3+ em cocultura com MSC. ... 63
Figura 14. Aumento da expressão de CXCL12 e VEGFA nas MSC de pacientes LMA de novo. ... 64 Figura 15. Expressão de RPGE2, IDO, IL10, TGFβ1 e HGF nas MSC de
pacientes com SMD, LMA e grupo controle. ... 65 Figura 16. Expressão de IL1β, IL6 e IL32 nas MSC de pacientes com SMD,
LMA e grupo controle. ... 67 Figura 17. Expressão de IL32α, IL32β, IL32δ e IL32γ nas MSC de pacientes
com SMD, LMA e grupo controle. ... 68 Figura 18. miRNA mediado por lentivírus específico para IL-32 resultou no
silenciamento efetivo de IL-32 em células HS5. ... 70 Figura 19. Análise da expressão de GFP por citometria de fluxo. ... 71 Figura 20. A inibição de IL-32 aumenta a proliferação celular de células HS5. 72 Figura 21. A inibição da IL32 diminui a atividade quimiotática das células HS5
sobre linfócitos CD4+. ... 73 Figura 22. Efeito de quimioproteção mais efetivo após cocultura de células
U937 com células Hs5 miIL32 usando placas transpoços. ... 75 Figura 23. A inibição da IL32 diminui a secreção de citocinas, quimiocinas e
fatores de crescimento em células HS5. ... 76 Figura 24. O silenciamento da IL-32 diminui a fosforilação de NF-κB, IKKα,
IKKβ, JNK e p38 MAPK em células HS5. ... 78 Figura 25. Expressão de IL32 em células CD3+ de sangue periférico de
pacientes com SMD e grupo controle. ... 79 Figura 26. Expressão de IL32γ em pacientes com SMD e grupo controle. ... 80 Figura 27. Expressão das isoformas de IL32 em pacientes com SMD e grupo
Figura 28. Comparação entre as alterações encontradas nas MSC derivadas de LMA-ARM e LMA de novo. ... 85 Figura 29. Modelo dos principais efeitos de IL-32 na linhagem estromal HS5. 88
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características dos pacientes com diagnóstico de SMD e LMA. ... 39
Tabela 2. Características dos pacientes com diagnóstico de SMD. ... 40
Tabela 3. Concentração e sequência dos iniciadores. ... 43
Tabela 4. Sequências alvo usadas para inibição. ... 49
Tabela 5. Expansão das MSC em cultivo. ... 60
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AraC: citarabina
AREB-1: anemia refratária com excesso de blastos-1 AREB-2: anemia refratária com excesso de blastos-2 ARSA: anemia refratária com sideroblastos em anel ATCC: American Type Culture Collection
BSA: albumina do soro bovino
cDNA: ácido desoxirribonucleico complementar
CFU-F: unidades formadoras de colônias de fibloblastos CFSE: carboxyfluorescein succinimidyl ester
CRDM: citopenia refratária com displasia multilinear CRDU: citopenia refratária com displasia unilinear, CCL: quimiocina (C-C motivo) ligante
CXCL12: quimiocina (C-X-C motivo) ligante 12 DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO: dimetilsulfóxido
DNA: ácido desoxirribonucleico EP: prostanóides E
EPM: erro padrão da média
ERK: quinase regulada por sinal extracelular
G-CSF: fator estimulador de colônias de granulócitos GFP: Green Fluorescent Protein
GM-CSF: fator estimulador de colônias de granulócitos e monócitos HGF: fator de crescimento de hepatócitos
HPRT: Hypoxanthine phosphoribosyltransferase HS5: Human marrow stromal cells 5
HS-27a: Human marrow stromal cells 27a HSC: células-tronco hematopoiéticas IDO: indolamina 2,3-dioxigenase IFN-γ: interferon gama
IL: interleucina
IL-32α: interleucina 32 alfa IL-32β: interleucina 32 beta IL-32γ: interleucina 32 gama IL-32δ: interleucina 32 delta
IMF: intensidade média de fluorescência
ISCT: Sociedade Internacional de Terapia Celular JNK: quinases c-Jun NH2-terminais
LMA: Leucemia mieloide aguda
LMA-ARM: Leucemia mieloide aguda com alterações relacionadas à mielodisplasia
LMA de novo: Leucemia mieloide aguda de novo LMC: Leucemia mieloide crônica
LPA: Leucemia promielocítica aguda LSC: células-tronco leucêmicas
MAPK: proteínas quinases mitógeno-ativadas MEM: Minimum Essential Medium
miRNA: micro RNA MO: medula óssea
MOI: multiplicity of infection
MSC: células estromais mesenquimais MTT: methylthiazoletetrazolium
NCBI: National Center for Biotechnology Information NF-kB: fator nuclear kB
NIH: National Institutes of Health NK: natural killer
PBMC: células mononucleares de sangue periférico PBS: tampão fosfato-salino
PCRq: reação em cadeia da polimerase quantitativa PGE2: prostaglantina E2
PHA: fitohemaglutinina RNA: ácido ribonucleico RNAi: RNA de interferência RNAm: RNA mensageiro
RPGE2: receptor de prostaglantina E2 RPMI: Roswell Park Memorial Institute
RT-PCR: reação em cadeia da polimerase em tempo real SDF-1: fator derivado do estroma 1
SFB: soro fetal bovino
SMD: Síndromes mielodisplásicas SP: sangue periférico
TCLE: termo de consentimento livre e esclarecido TGF-β1: fator de transformação do crescimento beta 1 TNF-α: fator de necrose tumoral alfa
TNFR1: receptor 1 do fator de necrose tumoral
TRAIL: ligante indutor de apoptose relacionado ao TNF Tregs: células T regulatórias
VEGF: fator de crescimento do endotélio vascular
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ... 23
Nicho hematopoiético ... 23
Células estromais mesenquimais ... 24
MSC e doenças hematológicas ... 27
Moléculas inflamatórias e a patogênese das neoplasias hematológicas .... 29
Quimiocina (C-X-C motivo) ligante 12 (CXCL12) ... 30
Fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) ... 30
Fator de transformação do crescimento beta 1 (TGF-β1) e fator de crescimento de hepatócitos (HGF) ... 30
Indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) ... 31
Prostaglandina E2 (PGE2) ... 31
Interleucina-10 (IL-10) ... 32
Interleucina-1 beta (IL-1β) e interleucina-6 (IL-6) ... 32
Interleucina-32 (IL-32) ... 33
Vias de sinalização MAPK e NF-kB ... 35
OBJETIVOS ... 37
Objetivos Gerais ... 37
Objetivos Específicos ... 37
CASUÍSTICA ... 38
Amostras de MO de doadores saudáveis, pacientes SMD e LMA ... 38
Amostras de sangue periférico (SP) de doadores saudáveis e pacientes com SMD ... 39
METODOLOGIA ... 41
Células estromais mesenquimais primárias ... 41
Cultura de linhagens celulares ... 41
Reagentes químicos ... 41
Extração de RNA e síntese de cDNA das MSC primárias e de linhagens celulares ... 41
Extração de RNA e síntese de cDNA das células CD3+ de sangue periférico ... 42
Padronização dos iniciadores para amplificação por PCRq ... 44
Citometria de fluxo ... 48
Ensaio de proliferação de linfócitos CD3+ ... 48
Inibição de IL-32 ... 49
