BUNEO, R. V.1; MALUF, F. V.1; GUIDO, R. V. C.1
renata.bueno@usp.br
1Instituto de F´ısica de S˜ao Carlos - USP
A escaldadura das folhas, causada pela bact´eria Xanthomonas albilineans, ´e uma das cinco fitopatologias com maior impacto sobre a cultura da cana-de-a¸c´ucar, causando significativa diminui¸c˜ao da produtividade, necessidade de reforma precoce dos canaviais e queda da qualidade do caldo extra´ıdo. (1) A ausˆencia de agentes qu´ımicos ou biol´ogicos para o controle dessa fitopatologia estimula a descoberta e o desenvolvimen- to de mol´eculas bioativas candidatas a novos agroqu´ımicos. Nesse sentido, a bioss´ıntese de folatos ´e uma via metab´olica interessante para o planejamento de novas mol´eculas inibidoras, e a enzima bifuncional N5,N10-metilenotetrahidrofolato desidrogenase ciclohidrolase (FolD) destaca-se como um alvo molecular promissor, uma vez que est´a envolvida na s´ıntese de prote´ınas e DNA. Diante do exposto, o atual projeto de pesquisa visa a elucida¸c˜ao estrutural e a caracteriza¸c˜ao funcional da FolD de X. albilineans (XaFolD) visando o planejamento de inibidores potentes e seletivos da via de bioss´ıntese de folatos. Para tanto, foram conduzidos estudos integrados em biologia molecular estrutural e qu´ımica medicinal. Ap´os a clonagem da sequˆencia codificante de XaFolD e express˜ao heter´ologa, (2) foi estabelecido um protocolo de purifica¸c˜ao composto por etapas sequenciais de cromatografia por afinidade e de exclus˜ao por massa molecular. Para cada litro de express˜ao foram obtidos 60 mg de prote´ına com elevado teor de pureza (> 95%). A triagem de condi¸c˜oes de cristaliza¸c˜ao foi realizada a partir de quatro concentra¸c˜oes de XaFolD (3; 5; 7,5; 10 mg/mL), empregando-se a t´ecnica de difus˜ao de vapor e matriz esparsa. Para a triagem foram utilizados kits comerciais da Hampton Research (Index; Crystal Screen e Crystal Screen Cryo), Qiagen (Classic; Classic II; PEGs; JCSG Core Suite I, II, III e IV) e Molecular Dimensions (Morpheus). As gotas de cristaliza¸c˜ao foram montadas manualmente, com o aux´ılio de micropipetas multicanais. Ap´os a triagem e otimiza¸c˜ao das condi¸c˜oes de cristaliza¸c˜ao, cristais adequados para estudos de difra¸c˜ao de raios X foram obtidos. Ap´os a coleta e o processamento dos dados, a estrutura 3D da XaFolD foi elucidada pelo m´etodo de substitui¸c˜ao molecular `a 2,1 AA de resolu¸c˜ao. Para tanto, foram empregadas diferentes estrat´egias para a recupera¸c˜ao das fases iniciais utilizando como molde a enzima hom´ologa de E. coli. Ao final do processo foi gerado um modelo satisfat´orio, o qual est´a em fase de refinamento para dep´osito no Protein Data Bank. A an´alise estrutural revelou uma prote´ına constitu´ıda por 11 h´elices alfa e 9 fitas beta distribu´ıdas em um dom´ınio N-terminal catal´ıtico e um dom´ınio C-terminal de liga¸c˜ao ao dinucleot´ıdeo. Al´em disso, o delineamento do ensaio cin´etico para a caracteriza¸c˜ao da atividade desidrogenase da XaFolD revelou o valor de KM para o substrato N5,N10-THF (K M = 50 ± 10 µM) e cofator NADP+ (K M = 668 ± 81 µM). Os dados de caracteriza¸c˜ao estrutural e funcional da enzima FolD de X. albilineans ser˜ao explorados para a descoberta e planejamento de inibidores enzim´aticos seletivos e potentes como candidatos a novos agroqu´ımicos para o controle da escaldadura das folhas na cultura da cana-de-a¸c´ucar.
Palavras-chave: Cana-de-a¸c´ucar. Agroqu´ımicos. Escaldadura das folhas.
1 BIRCH, R. G. Xanthomonas albilineans and the antipathogenesis approach to disease control. Molecular Plant Pathology, v. 2, n. 1, p. 1-11, 2001.
2 ASLANIDIS, C.; JONG, P. J. Ligation independent cloning of PCR products. Nucleic Acids Research, v. 18, n. 20, p. 6069-6074, 1990.
