O aspirado traqueal foi introdu ido por Pecora (1959) primeiramente na medicina humana como m todo de colheita de amostras do trato respirat rio para an lises microbiol gicas e citol gicas. Na Medicina Veterin ria, Beech (1975) foi pioneira na utili a o desta t cnica em equinos.
Hodgson e Hodgson (2003) afirmam que este m todo considerado uma boa alternati a para coleta de material na traqueia. Por ser uma t cnica n o in asi a, ela ainda permite que o cat ter seja guiado e proporciona a inspe o do trato respirat rio na hora da coleta de material podendo ser reali ada a a alia o do grau de hiperemia e conte do luminal (muco, secre es e sangue), dados que podem au iliar na interpreta o dos resultados citol gicos.
Na t cnica de la ado traqueal, um cat ter de polietileno inserido atra s do canal de bi psia do endosc pio e 10 a 30 mL de solu o salina s o instilados. Na regi o caudal da traqueia, anterior carina, forma-se um ac mulo de fluido que pode ent o ser aspirado mais facilmente. Esta t cnica se aplica principalmente para o e ame citol gico (COUETIL & THOMPSON, 2020).
A descrição dos achados de lavados traqueais de animais considerados normais foi realiza primeiramente por Beech (1975). As amostras deste estudo eram compostas predominantemente por células epiteliais colunares ciliadas, apresentando também raros neutrófilos, algumas células mononucleadas e células fagocíticas. A presença de eosinófilos foi baixa ou mesmo ausente em alguns animais. O aspirado de animais com histórico de epistaxe apresentou em sua maioria células epiteliais e macrófagos, alguns com grânulos intracitoplasmáticos de hemossiderina.
O estudo das secre es obtidas do trato respirat rio j em sendo utili ado no Brasil e tem sido considerado de grande alia, j que representa
21 um meio semiol gico importante, ajudando no diagn stico de importantes doen as (MICHELOTTO et al., 2007; PIRES et al., 2017).
A citologia de lavado traqueal (LT) é considerada mais específica do que somente o exame endoscópico, sendo descrita como uma ferramenta no diagnóstico das doenças pulmonares crônicas, em particular a asma branda e infecções por parasitos (CIAN et al., 2015; COUETIL&THOMPSON, 2020).
Em casos de suspeita de HPIE em que o diagnóstico endoscópico é negativo, a citologia torna-se fundamental devido à observação de células características dos processos hemorrágicos como os hemossiderófagos (SILVA et al., 2012; MARZAHL, 2020; LOPEZ et al., 2020).
Apesar do lavado broncoalveolar (LBA) ser o método mais recomendado e utilizado para coleta de material para a avaliação do trato respiratório posterior, especialmente para as doenças inflamatórias, Kusano e colaboradores (2008) afirmaram que realização deste procedimento exige que o animal seja sedado e permaneça em repouso nas 24 a 48 horas subsequentes. No caso de animais atletas em atividade constante, como os utilizados na corrida, esse repouso, muitas vezes, torna-se inviável. Nessas situações, o lavado traqueal deve ser utilizado, uma vez que não há necessidade de repouso após a realização do procedimento.
A escolha entre os dois métodos também está relacionada à enfermidade que é investigada. O lavado traqueal tem representação mais ampla dos pulmões do que o lavado broncoalveolar. Na prática o LT também possui custos mais baixos e a eliminação do risco de exame antidoping positivo por resíduos de sedativo e anestesia local que devem ser utilizados no LBA (ROSSI et al., 2018).
Os valores de referência citológica mais recentes para lavado traqueal descrevem a presença moderada de muco, predominância de macrófagos alveolares (40-80%), número variável de células epiteliais (1-50%), baixo percentual de neutrófilos (˂ 20%), menos de 10% de linfócitos e menos de 1%
de eosinófilos (COUETIL &THOMPSON, 2020).
22 2.4 PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP)
As plaquetas, que tamb m podem ser chamadas de tromb citos, s o hemocomponentes discoides e anucleados, medindo 2,5-4,5 m de di metro, com alor de refer ncia m nimo de 100.000/ L nos equinos (WALTON, 2013).
S o deri adas dos megacari citos e desempenham papel fundamental na hemostasia sangu nea. Normalmente possuem meia ida de 5-9 dias sendo destru das por fagocitose no ba o e por c lulas Kupffer do f gado (OLSZENER et al., 2015) .
Plaquetas e pulm es possuem estreita rela o. Essas c lulas circulam continuamente atra s dos asos pulmonares e s o importantes agentes nos processos de hemostase e inflama o, contribuindo tamb m para o reparo
ascular pulmonar (WEYRICH et al., 2013).
A ati idade hemost tica das plaquetas particularmente importante na circula o bronquial, agindo na manuten o da integridade dos asos e em seu remodelamento (HO-TIN-NOE et at., 2011).
O Plasma Rico em Plaquetas (PRP) é uma fonte autógena de fatores de crescimento, obtida pelo sequestro e concentração de plaquetas através de centrifugação. A centrifugação visa à produção de alta concentração plaquetária em pequeno volume de plasma. É uma técnica vantajosa no sentido do material ser oriundo do próprio paciente, tornando-se livre de toxicidade e incapaz de gerar imunorreação (GARCIA et al., 2005).
Este hemocomponente é capaz de liberar, conhecidamente, centenas de fatores de crescimento (FC). A liberação desses fatores acelera o processo de reepitelização, angiogênese, mitose celular, síntese de colágeno além de estimular quimiotaxia dos neutrófilos, macrófagos e deposição de fibroblastos (DEROSSI et al., 2009; VENDRAMIN et al., 2009).
