BARRA, A. L. C.1; GUTIERREZ, R. F.1; ARA ´UJO, A. P. U.1
angelica.barra@usp.br
1Instituto de F´ısica de S˜ao Carlos - USP
A biogˆenese de ribossomo ´e um processo altamente complexo, regulado e ordenado. A levedura Saccharo- myces cerevisiae ´e amplamente utilizada como modelo biol´ogico no estudo da biogˆenese de ribossomos em eucariotos, pois, em geral, os fatores envolvidos nesse processo s˜ao conservados evolutivamente em Eukarya. Dessa forma, os estudos feitos em levedura podem ser ´uteis no entendimento do sistema em eucariotos superiores, como os mam´ıferos. No entanto, alguns fatores envolvidos na biogˆenese de ribossomos em levedura apresentam fun¸c˜oes divergentes em mam´ıferos. A prote´ına SBDS ´e membro de uma fam´ılia de prote´ınas altamente conservadas em Archae e eucariotos. Sua participa¸c˜ao na biogˆenese de ribossomos j´a foi comprovada em humanos e leveduras. (1) Em humanos, muta¸c˜oes em SBDS est˜ao relacionadas a 90% dos casos da S´ındrome de Shwachman Bodian Diamond (SDS) entre outras doen¸cas. (1) As prote´ınas NIP7 de leveduras e humanos tamb´em est˜ao envolvidas no processamento ribossomal, por´em participam na s´ıntese de subunidades diferentes, sendo, portanto, um fator divergente. (2) A prote´ına hom´ologa a NIP7, chamada CrNIP7, da alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii, est´a sendo estudada quanto a sua fun¸c˜ao e aos seus parceiros proteicos em nosso laborat´orio. Assim, esse projeto teve como principal proposta o isolamento da ORF de CrSBDS, que codifica a prote´ına hom´ologa de SBDS humana, em C. reinhardtii e a caracteriza¸c˜ao da intera¸c˜ao in vivo e in vitro entre as prote´ınas CrSBDS e CrNIP7. Ao realizar uma busca no genoma de C. reinhardtii utilizando a sequˆencia de SBDS humana, encontramos uma prote´ına hom´ologa (XP 001689481.1) anotada, por´em com sequˆencia parcial e ainda n˜ao caracterizada. Ent˜ao, completamos a sequˆencia utilizando o banco de dados Sequence Read Archive (SRA) para C. reinhardtii, uma plataforma de sequenciamento de alto rendimento. Com a sequˆencia completa foi poss´ıvel desenhar primers para a amplifica¸c˜ao da ORF da CrSBDS a partir do cDNA da alga. O DNA amplificado foi subclonado no vetor de propaga¸c˜ao, pUC19 e sequenciado e depois clonado em vetor de duplo h´ıbrido, pGAD-HA, e tamb´em em vetor de express˜ao bacteriano, pET28a. Para o experimento de duplo h´ıbrido, a linhagem L40 de S. cerevisiae foi co-transformada com as constru¸c˜oes pLexA-N-CrNip7 e pGAD-HA-CrSBDS e plaqueada em meio seletivo. A an´alise de intera¸c˜ao proteica, por ativa¸c˜ao dos genes rep´orteres, foi realizada pelo experimento da beta-galactosidase em papel de filtro e crescimento da levedura em quantidades gradativas de 3-AT (3-amino-1,2,4-triazol). No experimento de pull down, as prote´ınas CrNip7 e 6His-CrSBDS foram expressas separadamente em E. coli Rosetta (DE3), purificadas e submetidas ao teste de intera¸c˜ao por co-purifica¸c˜ao em resina de n´ıquel. A intera¸c˜ao foi analisada por SDS-PAGE. No ensaio de duplo h´ıbrido, foi observada a intera¸c˜ao fraca entre as prote´ınas em quest˜ao. A confirma¸c˜ao dessa intera¸c˜ao foi feita por meio do ensaio de pull down, no entanto, ser˜ao realizadas an´alises por espectrometria de massas para confirma¸c˜ao da identidade das prote´ınas. Portanto, com os dados obtidos at´e o momento, j´a temos forte ind´ıcio de que essas prote´ınas s˜ao parceiras no processo de biogˆenese de ribossomos em C. reinhardtti.