Clonagem dos miRNA nos vetores do sistema de Lentivírus ... 49
Produção e titulação de partículas virais ... 54
Transdução de células com os vírus de silenciamento ... 55
Western Blotting ... 56
Ensaio de Methylthiazoletetrazolium (MTT) ... 56
Ensaio de proliferação celular por marcação com Ki-67 ... 57
Ensaio de quimiotaxia ... 57
Ensaio de quimioresistência ao AraC ... 58
Imunoensaio Multiplex ... 58
Análise dos dados ... 59
RESULTADOS ... 60
Avaliação da expansão das MSC ... 60
Perfil imunofenotípico das MSC de medula óssea de doadores saudáveis, pacientes com SMD e LMA ... 61
Avaliação da capacidade imunomodulatória das MSC ... 62
Avaliação dos transcritos de citocinas e moléculas inflamatórias nas MSC 63 Expressão gênica das isoformas de IL-32 em células estromais mesenquimais ... 67
Estabelecimento do silenciamento de IL-32 em células HS5 por miRNA mediado por lentivírus ... 69
Avaliação do efeito do silenciamento de IL-32 na viabilidade de células HS5 ... 72
Atividade quimiotática de IL-32 sobre células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ... 73
Quimioproteção ao AraC conferida por células HS5 miIL32 ... 74
Modulação da secreção de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento por IL-32 ... 76
Avaliação do efeito do silenciamento da IL-32 nas vias de sinalização NF-κB e MAPK ... 76
Expressão gênica de IL32 e suas isoformas em células CD3+ de sangue periférico em doadores normais e pacientes com SMD ... 79 DISCUSSÃO ... 82 CONCLUSÕES ... 89 REFERÊNCIAS ... 91 APÊNDICE ... 106 Apêndice I - Parecer substanciado do CONEP ... 106 Apêndice II - TCLE (Pacientes) ... 120 Apêndice III - TCLE (Doadores saudáveis - Grupo controle) ... 123
INTRODUÇÃO
Nicho hematopoiético
A hematopoiese é um processo contínuo de produção das células sanguíneas, que ocorre através da proliferação orquestrada, autorrenovação e diferenciação das células-tronco hematopoiéticas (HSC) na medula óssea (MO), com uma posterior saída das descendentes maduras para o sangue circulante1, 2. A regulação da quiescência, proliferação e diferenciação das
HSC3-5 depende do seu microambiente local, denominado nicho
hematopoiético.
O nicho hematopoiético é definido pela presença de duas regiões com características distintas, denominadas de nicho osteoblástico (endosteal) e nicho vascular6. O nicho osteoblástico, é localizado na superfície interior da cavidade do osso, com abundante concentração celular de osteoblastos e proporciona um microambiente para as HSC manterem seu estado quiescente7, 8. O nicho vascular é localizado na região sinusoidal, mais próxima aos vasos sanguíneos, e neste microambiente as células recebem estímulos para promover a proliferação e diferenciação de forma ativa9-11 (Figura 1).
MSC Megacariócito Sinusóide Célula endotelial Macrófago Células CAR perivascular Citocinas e fatores de crescimento HSC HSC Adipócito Matriz extracelular Osteoclasto Osteoblastos
Figura 1. Modelo com os principais componentes do nicho hematopoiético.
Para manutenção das características essenciais das HSC, o nicho hematopoiético é controlado por diversos fatores celulares e moleculares. A interação entre as HSC, células estromais, citocinas e quimiocinas secretadas neste microambiente é necessária para manter a hematopoiese e a homeostase medular13. Vários componentes celulares do microambiente da MO, incluindo osteoblastos, células endoteliais vasculares, células estromais mesenquimais (MSC), monócitos, macrófagos são responsáveis por fornecer o
suporte das HSC14. A função de cada componente do nicho das HSC não é
completamente elucidada, no entanto já é descrito que tanto as células osteoblásticas15, quanto as MSC são capazes de realizar o suporte das HSC ex vivo16.
Desde a primeira descrição de nicho hematopoiético, feita por Schofield em 1978 17, tem havido um grande interesse e com importante progresso, na compreensão dos caminhos de comunicação envolvidos na interação nicho-HSC4, 18. Por outro lado, as interações entre células leucêmicas e o nicho medular são bem menos definidas19. Uma maior compreensão dessas interações é de suma importância para terapêutica e compreensão da fisiopatologia das leucemias20.
Células estromais mesenquimais
Um dos principais componentes do nicho hematopoiético são as MSC, importante reguladoras da hematopoiese e do sistema imune21, 22. As MSC têm emergido como um grande foco de diversos tipos de pesquisas, devido à sua capacidade de autorrenovação, e de se diferenciarem em células de origem mesodérmica, como osso, cartilagem, gordura e músculo. Portanto, são importantes na terapia celular, medicina regenerativa e reparação tecidual, pelo fato de serem recrutadas para locais de inflamação e reparação de tecidos23, 24. A maior parte dos estudos e o principal sítio de obtenção das MSC é a MO25. Elas podem ser facilmente isoladas a partir da MO e expandidas ex vivo, sem qualquer alteração aparente no fenótipo ou perda de função26. Além da MO, existem descrições de outros sítios de obtenção de MSC, como tecido adiposo27, sangue periférico28, placenta e membranas fetais29, endométrio30,
líquido amniótico , membrana amniótica , tecidos dentais , sangue menstrual34, glândula salivar35, pele e prepúcio36 e líquido sinovial37.
Com a descoberta da presença de MSC em diversas fontes, tornou-se necessária uma melhor caracterização desse tipo celular. As MSC foram descritas pela primeira vez por Friedenstein, a partir de MO de camundongos, como uma cultura de células aderentes ao plástico, capazes de formar unidades formadoras de colônias de fibroblastos (CFU-F) e potencial para diferenciação em adipócitos, condrócitos, osteócitos e linhagem muscular38, 39. A noção de células-tronco mesenquimais foi proposta por Owen40 e popularizado por Caplan no início da década de 199041. No entanto, na segunda metade da década de 90 diversos pesquisadores optaram por omitir qualquer referência a uma célula-tronco em seus trabalhos com MSC42-44. Em 2000, a Sociedade Internacional de Terapia Celular (ISCT) concluiu que faltavam dados convincentes que suportassem as características de célula-tronco para essa fração celular com características in vitro de aderência ao plástico. Apesar disso, a sigla MSC foi mantida, mas a denominação adotada foi de células estromais mesenquimais e não mais de células-tronco mesenquimais45.