A função dos FC não é somente a de estimular a proliferação celular mediante a regulação do ciclo celular, iniciando a mitose, mas também a de manter a sobrevivência celular, estimular a migração celular, a diferenciação celular e a apoptose. Os FC também atuam como ligantes que se conectam a
23 receptores específicos, liberando sinais para as células-alvo que promovem a transcrição de genes. Alguns dos mais importantes são fator de crescimento epitelial (FCE), fator transformador de crescimento- (TGF- ), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e fator transformador de crescimento- (TGF- ) (OLSZENER et al., 2015).
Delong et al. (2012) descrevem que para a obtenção de PRP existem dois métodos, podendo ser com uma ou duas centrifugações consecutivas.
Outros autores relatam que a técnica utilizando a dupla centrifugação fornece um PRP com três a oito vezes o número de plaquetas iniciais, enquanto o método utilizando uma centrifugação promove um PRP com apenas o dobro ou triplo da concentração plaquetária inicial (VENDRAMIN et al., 2009; MIRANDA et al., 2019).
Segundo Marques et al. (2014) a separação das plaquetas e hemácias, através da centrifugação deve ser precisa, permitindo que o plasma possua terapêutico do PRP (PEREIRA FILHO et al., 2004; VENDRAMIN et al., 2006).
Existem divergências a respeito da presença de leucócitos no PRP.
Segundo Nagata et al. (2010) a presença de tais células seria deletéria em aplicações intra-articulares, pois poderia haver a liberação dos fatores de crescimento de forma prematura devido à presença das proteases e do oxigênio. Por outro lado, outros autores defendem os efeitos benéficos dos leucócitos, sendo estes fontes de citocinas e enzimas que poderiam agir na prevenção de infecção, além de atuar na liberação de fatores de crescimento pelas plaquetas e na síntese do Fator de Crescimento Derivado das Plaquetas (FCDP) e de Fator de Crescimento Endotelial Vascular (FCEV) (ZIMMERMANN et al., 2003; FONTENOT et al., 2012).
24 É considerado PRP o concentrado final de plaquetas que consiga, no mínimo, triplicar o seu valor inicial através de contagem direta, porém Marx et al. (1998) relatam que quando estas plaquetas foram analisadas em esfregaços de sangue (contagem indireta), o PRP pode aumentar em 900% sobre o número da contagem inicial de plaquetas
A aplicação do PRP na medicina veterinária apresenta diversos estudos com resultados positivos (ANITUA et al., 2004; WU et al., 2011), entretanto, sua utilização em enfermidades respiratórias ainda é muito incipiente, apesar disso, há indícios apontando que a aplicação intrabronquial do PRP traria benefícios ao tratamento da asma branda (DZYEKANSKI et al., 2012).
2.4.1 Obtenção do PRP
No passado o PRP era obtido através de máquinas de plasmaforese e o material obtido era ativado através da trombina bovina. A necessidade de melhorar o custo-benefício para a utilização do PRP inspirou o desenvolvimento de protocolos e o uso de centrífugas comuns para sua obtenção (VENDRAMIN et al., 2006).
Miranda e colaboradores (2019) afirmam que a coleta de sangue para contagem de plaquetas com finalidade de produção do PRP deve ser realizada com o anticoagulante Citrato de Sódio, preferencialmente em tubos a vácuo, pois coletas com seringas podem levar à ativação plaquetária devido à velocidade de aspiração acima de 60mL/minuto, acarretando um PRP final menos concentrado.
O PRP pode ser obtido através de várias técnicas, porém sempre parte da premissa da centrifugação de sangue total fresco, por meio de um gradiente de densidade que precipita os eritrócitos na parte inferior, na porção intermediária permanece o PRP, enquanto o plasma pobre em plaquetas (PPP) concentra-se na parte superior do tubo (NIXON et al., 2010).
Deve-se considerar elementos de extrema importância para a produção do PRP o (g) = força de centrifugação, tamanho do raio da centrífuga, (T) = o tempo de centrifugação e a quantidade de volume plasmático reduzido, sendo o produto final submetido à contagem de plaquetas, devendo-se obter, pelo
25 menos, o triplo da contagem inicial. Miranda e colaboradores (2019) ressaltam que o tempo de descanso do sangue por 2h a partir de sua coleta contribui para a obtenção de um PRP mais concentrado.
Para a obtenção de PRP pode-se aplicar metodologias com uma ou duas centrifugações consecutivas, sendo que a maior parte dos autores aponta para a dupla centrifugação (VENDRAMIN et al., 2006; VENDRAMIN et al.,2009; DEROSSI et al., 2009, VENDRUSCOLO et al., 2012). A primeira centrifugação tem o objetivo de separar as células vermelhas (7 m de diâmetro) e brancas (7-15 m de di metro) das plaquetas (2 m de di metro), devido à diferença de densidade. Na segunda centrifugação ocorre a concentração das plaquetas, produzindo o PRP e o plasma pobre em plaquetas (PPP) (FOSTER et al., 2009).
Não há um protocolo padrão para o preparo de PRP equino e a literatura não apresenta consenso quanto a um método que produza maior quantidade final de plaquetas ou de fatores de crescimento, nesse sentido vários autores apresentam diferentes protocolos, sendo que alguns sugerem que a concentração de trombócitos deva variar de 800 a 1200 x 109 plaquetas/L, enquanto outros consideram que 1000 x 109 plaquetas/L pode representar a concentração terapêutica de PRP (WEIBRICH et al., 2004; MARX et al., 2004;
VENDRUSCOLO et al., 2012).
26 3. MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal Fluminense sob o número de processo 5534070918 (ID 000327).