Referˆencias:
1 HESLING, C. et al. The Shwachman bodian diamond syndrome associated protein interacts with HsNip7 and its down regulation affects gene expression at the transcriptional and translational levels. Experimental Cell Research, v. 313, n. 20, p. 4180-4195, 2007.
2 MORELLO, L. G. Caracteriza¸c˜ao funcional das prote´ınas NIP7 e FTSJ3 no processamento o RNA ribossomal em c´elulas humanas. 2012. 127p. Tese (Doutorado em Gen´etica e Biologia Molecular) - Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2012.
IC3
Estudo
estrutural
entre
o
receptor
PPAR
gama
e
pteroilglutamatos
BENTO, G. I. V.1; NASCIMENTO, A. S.1
graziele.bento@usp.br
1Instituto de F´ısica de S˜ao Carlos - USP
O receptor PPAR gama, assim como os demais membros da fam´ılia dos receptores nucleares, contem um motivo de liga¸c˜ao ao DNA (DNA-binding domain, DBD) e um dom´ınio C-terminal hidrof´obico que interage com o ligante (ligand binding domain, LDB). A intera¸c˜ao PPARg-ligante permite que o receptor PPARg forme um complexo heterodim´erico com o receptor de ´acido retin´oico. Esse complexo reconhece e se liga a elementos responsivos do DNA, recrutando prote´ınas co-ativadoras que ir˜ao promover a transcri¸c˜ao de genes que codificam prote´ınas cuja atividade est´a intimamente relacionada ao aumento da sensibilidade `a insulina e a processos de sinaliza¸c˜ao celular que culminam na capta¸c˜ao de glicose nos tecidos adiposo e muscular.(1-2) Portanto, o PPARg ´e um interessante alvo molecular no tratamento da diabetes mellitus tipo II (n˜ao insulino-dependente). Os primeiros ligantes descritos para o PPARg foram os tiazolidinedionas (TZD). A roziglitazona ´e um exemplo de TZD que se liga com alta afinidade ao receptor alvo (Kd 40 nM).(2) Entretanto, apesar de demonstrar aumento de sensibilidade `
a insulina e feitos antidiab´eticos in vivo, seu uso est´a associado com s´erios efeitos adversos tais como aumento na adipogˆenese, reten¸c˜ao de fluidos e insuficiˆencia card´ıaca. Por conta disso, o f´armaco foi retirado do mercado em diversos pa´ıses, incluindo o Brasil. T´ecnicas computacionais realizadas no grupo de Biotecnologia Molecular do IFSC demonstraram uma poss´ıvel intera¸c˜ao entre o PPARg e novos ligantes, tais como o metotrexato e ´acido f´olico. Diante disso, o projeto proposto pretende caracterizar estruturalmente a intera¸c˜ao entre o LBD do PPARg e tais ligantes. Para tanto, o dom´ınio em quest˜ao ser´a expresso heterologamente em E. coli BL21 (D3E) e purificado. Por meio de ensaios de cristaliza¸c˜ao, espera-se obter o cristal do complexo LBD-ligante, que por sua vez ser´a submetido `a difra¸c˜ao de raio-X. Os dados da difra¸c˜ao ser˜ao obtidos com o difratˆometro Rigaku Ultra X-18 ou atrav´es da difra¸c˜ao pela luz MX-2 no Laborat´orio Nacional de Luz S´ıncroton. O problema das fases ser´a resolvido atrav´es da t´ecnica de substitui¸c˜ao molecular. O conhecimento dos aspectos estruturais dos complexos PPARg-metotrexato e PPARg-´acido f´olico poder´a guiar estudos na busca de f´armacos mais eficazes e que n˜ao apresentem efeitos indesejados no tratamento de diabetes tipo II.
Palavras-chave: PPAR gama. Diabetes mellitus tipo II. Cristalografia. Referˆencias:
1 DUMASIA, R. et al. Role of PPAR- gamma agonist thiazolidinediones in treatment of pre-diabetic and diabetic individuals: a cardiovascular perspective.. Current Drug Targets,Cardiovascular & Hematological Disorders, v. 5, n. 5, p. 337-386, 2005.
2 BERGER J.; MOLLER, D. E. The mechanisms of action of PPARs. Annual Review of Medicine, 32