Além dessa caracterização, a ISCT preconizou que as MSC devem apresentar o seguinte imunofenótipo in vitro: negativas para os marcadores hematopoiéticos CD34, CD45, CD11, CD31, CD19 e HLA-DR; positivas para os marcadores CD73 (5’-nucleotidase), CD90 (antígeno de superfície Thy-1) e CD105 (endoglina). Além disso, devem ser aderentes ao plástico e apresentarem a capacidade de diferenciar em tecidos ósseos, adiposos e cartilagens pela adição de fatores de crescimento exógenos45, 46.
Na MO, as MSC estão envolvidas na regulação do microambiente que controla a quiescência e a proliferação das HSC47. Entretanto, as MSC não apenas fornecem suporte para as HSC, mas também têm importantes efeitos imunossupressores48-50. Essas propriedades são características promissoras das MSC49, 51, 52: a baixa expressão de MHC de classe I, a falta de MHC de classe II e a ausência de moléculas coestimulatórias, tais como CD80, CD40 e CD8653, além da sua capacidade de inibir resposta proliferativa de linfócitos alogênicos, indicam que as MSC são de baixa imunogenicidade54, 55.
Realmente, as MSC têm efeitos imunossupressores sobre células da resposta imune inata e adaptativa56. Elas podem inibir a função das células B e sua diferenciação57, inibir a função das células NK58, inibir a geração de células dendríticas derivadas de monócitos59, inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias como IL-2, IFN-γ e TNF-α e promover a produção de IL-1060, 61. As MSC afetam diretamente as células T, inibindo sua proliferação em resposta à vários estímulos62 e a produção de IL-2 e TNF-α pelas mesmas63, além de induzir a diferenciação de células T regulatórias (Tregs)64, 65. Diversos estudos indicam que as MSC são capazes de inibir proliferação e ativação de linfócitos T em resposta a aloantígenos e mitógenos não específicos in vitro49, 51. Esses mecanismos de imunossupressão são mediados por diferentes mecanismos, incluindo a indolamina 2,3-dioxigenase (IDO), oxido nítrico, prostaglandina E2, fator de transformação do crescimento beta 1 (TGF-β1), fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e Interleucina-10 (IL-10)66 (Figura 2).
MSC
Célula dendrítica Tregs Células B Células NK Linfócitos IDO Triptofano Quinurenina HGF TGFβ1 IL10 PGE2Figura 2. Modelo esquemático das principais funções imunossupressoras das MSC.
Tem sido sugerido que as características funcionais das MSC dependem do microambiente e podem ser modificadas por sinais ambientais. Em diversas patologias em que a MO apresenta anormalidades, a desregulação na expressão de citocinas ou quimiocinas como IFN-γ, TNF-α, IL-1β, ou IL-6 afeta diversos componentes celulares da MO. Assim, as MSC de pacientes com neoplasias hematológicas podem ser comprometidas e apresentarem funções desreguladas, embora a possibilidade de defeitos primários nestas células não seja descartada67, 68.
MSC e doenças hematológicas
As síndromes mielodisplásicas (SMD), são desordens clonais das HSC, caracterizadas por defeitos na capacidade de formar as células do sangue, resultando em citopenias periféricas69-71. A SMD ocorrem predominantemente nos idosos72, diversos fatores incluindo exposição ambiental, predisposição genética, quimioterapia ou terapia com radiação estão associadas com o desenvolvimento das SMD73. A heterogeneidade das características da doença torna difícil o diagnóstico, classificação e a conduta terapêutica dos pacientes74. A categorização da SMD nos subgrupos de baixo e alto risco de evolução para leucemia mieloide aguda (LMA) baseia-se na percentagem de blastos leucêmicos na MO, na presença de sideroblastos em anel, no número e tipo de linhagens celulares displásicas e anormalidades citogenéticas75, 76. A evolução das SMD é um processo que envolve diversos estágios. Nos estágios iniciais, alguns clones de HSC apresentam mutações genéticas somáticas, estes clones estão associados com uma hematopoiese displásica, produção excessiva de citocinas mielosupressoras, diferenciação defeituosa e instabilidade genômica77. A transformação da SMD para LMA é um resultado da evolução desse processo, com hipermetilação, silenciamento de genes supressores tumorais e ativação de oncogenes77-79.
Nas SMD a medula é geralmente hiperproliferativa, entretanto a doença é caracterizada pela hematopoiese ineficaz e citopenias. Este paradoxo é atribuído à apoptose dos precursores hematopoiéticos finais e a imunodesregulação que ocorrem na MO79-81. Alguns grupos têm relacionado o microambiente da MO como a fonte de sinais pró-apoptóticos para as HSC,e já
foi demonstrado que as células estromais são capazes de produzir o fator pró-apoptótico FAS ligante, ao passo que seu receptor foi encontrado expresso nas
HSC de pacientes com SMD82. Também é descrito que as MSC de pacientes
com SMD apresentam defeitos na capacidade de suporte das HSC83-85 e que elas perdem sua capacidade de imunossupressão a linfócitos T86. Entretanto, os estudos com MSC de pacientes com SMD têm sido bastante inconsistentes e contraditórios, e isso é principalmente atribuído à variabilidade de metodologias utilizadas para o isolamento e expansão in vitro, bem como pela heterogeneidade dos pacientes com SMD67.
Cerca de 30% dos pacientes com SMD evoluem para LMA87,
reconhecida clinicamente como um subtipo de leucemia secundária ou LMA com alterações relacionadas à mielodisplasia (LMA-ARM)88. Os pacientes com LMA-ARM apresentam porcentagem de blastos de 20% ou na MO ou SP e (1) progressão documentada a partir de SMD, (2) anormalidades citogenéticas específicas relacionadas com a mielodisplasia, ou (3) displasia em 50% ou mais das células em 2 ou mais linhagens mieloides89. As diferenças biológicas e no prognóstico entre a LMA-ARM e a LMA de novo são bem documentadas, como por exemplo um pior prognóstico de pacientes jovens com LMA-ARM, comparado com pacientes com LMA de novo90.
A LMA surge após uma série de alterações na HSC, levando à uma proliferação descontrolada de blastos imaturos que se acumulam na MO e suprimem a hematopoiese normal91, 92. Trabalhos recentes demonstraram a coexistência de vários clones em pacientes com leucemia aguda, o que sugere que o microambiente medular é particularmente permissivo para o aparecimento de células pré-leucêmicas e displásicas, com clones com características mais dominantes e proliferativas93, 94.