PG24
Avalia¸c˜ao da terapia fotodinˆamica e o uso da fluorescˆencia em
um modelo tumoral em membrana corioalant´oica
BUZZA, H. H.1; ZANGIROLAMI, A. C.1; BAGNATO, V. S.1; KURACHI, C.1
hilde.buzza@gmail.com
1Instituto de F´ısica de S˜ao Carlos - USP
A Terapia Fotodinˆamica (PDT, do inglˆes Photodynamic Therapy) ´e um tratamento que vem tendo grandes avan¸cos ao longo dos anos para diversas doen¸cas, incluindo o cˆancer. Ela consiste na intera¸c˜ao entre luz de um comprimento de onda espec´ıfico, uma substˆancia fotossens´ıvel e o oxigˆenio molecular. (1) O fotossensibilizador ´e ativado pela luz, transformando o oxigˆenio da c´elula em oxigˆenio singleto, que ´e citot´oxico e, portanto, leva `a morte celular. (2) Nesse contexto, o uso do modelo de membrana corioalant´oica em ovos de galinha (CAM, do inglˆes Chorioallantoic Membrane) permite acesso direto aos vasos sangu´ıneos, al´em de n˜ao causar nenhum tipo de dor animal. Esse ambiente vascularizado ´e ideal para o entendimento individualizado do efeito fotodinˆamico nos vasos sangu´ıneos. Com o desenvolvimento de um tumor nessa membrana, ´e poss´ıvel visualizar a intera¸c˜ao entre as c´elulas tumorais e a rede vascular, facilitando o entendimento dos mecanismos que envolvem seu crescimento e destrui¸c˜ao. (3) As c´elulas tumorais empregadas para o desenvolvimento desse modelo podem ser de diversas linhagens e variadas formas de aplica¸c˜ao, desde a inje¸c˜ao de culturas celulares `a aplica¸c˜ao de peda¸cos de bi´opsias. Foi escolhido trabalhar com tumor de Erhlich pela facilidade de manuseio laboratorial, variando a aplica¸c˜ao do fotossensibilizador em t´opica e intravenosa. Se o fotossensibilizador possui uma fluorescˆencia diferente das outras estruturas do modelo, ´e poss´ıvel acompanhar, por imagem, sua difus˜ao pelos vasos sangu´ıneos at´e atingir o tumor e, com o uso de microscopia confocal, comprovar a sua localiza¸c˜ao. Para isso, foram usados dois compostos: o ALA, precursor da Protoporfirina IX (PpIX), e o Photogem .R
Imagens por fluorescˆencia foram feitas a cada 30 minutos para o entendimento da farmacodinˆamica dos fotossensibilizadores, ambos com fluorescˆencia vermelha quando excitados com luz azul. As ´areas de interesse na imagem foram selecionadas e submetidas a uma rotina do software Matlab paraR
quantifica¸c˜ao da fluorescˆencia vermelha ao longo do tempo e os valores correspondentes foram plotados e relacionados ao tempo. Com os gr´aficos obtidos, foi determinado o tempo de incuba¸c˜ao em 4 horas para a aplica¸c˜ao t´opica e, ent˜ao, foi aplicada a luz utilizando o laser de diodo em 635 nm com irradiˆancia de 100mW/cm2 durante 10 minutos, totalizando uma dose de 60 J/cm2. Com o uso do ALA, foi poss´ıvel acompanhar a forma¸c˜ao da PpIX nos vasos sangu´ıneos e no tumor, mostrando o ac´umulo preferencial nas c´elulas tumorais. Diferentemente do ALA, o Photogem j´R a ´e a mol´ecula de interesse e, por isso,
´e poss´ıvel acompanhar a sua difus˜ao pelo modelo tumoral e tamb´em ac´umulo nessa regi˜ao. Com a aplica¸c˜ao da PDT, ambos os fotossensibilizadores foram consumidos e houve uma destrui¸c˜ao tanto da malha vascular ao redor quanto do pr´oprio tumor, mostrando grande potencial de tratamento para o cˆancer. Sendo um dos elementos fundamentais para que a PDT aconte¸ca, o entendimento da intera¸c˜ao do fotossensibilizador com as c´elulas e com os vasos sangu´ıneos ´e um dos caminhos para a melhoria direta na aplica¸c˜ao cl´ınica dessa modalidade terapˆeutica.
Palavras-chave: Terapia fotodinˆamica. Membrana corioalant´oica. Modelo tumoral.
1 WILSON, B, C.; PATTERSON, M. S.. The physics, biophysics and technology of photodynamic therapy. Physics in Medicine and Biology, v. 53, n. 9, p. 61-109, 2008. doi: 10.1088/0031-9155/53/9/R01.
2 DOUGHERTY, T. J. et al.. Review: photodynamic therapy. Journal of the National Cancer Institute, v. 90, n. 12, p. 889-905, 1998.
3 STATON, C. A. et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. International Journal of Experimental Pathology, v. 85, n. 5, p. 233-248, 2004.