Citometria de fluxo

4.2.4.1.Viabilidade Celular

Com o objetivo de escolher os melhores tempos de tratamento e as concentrações das amostras para a realização dos testes de avaliação da exposição de resíduos de fosfatidilserina pela Anexina-V e do ciclo celular, foi feito uma curva de viabilidade celular.

As linhagens MCF-7 (d.i.: 5 x 105) e MCF-7 BUS (d.i.: 4 x 104 células/mL) foram inoculadas em placas de 96 compartimentos (100 μL/compartimento) e incubadas por 24 horas em estufa a 37oC, em atmosfera úmida com 5% de CO2. Em seguida, as células foram

tratadas com cinco concentrações das frações FBCD 8 (Resultado no Anexo II), FB1c (9, 18, 32, 75 e 150 μg/mL) e da fração FFINAL (1; 1,5; 2; 2,5 e 5 μg/mL) e incubadas por 3, 6, 9, 12,

15 e 24 horas, sendo as células de uma placa (denominada placa T1) de cada tempo experimental fixada com ácido tricloroacético (TCA) 50% (p/v), no tempo correspondente. Após a fixação, as células foram coradas com Sulforrodamina B, sendo a viabilidade celular determinada por quantificação do conteúdo protéico utilizando-se espectrofotômetro a 540 nm.

Considerando as medidas das absorbâncias das células tratadas (T), das células sem tratamento (T1), das células no tempo zero (T0) e do branco da amostra (B), a viabilidade celular foi calculada a partir da seguinte equação: 100 x (T1/T0) para a viabilidade celular do grupo de células, e ((T – Média de B)/T1) x 100 para a viabilidade das células tratadas com as amostras. Os dados foram então plotados em um gráfico correlacionando a viabilidade celular em função da concentração de amostra para cada um dos tempos de tratamento.

4.2.4.2. Avaliação de morte celular

Os estudos relacionados à morte celular foram realizados por citômetro de fluxo Guava EasyCiteTM Mini System Millipore®, por meio do kit de Anexina V (Guava Nexin® Reagent, Merck/Millipore 4500-0450) para determinação de exposição de resíduos de fosfatidilserina (Anexina-V-PE) e permeabilização da membrana celular (7-amino- actinomicina D, 7-AAD).

A suspensão celular (linhagem MCF-7 BUS, na densidade de 2 x 105 células/mL) foi inoculada em placas de seis poços (2 mL/compartimento) e incubada por 24 horas em estufa, a 37 ºC, atmosfera úmida e 5% CO2. Após este período, o meio de cultura foi

cuidadosamente aspirado, os compartimentos lavados com PBS (pH 7,0) e aspirados para serem tratados com a fração FFINAL (2.5, 5, 10 e 15 μg/mL; 2 mL/compartimento) e com a

fração FB1c (5,0 e 10,0 μg/mL; 2 mL/compartimento).

As leituras em citômetro de fluxo foram realizadas em dois tempos, a saber, 6 horas (tratamento com as concentrações de 2,5 e 5 μg/mL da fração FFINAL) e 24 horas

(tratamento com as concentrações de 2,5; 5,0; 10,0 e 15,0 μg/mL da fração FFINAL e 5,0 e 10,0

Após cada tempo de tratamento, o meio de cultura de cada compartimento foi coletado e transferido para um tubo de centrífuga de 15 mL. Os compartimentos foram lavados com PBS (500 μL/compartimento), sendo o lavado reunido ao meio reservado. As células aderidas foram então desprendidas com 500 μL/compartimento de tripsina (0,25% em EDTA), posteriormente inibida com 1000 μL de meio completo. Esta suspensão também foi recolhida e reunida ao meio anteriormente reservado. Em seguida, os tubos foram levados à centrífuga por 5 minutos a 2500 rpm. O sobrenadante foi descartado e o pellet celular foi ressuspenso em 100 μL de meio completo, transferido para microtubo de 1,5 mL e acrescido de 100 μL do reagente Guava Nexin® _{Reagent (Merck Millipore 4500 – 0450, EUA). Os}