Os pacientes diagnosticados com LMA são tratados com intensiva quimioterapia, e alguns pacientes beneficiam-se do transplante de MO. No entanto, uma elevada proporção de pacientes sofre recidiva da doença95. As recidivas podem em parte ser explicadas pela inerente resistência de blastos leucêmicos alojados em compartimentos específicos, ou alternativamente, por a resistência das células-tronco leucêmicas (LSC) que mantém seu estado quiescentes e, por consequência, não respondem à quimioterapia91. As
evidências atuais indicam que a adesão das LSC ao nicho celular na MO é crucial para a manutenção da capacidade de autorrenovação e do estado quiescente, associando o nicho medular a conferência de resistência aos agente quimioterápicos e recidiva leucêmica96, 97.
É racional assumir que se as MSC apresentam diversas funções primordiais no microambiente medular e na manutenção das HSC, as MSC derivadas de pacientes com doenças hematológicas devem apresentar alguns defeitos, sejam eles primários ou secundários. Diversos trabalhos já demonstraram interações entre células leucêmicas e seu microambiente, suportando a ideia de que defeitos no microambiente das HSC pode ter um importante papel na desenvolvimento da SMD e LMA67, 98-100. Além disso, interações entre as MSC, presentes no nicho leucêmico, e os clones malignos são componentes críticos na resistência a diversos agentes quimioterápicos 101-103.
Uma das hipóteses deste trabalho é que as MSC de pacientes com SMD e LMA apresentem alterações funcionais e no seu perfil de moléculas secretadas que possivelmente possam favorecer o estabelecimento e a evolução destas doenças.
Moléculas inflamatórias e a patogênese das neoplasias hematológicas Uma das grandes características da malignidade é a presença da inflamação104, que é bem reconhecida como um importante fator na patogênese da SMD e LMA, e envolve diferentes vias de sinalização celulares e moleculares10, 14-16. Assim, o estado contínuo de inflamação provido pelo nicho leucêmico pode contribuir para iniciação e progressão das doenças hematológicas.
Existem fatores secretados pelas MSC que têm sido implicados como possíveis mediadores inflamatórios e da interação disfuncional com as HSC, entretanto as funções específicas de muitos destes fatores, incluindo citocinas, fatores angiogênicos, metaloproteinases e moléculas de adesão ainda não estão bem compreendidos13.
Quimiocina (C-X-C motivo) ligante 12 (CXCL12)
CXCL12 ou fator derivado das células estromais 1 (SDF-1) é uma quimiocina envolvida no tráfego das células progenitoras na MO e pode afetar o tráfego celular das células leucêmicas105. CXCL12 é produzido por MSC, células endoteliais, osteoblastos e fibroblastos na MO106.
O CXCL12 é fortemente quimiotático para linfócitos e possui um papel importante na angiogênese através de um mecanismo dependente de seu receptor CXCR4, recrutando células progenitoras endoteliais da MO, desempenhando um papel importante na hematopoiese normal e na biologia da célula leucêmica. Esta função de CXCL12 o torna um fator muito importante na carcinogênese, resistência terapêutica e na neovascularização ligado a progressão do tumor107.
Fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF)
VEGF tem papel na geração local de citocinas inflamatórias108, além disso, a família do VEGF e seus receptores exercem um papel central na angiogênese, eles podem mediar mecanismos de permeabilização vascular, proliferação endotelial, migração e sobrevivência109-111.
Estudos sugerem que a vascularização e fatores angiogênicos, dentre eles o VEGF, estão com níveis plasmáticos aumentados em leucemias e nas SMD112-114. Aproximadamente 85% das biopsias de MO dos pacientes com LMA apresentam alta expressão proteica de VEGF-A e aumento da densidade dos microvasos115-118. O aumento dos níveis plasmáticos de VEGF-A estão associados com menor taxa de remissão completa e menor sobrevida em pacientes com LMA119, 120.
Fator de transformação do crescimento beta 1 (TGF-β1) e fator de crescimento de hepatócitos (HGF)
As citocinas TGF-β1 e HGF são fatores solúveis constitutivamente produzidos pelas MSC e medeiam a supressão das células T. O papel de TGF-β1 na imunossupressão ainda não é totalmente conhecido, mas diversos estudos relatam o TGF-β1 como o mediador chave da imunomodulação realizada pelas MSC121. Além da sua atividade imunossupressora direta, ele
também é capaz de induzir as células Tregs através da regulação positiva da expressão de Foxp3122.
HGF, além de seu potencial imunossupressor, parece estimular o crescimento de colônias de blastos na LMA e promove a migração de células leucêmicas123, além de também possuir atividade angiogênica124. Existem descrições que as MSC derivadas de pacientes com SMD secretam menores concentrações de TGF-β1 e HGF, resultando no aumento da proliferação de células T, com redução da imunossupressão e aumento da apoptose celular na MO125, 126.
Indolamina 2,3-dioxigenase (IDO)
A inibição da proliferação de linfócitos pelas MSC tem sido associada com o mecanismo mediado por IDO127. Em resposta ao IFN-γ, IDO catalisa a conversão do triptofano em quinurenina, que induz apoptose das células T128. IDO também desempenha um papel crucial na indução de tolerância imunológica nas neoplasias visto que a produção de quinurenina promove o desenvolvimento, estabilização e ativação de células Tregs, melhorando o fenótipo supressor e prevenindo sua reprogramação em células do tipo não-supressoras129, 130. Além da supressão de células T efetoras, contribui de forma efetiva com a debilidade do sistema imunológico em indivíduos portadores de câncer131. IDO pode contribuir para a modificação do microambiente tumoral, facilitando o suporte para as células tumorais56. Assim, IDO pode ser considerada um dos mecanismos de escape do sistema imune, e a inibição da IDO pode ser considerada como um potencial alvo de terapia antileucêmica132, 133.
Prostaglandina E2 (PGE2)
Outro fator solúvel importante na imunossupressão é a PGE2, um componente-chave do ambiente inflamatório crônico, capaz de alterar as funções de células dendríticas, das células NK e das células T134. PGE2 é um lipídio bioativo que medeia uma grande quantidade de funções fisiológicas e patológicas exercendo um importante papel na inflamação e no câncer135. PGE2 inibe a proliferação das células T e também inibe a produção de algumas
citocinas, tais como TNF-α e IL-12. Alta quantidade de PGE2 também provoca disfunção imunológica e escape do tumor136, 137. As ações biológicas de PGE2, incluindo os seus efeitos sobre imunidade, são mediadas por receptores acoplados à proteína, designado EP (para os receptores prostanóides E)138, 139 e estes receptores são divididos em quatro classes farmacológicas distintas (EP1-4)138.
As funções dos receptores de prostaglandina no contexto fisiológico e patológico são determinados por um conjunto de interações entre ligantes-receptores, que dependem de múltiplos fatores tais como a afinidade do ligante, o perfil de expressão do receptor e o tipo celular em que o receptor é expresso134. No entanto, as ações da PGE2 mediadas pelos receptores EP sugerem que os níveis de expressão destes receptores podem contribuir na patogênese de doenças e serem exploradas na sua terapia134, 140.
Interleucina-10 (IL-10)
Evidências tanto para promoção tumoral quanto função antitumoral já foram descritas para IL-10141, 142. Já foi demonstrado, por exemplo, em pacientes com SMD, que após a dosagem de um painel de 27 de citocinas/quimiocinas no plasma periférico de 114 pacientes, várias citocinas inflamatórias apresentaram concentrações significativamente maiores nos pacientes quando comparado com o grupo controle. Por outro lado, citocinas pleiotrópicas como IL-10 e IL-4 foram expressas em menores concentrações e foram diretamente correlacionada com a sobrevida do paciente143.
IL-10 apresenta a capacidade de inibir o fator estimulador de colônias de granulócitos e monócitos (G-CSF e GM-CSF), além de atuar como um inibidor dos blastos leucêmicos144, 145. IL-10 também é capaz de inibir IL-6, IL-1β e TNF-α, todas citocinas associadas com uma menor sobrevida em diversas doenças146-148. Polimorfismos no gene da IL-10 já foram correlacionados com a LMA149.
Interleucina-1 beta (IL-1β) e interleucina-6 (IL-6)
A presença de citocinas pró-inflamatórias como IL-6 ou IL-1β constitui uma característica da inflamação associada ao câncer150. Citocinas como IL-1β
e IL-6 atuam como mediadores entre a MO e o sistema imune. Uma gama de respostas biológicas é ativada em resposta a IL-1β, sendo o mais importante o potente estímulo da secreção de quimiocinas e fatores de crescimento que são capazes de aumentar a migração e adesão das MSC151. IL-1β pode atuar como fator de crescimento autócrino na LMA e leucemia mieloide crônica147.
IL-6 é uma citocina com efeitos pró e anti-inflamatórios. Já foram demonstrados efeitos diferentes (estimulantes, inibitórios ou neutros) sobre o crescimento de blastos leucêmicos146, 152. IL-6 desempenha um papel importante na imunomodulação, na angiogênese, na resistência às drogas, no crescimento de blastos leucêmicos146, 152, além de alterar a resposta dos linfócitos T CD4+ 153. Existem evidências que a secreção de IL-1β por células leucêmicas pode estimular a secreção de G-CSF e GM-CSF e isso possa contribuir para a proliferação dos blastos leucêmicos154.
IL-6 parece ser fundamental na interação entre as células tumorais e as MSC no microambiente da MO, atuando como um potente fator pró-tumorigênico155, 156 , através da sua contribuição no microambiente propício para o crescimento tumoral. IL-6 produzida pelas MSC contribui para formação de um microambiente permissivo para o crescimento tumoral, como também fornece uma proteção para as células tumorais contra os efeitos citotóxicos de agentes quimioterápicos157, 158.
Interleucina-32 (IL-32)
A IL-32 foi descrita originalmente com a denominação de transcrito de células natural killer 4 (NK4), a partir de uma biblioteca de cDNA derivada de células NK ativadas com IL-2159. A IL-32 é uma citocina proinflamatória, produzida por linfócitos T, células NK, monócitos e células epiteliais160, 161. Sua produção é predominantemente induzida por TNF-α, IFN-γ, IL-1β e IL-22, 160. IL-32 é considerada uma citocina pleitrópica, envolvida em diversas funções biológicas incluindo diferenciação celular162, 163, estímulos de citocinas pró e anti-inflamatórias164, 165, morte celular e apoptose166, 167.
A ideia geral de que uma citocina se ligue a um receptor de superfície da membrana celular e exerça a sua função foi intensamente investigado para IL-32, entretanto, diferente das demais citocinas, nenhum receptor foi
encontrado168. A maioria dos estudos sobre IL-32 indicam que ela é uma citocina de ação intracelular169.
Até o momento, nove isoformas foram descritas para IL-32 no banco de dados do NCBI170. A superexpressão da IL-32, especialmente de sua isoforma maior e mais potente IL-32γ, tem sido descrita na amplificação da sinalização de vias inflamatórias induzidas por TNF-α164, além de efeitos antivirais em diversas doenças171-173. Por outro lado, foi demonstrado o efeito paradoxal da IL-32γ em camundongos transgênicos com colite experimental, onde os índices de severidade da doença e de lesão tecidual foram menores em camundongos transgênicos para IL-32γ, sugerindo que a expressão de IL-32γ nestes camundongos possui diferentes propriedades174. Outro trabalho demonstrou que a isoforma IL-32β regula a produção da citocina anti-inflamatória IL-10165 e aumenta a adesão de células imunes para ativar células endoteliais175, enquanto a superexpressão da isoforma IL-32α em leucemia mieloide crônica aumenta a morte celular mediada por células NK176. Desta forma, apesar de algumas isoformas da IL-32 desencadearem respostas pró-inflamatórias, outras isoformas podem ter propriedades imunossupressoras.
É bem descrito que a IL-32 é um componente chave em diversas patologias, através da indução de várias citocinas pró-inflamatórias contribuindo para a progressão e patogênese de várias doenças inflamatórias177, infecciosas178, virais172, autoimunes179, 180, alguns tipos de câncer181, 182. Recentemente foi descrito a participação de IL-32 na fisiopatologia de doenças mieloides clonais183. Nas MSC de pacientes com SMD foi descrito um aumento da expressão de IL-32, enquanto que nas MSC de pacientes com LMMC foi descrito uma diminuição da sua expressão, quando comparadas com MSC de indivíduos saudáveis108. Este grupo também mostrou que o tratamento com TNF-α nas linhagens celulares de estroma HS5 e HS-27a resulta no aumento de IL-32 e esta, em resposta induz mais produção de TNF-α108.
IL-32 induz citocinas inflamatórias como TNF-α, IL-1β, IL-6 e quimiocinas através das vias de sinalização fator nuclear (NF)-kB e proteínas quinases mitógeno-ativadas (MAPK)160. Assim, a segunda hipótese deste trabalho é que
a IL-32, através da sua capacidade de regular essa rede de citocinas envolvidas na inflamação, possa participar da fisiopatologia da SMD e LMA. Vias de sinalização MAPK e NF-kB
As MAPKs são reguladoras chave de diversos processos fisiológicos e patológicos como proliferação celular, sobrevivência, apoptose, diferenciação, metabolismo, motilidade e respostas imune inata e adaptativa184, 185. A ativação da sinalização MAPK desempenha um papel crítico no desenvolvimento e progressão do câncer186. Existem três grupos principais de MAPKs; as proteínas quinases reguladas por sinais extracelulares (ERK1/2), as quinases p38 MAP e as quinases c-Jun NH2-terminais (JNK1/2/3)187. Estas vias de MAPK podem ser ativadas por diferentes estímulos celulares, incluindo fatores de crescimento, citocinas e estresse celular, ocasionando uma cascata de fosforilação sequencial188. Em geral, a via ERK é principalmente envolvida no crescimento, diferenciação e proliferação celular, enquanto que as vias JNK e p38 MAPK são, preferencialmente, envolvidas na inflamação, apoptose, crescimento e diferenciação186, 189.
O papel das MAPK ativadas por estresse, incluindo a JNK e p38, no câncer é complexo e em alguns casos controverso186, 190. No entanto, a ativação e expressão aberrante de JNK são encontradas em muitas linhagens celulares de câncer, bem como em amostras de pacientes190. Tem sido sugerido que a sinalização JNK pode contribuir na carcinogênese, pois c-Jun, alvo de JNK, é necessário na carcinogênese induzida pelo oncogene Ras191, 192.
p38 MAPK é ativado por estresse ambiental e genotóxico e têm funções importantes na inflamação, assim como na homeostasia dos tecidos193. p38 MAPK pode ter funções oncogênicas, pela sua função em processos como invasão, inflamação e angiogênese194 e a ativação constitutiva de p38 MAPK na MO poderia contribuir com a ativação de citocinas pró-inflamatórias presentes no microambiente medular195.
O fator nuclear (NF)-kB pertence a uma família de fatores de transcrição e é composto por várias proteínas de NF-kB (p50/p105, p52/P100) e da subfamília Rel (RelA/p65, RelB, c-Rel), que formam heterodímeros e são
capazes de se ligar a vários genes alvo196. O NF-kB é ativado em resposta a uma variedade de estímulos, como antígenos patogênicos, estresse oxidativo, danos do DNA e citocinas inflamatórias. Essa ativação desencadeia a expressão de diversos genes alvo, envolvidos na resposta adaptativa e na regulação da expressão de diversas citocinas e quimiocinas, incluindo TNF-α, IL-6, IL-8, moléculas de adesão e proteínas envolvidas na resposta imune81, 196.
Diversas evidências demonstram que a via de sinalização NF-kB é essencial para a diversas funções das HSC, incluindo proliferação, autorrenovação e diferenciação197, 198. Isto sugere que a desregulação da atividade de NF-kB pode estar envolvida nas anormalidades de diferenciação e proliferação dos precursores na SMD e LMA199. Já foi demonstrado que a atividade de NF-kB é significativamente elevada em progenitores na MO de pacientes com SMD, apresentando os níveis mais elevados de atividade nos estágios mais tardios da doença, sendo assim, correlacionada com a progressão da doença200. Também foi descrito que o bloqueio da atividade de NF-kB é capaz de induzir a apoptose dos precursores hematopoiéticos normais e mielodisplásicos da MO201-203, sugerindo que a atividade constitutiva da sinalização de NF-kB proporciona a proliferação de células malignas, culminando com o aumento dessas células nos estágios tardios da SMD e na LMA81.
Guzman e colaboradores204, 205 reportaram uma ativação constitutiva da via NF-kB em células primárias de pacientes com LMA, fornecendo evidências que NF-kB desempenha um papel significativo na sobrevida dos blastos leucêmicos. Além disso, acredita-se que as células leucêmicas possam causar a ativação da via NF-kB nas MSC e essa ativação possa estar diretamente
associada a quimioproteção mediada pelas células estromais103.
Consequentemente, esta via está implicada como um alvo central no desenvolvimento de novas terapias na LMA.
OBJETIVOS
Objetivos Gerais
Caracterizar as funções e o perfil de citocinas e moléculas inflamatórias das células estromais mesenquimais de MO de pacientes com SMD, LMA e doadores saudáveis. Estudar a função biológica de IL-32 na linhagem celular estromal HS5 e caracterizar sua expressão em células CD3+ de sangue periférico de pacientes com SMD.
Objetivos Específicos
1. Nas MSC primárias de pacientes e controles:
a. Avaliar a habilidade de proliferação durante a cultura até a 4ª passagem; b. Caracterizar o perfil imunofenotípico;
c. Avaliar a capacidade imunomodulatória;
d. Caracterizar a expressão gênica de citocinas e moléculas inflamatórias; e. Avaliar a ativação da via NF-kB.
2. Nos estudos in vitro com a linhagem HS5 inibidas para IL-32: a. Avaliar viabilidade e proliferação;
b. Estudar a quimiotaxia sobre células mononucleares de sangue periférico de doadores saudáveis;
c. Quantificar a secreção de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento;
d. Avaliar a capacidade de quimioproteção ao AraC, através da cocultura com a linhagem celular U937;
e. Caracterizar as vias de sinalização NF-kB e MAPK (p38 e JNK).
3. Nas células CD3+ de sangue periférico de pacientes com SMD e controles: a. Caracterizar a expressão da IL32 e suas isoformas;
CASUÍSTICA
Amostras de MO de doadores saudáveis, pacientes SMD e LMA
Para expansão das MSC, amostras obtidas por punção de MO, foram coletadas de indivíduos saudáveis e pacientes atendidos no Centro de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Estadual de Campinas, com aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (Apêndice I). Foi aplicado um termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) aos pacientes e controles envolvidos na pesquisa (Apêndice II e III). Foram coletadas 08 amostras de medula óssea de controle, sendo 05 homens e 03 mulheres, com idade mediana de 45 anos (28-57 anos). As amostras dos doadores foram obtidas durante o procedimento de coleta da medula óssea para transplante, sem necessidade de nova punção para este estudo.
Só foram incluídos nos estudo pacientes com pelo menos 6 meses sem tratamento e que tiveram a confirmação do diagnóstico de SMD ou LMA através de mielograma, citoquímica, citogenética e biopsia de MO. As características dos pacientes com SMD e LMA, classificados conforme as normas da WHO88, estão descritas na Tabela 1. Os pacientes foram clinicamente agrupados em baixo risco e alto risco para evolução da SMD (baixo risco: CRDU, CRDM e ARSA, alto risco: AREB-1 e AREB-2). Pacientes com diagnóstico de leucemia promielocítica aguda [LPA ou LMA com t(15;17)(q22;q12)] foram excluídos do grupo de pacientes com LMA de novo.
Tabela 1. Características dos pacientes com diagnóstico de SMD e LMA.
SMD LMA-ARM LMA de novo
Pacientes 22 07 12
Gênero (masculino/feminino) 16/06 02/05 06/06
Idade, mediana (range) 71 (16-90) 69 (30-86) 61 (44-82)
Citogenética
Baixo risco (normal/-Y) Intermediário Alto risco (complexo/ cromossomo 7) Não avaliada 16 02 01/02 01 03 00 04/00 00 07 00 05/00 00 Classificação SMD WHO CRDU/CRMD/ARSA AREB-1/AREB-2 IPSS Baixo/Int-1 Int-2/Alto Não classificados 01/11/04 02/04 08/10 01/02 01 --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
SMD: Síndrome mielodisplásica; LMA: Leucemia mieloide aguda; LMA-ARM: LMA com alterações relacionadas à mielodisplasia; CRDU: Citopenia refratária com displasia unilinear, CRDM: Citopenia refratária com displasia multilinear, ARSA: Anemia refratária com sideroblastos em anel, AREB-1: Anemia refratária com excesso de blastos-1, AREB-2: Anemia refratária com excesso de blastos-2, IPSS: International Prognostic Scoring System, INT-1: intermediário-1, INT-2: intermediário-2.
Amostras de sangue periférico (SP) de doadores saudáveis e pacientes com SMD
Para caracterização da expressão de IL32 em células CD3+ de sangue periférico de pacientes com SMD e controles, todas as amostras foram provenientes de um estudo anterior, durante o mestrado do aluno206. Estas amostras foram coletadas entre o período de março de 2005 a junho de 2011, no Hemocentro da Unicamp com aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa e assinatura do termo de consentimento informado.
Foram utilizadas 29 amostras de doadores saudáveis, sendo 23 homens e 06 mulheres, com idade mediana de 39 anos (28-60 anos), e 49 amostras de
pacientes com SMD, com pelo menos 6 meses sem tratamento. As características dos pacientes com SMD estão descritas na Tabela 2, classificados conforme as normas da WHO88. Os pacientes foram clinicamente agrupados em baixo risco e alto risco para evolução da doença. Baixo risco: CRDU, CRDM e ARSA, alto risco: AREB-1 e AREB-2.
Tabela 2. Características dos pacientes com diagnóstico de SMD.
Pacientes 52
Gênero (masculino/feminino) 27/25
Idade, mediana (range) 67 (27-89)
WHO CRDU/CRMD/ARSA AREB-1/AREB-2 09/26/08 07/02 IPSS Baixo/Int-1 Int-2/Alto Não classificado 25/22 02/00 03 Citogenética
Baixo risco (normal/-Y) Intermediário Alto risco (complexo/ cromossomo 7) Não avaliada 43/01 03 02/00 03
SMD: Síndrome mielodisplásica; WHO: World Health Organization, CRDU: Citopenia refratária com displasia unilinear, CRDM: Citopenia refratária com displasia multilinear, ARSA: Anemia refratária com sideroblastos em anel, AREB-1: Anemia refratária com excesso de blastos-1, AREB-2: Anemia refratária com excesso de blastos-2, IPSS: International Prognostic Scoring System, INT-1: intermediário-1, INT-2: intermediário-2.
METODOLOGIA
Células estromais mesenquimais primárias
Células mononucleares de amostras de medula óssea foram isoladas por centrifugação de gradiente de densidade com Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare), e semeadas na densidade de 106 cells/cm2. Após 3-4 dias de cultura, as células não aderentes foram removidas. As células foram cultivadas
a 37°C, 5% CO2 em meioDMEM contendo 1% Penicilina/ Estreptomicina, 1%
L-Glutamina e 10% de soro fetal bovino. Após atingirem a confluência de 80%, as células foram removidas com tripsina e semeadas novamente, na concentração de 4x103 células/cm2, para sua melhor expansão. Todas as análises das MSC foram realizadas após a 4ª passagem em cultura25.
Cultura de linhagens celulares
As linhagens celulares foram cultivadas em meio RPMI ou DMEM com 10% de soro fetal bovino (SFB), de acordo com recomendações da ATCC ou Invitrogen, e mantidas a 37C e em incubadora de CO2.
Reagentes químicos
As proteínas recombinantes humanas TNF-α e IFN-γ foram adquiridas da empresa PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA). O mitógeno PHA foi obtido da empresa Gibco (Waltham, MA, USA). Citarabina (AraC) foi obtida da Farmacêutica Intas (Ahmedabad, India) e armazenada em solução estoque de 10 mM. O marcador CFSE foi adquirido da empresa Molecular Probes (Eugene, OR, EUA) e diluído em DMSO, conforme recomendações do fabricante, em uma concentração estoque de 5 mM.
Extração de RNA e síntese de cDNA das MSC primárias e de linhagens celulares
O RNA foi extraído com o reagente Trizol (Invitrogen) e posteriormente tratado com DNAse I, para evitar contaminação com DNA genômico. A transcrição reversa do RNA foi realizada a partir de 1μg da amostra de RNA através do kit RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (MBI
Fermentas, Amherst, NY, USA). As amostras de cDNA foram quantificadas em espectrofotômetro NanoDrop e diluídas a 40 ng/μL para serem utilizadas nas reações de PCRq. A qualidade da amostra foi testada por RT-PCR de β2-microglobulina e apenas amostras amplificaram foram incluídas.
Extração de RNA e síntese de cDNA das células CD3+ de sangue periférico
Como já mencionado, estas amostras foram obtidas durante o mestrado do aluno206. Para obtenção das células CD3+ do sangue periférico, foram coletados 14 mL de sangue periférico em tubos com o anticoagulante heparina. As células mononucleares foram isoladas por centrifugação de gradiente de densidade com Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Em seguida, as células CD3+ foram separadas através de colunas de imunoafinidade MIDI-MACS, usando um anticorpo anti-CD3+, de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha). Após purificação, as células foram submetidas à extração de RNA.
O RNA das células CD3+ foi extraído usando o kit RNAspin Mini RNA Isolation Kit, de acordo com as instruções do fabricante (GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, UK).
PCR quantitativo (PCRq)
Amplificação em tempo real foi realizada no ABI 7500 Sequence Detector System (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) utilizando-se SybrGreen PCR Master Mix (MBI Fermentas). Cento e vinte ng de cada amostra de cDNA foram utilizados na reação com os iniciadores. Um controle negativo, sem adição de cDNA, foi realizado para cada par de iniciadores. O protocolo de dissociação foi realizado no final de cada reação para verificar amplificações não específicas. Cada reação foi repetida três vezes no mesmo experimento. A expressão do gene HPRT foi utilizada como controle endógeno. A quantificação relativa da expressão gênica foi calculada utilizando-se a fórmula 2-ΔΔCT 207. A lista de todos os iniciadores utilizados está descrita na Tabela 3.
Tabela 3. Concentração e sequência dos iniciadores.
Gene Concentração Sequência dos Iniciadores
IL32 150 nM 5’ GAACTTTTGGCCGCCATGT 3’ 5’ GGGCCTTCAGCTTCTTCATGT 3’ IL32α 150 nM 5’ GACAGTGGCGGCTTATTATGAG 3’ 5’ GCTCCGTAGGACTTGTCACAAA 3’ IL32β 300 nM 5’ CTGTCTCTCTCGGCTGAGTATTTGT 3’ 5’ TCTTCATGTCATCAGAGAGGACCTT 3’ IL32γ 300 nM 5’ GTAATGCTCCTCCCTACTTC 3’ 5’ GCAAAGGTGGTGTCAGTATC 3’ IL32δ 150 nM 5’ GACGTGGACAGGACGACTTCA 3’ 5’ CCTCGGCACCGTAATCCAT 3’ VEGFA 300 nM 5’ AGCCTTGCCGCCTTGCTGCTCTA 3’ 5’ GTGCTGGCCTTGGTGAGG 3’ CXCL12 150 nM 5’ GAGCTACAGATGCCCATGC 3’ 5’ CTTTAGCTTCGGGTCAATGC 3’ IDO 300 nM 5’ TTGGAGAAAGCCCTTCAAGTG 3’ 5’ TGCCTTTCCAGCCAGACAA 3’ RPGE2 150 nM 5’ CCCCCAGTATTGCAGGAG 3’ 5’ TAGACGAAGCCCAGGAAAAG 3’ IL10 300 nM 5’ GCTGAGAACCAAGACCCAGA 3’ 5’ AAATCGATGACAGCGCCGT 3’ TGFβ1 150 nM 5’ GCGTGCTAATGGTGGAAACC 3’ 5’ GCTTCTCGGAGCTCTGATGTG 3’ HGF 300 nM 5’ TGACTCCGAACAGGATTCTTTCA 3’ 5’ GCAGGGCTGGCAGGAGTT 3’ IL1β 300 nM 5’ CTTTGAAGCTGATGGCCCTAAA 3’ 5’ AGTGGTGGTCGGAGATTCGT 3’ IL6 150 nM 5’ GGTACATCCTCGACGGCATCT 3’ 5’ GTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC 3’ HPRT 150 nM 5’ GAACGTCTTGCTCGAGATGTGA 3’ 5’ TCCAGCAGGTCAGCAAAGAAT 3’
Padronização dos iniciadores para amplificação por PCRq
Como exemplo da padronização dos iniciadores utilizados para avaliação da expressão gênica escolhemos as sequências da IL-32 e suas diferentes isoformas.
Iniciadores para o gene da IL-32 total foram desenhados de forma que fossem específicos e abrangentes para as principais isoformas da IL-32 já descritas de acordo com os dados publicadas no banco de dados NCBI, para análise das isoformas do gene selecionamos as frações α, β, γ e δ de acordo com publicações e todas as sequências tiveram sua especificidade confirmada de acordo com o banco de dados do NCBI (Tabela 3).
A padronização da concentração e verificação de sua eficiência foi realizada por PCRq, usando o reagente Sybr Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) em amostras de cDNA da linhagem leucêmica Jurkat, exceto para isoforma IL-32β, na qual foi utilizada a linhagem estromal HS5 .
Para verificar qual a concentração ideal dos iniciadores do gene IL32 e de suas isoformas foi realizada uma curva de concentrações de 150 nM, 300 nM, 450 nM e 600 nM. Uma vez utilizada a mesma quantidade de amostra em todas as reações, os ciclos de Threshold (Cts) não deveriam variar. Assim, a IL-32 total e das isoformas IL-32α e IL-32δ a concentração ótima escolhida foi de 150nM para os pares de iniciadores, enquanto que para as isoformas IL-32β e IL-32γ a concentração ótima escolhida foi de 300 nM. As concentrações escolhidas correspondem a menor concentração na qual não ocorre variação de Ct. Os valores dos Cts e as curvas de dissociação (melting) dos genes analisados nas concentrações utilizadas estão ilustrados na Figura 3, respectivamente. As reações de PCRq foram realizadas no equipamento 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystem). O gene HPRT foi selecionado como controle endógeno das reações.
Figura 3. Ciclos de amplificação e curva de dissociação dos seguinte genes: IL32 total (A-B), IL32α (C-D), IL32β (E-F), IL32γ (G-H) e IL32δ (I-J) nas diferentes concentrações dos iniciadores.
Estabelecida a concentração ótima dos iniciadores, foi determinada a eficiência de cada reação. Foram realizadas reações em escala logarítmica de uma diluição de cDNA na ordem 1: 2 com 5 ou 4 pontos sendo a concentração inicial de 240 ng (Figura 4). A eficiência ideal é de 100 por cento (valor ideal = 1) com valores toleráveis de 10 por cento a mais ou a menos. Após a análise, os iniciadores foram considerados eficientes e os valores para cada um dos iniciadores são ilustrados na Figura 5.
Figura 4. Curva de eficiência dos seguintes genes: IL32 total (A), IL32α (B), IL32β (C), IL32γ (D) e IL32δ (E) nas diferentes concentrações de cDNA.
Figura 5. Gráfico da curva de eficiência dos seguintes genes: IL32 total (A), IL32α (B), IL32β (C), IL32γ (D) e IL32δ (E), nas diferentes concentrações de cDNA, que apresentaram valores eficientes por volta de 1 (correspondente a 100%).
Citometria de fluxo
Para imunofenotipagem das MSC, foram utilizadas células após a 4ª passagem na cultura. À suspensão celular, ajustada para a concentração de 1x106 células e lavada com PBS, foram adicionados os respectivos anticorpos marcados: anti-CD45 FITC, anti-CD34 APC, anti-CD73 PE, anti-CD31 FITC, anti-HLADR FITC, antiCD45 PercP, anti-CD90 PeCy5 e anti-CD105 PE. A mistura foi homogeneizada e incubada por 30 minutos à temperatura ambiente ao abrigo da luz. Após essa etapa, as células foram lavadas duas vezes em PBS e realizada a aquisição. A linhagem celular leucêmica U937 foi marcada para detecção de células apoptóticas (população anexina V-APC positiva/ iodeto de propídeo (PI) negativa) após cocultura com células HS5. Foram adquiridos 10.000 eventos no citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton– Dickinson, CA, USA). A análise foi realizada através do programa FACSDiva (version 4.0.1, Becton–Dickinson, CA, USA) ou FlowJo software (Treestar, Inc., San Carlos, CA, USA).
Ensaio de proliferação de linfócitos CD3+
Para o ensaio de proliferação de células T, linfócitos T CD3+ alogênicos, purificados a partir de bolsas de leucoredução (n=26) de doadores saudáveis por separação magnética (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany), foram marcados com CFSE. Essas células foram semeadas na concentração de 100.000 células/poço em placas de 96 poços, juntamente com as MSC, na razão MSC/células T de 1:2, 1:5, 1:10, 1:50 e 1:100. A estimulação dos linfócitos T foi induzida por PHA (2,5 μg/mL). Como controles negativo e positivo, foram usados poços com cocultivo sem adição de PHA e poços somente com células T com PHA, respectivamente. Após 4 dias de cultura, a intensidade de fluorescência do CFSE foi analisada por citometria de fluxo (Becton-Dickinson).