tubos, contendo as suspensões celulares mais o reagente, foram incubados por 20 minutos, à temperatura ambiente, protegidos da luz e foram analisados (2000 eventos adquiridos) em citômetro de fluxo com comprimento de onda de excitação de 488 nm (laser de argônio) e a detecção de fluorescência foi realizada na faixa de comprimento de onda de 525-575 nm para PE e 650-670 nm para 7-AAD. Os resultados obtidos foram expressos em gráficos e interpretados de acordo com a marcação das células pelos reagentes do kit.

4.2.4.3. Análise dos Resultados

A análise de resultados, em que cada amostra foi testada em triplicata, foi realizada através do Software Guava Nexin®, sendo os resultados expressos como média ± erro padrão das quatro subpopulações avaliadas:

• Anexina-PE (-) 7-AAD (-) → células viáveis (sem exposição de resíduos de fosfatidilserina nem alterações na integridade da membrana);

• Anexina-PE (+) 7-AAD (-) → células com exposição de resíduos de fosfatidilserina (marcados por anexina V-PE), no início do processo de morte celular programada com manutenção da integridade de membrana;

• Anexina-PE (+) 7-AAD (+) → células duplamente marcadas (exposição de resíduos de fosfatidilserina e perda de integridade de membrana plasmática), em estágio tardio de morte celular programada ou de necrose;

• Anexina-PE (-) 7-AAD (+) → células não viáveis, com perda de integridade de membrana plasmática (marcadas por 7-AAD) sem exposição de resíduos de fosfatidilserina, em necrose.

4.2.4.4. Avaliação de ciclo celular

Os estudos relacionados à quantificação de células em fases do ciclo celular foram realizados por citômetro de fluxo FACS Canto II BD Bioscienses®, do Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida (LaCTAD) da Unicamp, por meio do kit Guava® Cell Cycle Reagent (Merck/Millipore 4500-0220). Este teste é baseado na diferenciação das células nos diversos estágios do ciclo celular pela marcação do DNA com iodeto de propídio (PI).

Neste experimento, foram utilizadas diferentes densidades de inóculo das células MCF7 BUS de acordo com os tempos de tratamento: 6 x 104 _{células/mL para o tempo de 24h}

e de 30h e 4x104 _{células/mL, para o tempo de 48h. A suspensão celular foi distribuída em}

placas de 12 compartimentos (1 mL/compartimento). Após 24 horas de incubação a 37 ºC em atmosfera úmida com 5% de CO2, o meio foi aspirado e substituído por 1mL de meio RPMI

1640 sem SFB e com 1% de penicilina/estreptomicina para o carenciamento, ou seja, a sincronização das células para a fase inicial do ciclo celular (G0). Após 24 horas de sincronização (a 37 ºC em atmosfera úmida com 5% de CO2), as células foram tratadas com a

fração FFINAL nas concentrações de 2,5 e 5,0 μg/mL em duplicata. Como controle positivo foi

utilizado o quimioterápico colchicina (0,25 μM) que promove parada do ciclo celular na fase G2/M.

Após os tempos de tratamento (24, 30 e 48 horas), o sobrenadante de cada compartimento foi coletado e transferido para tubo de centrífuga de 15 mL. Os compartimentos foram lavados com 500 μL/compartimento de PBS, o conteúdo coletado e reunido com o meio reservado previamente e as células aderidas foram desprendidas com auxílio de 500 μL/compartimento de tripsina/EDTA (0,25%). Para inibir a ação da tripsina, adicionou-se 1000μL de meio em cada compartimento. Novamente o conteúdo foi coletado, reunido com o meio reservado previamente em tubo de centrífuga e centrifugado por 5 minutos à 2500 rpm e 4°C. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o pellet celular ressuspenso em 500μL de PBS para nova centrifugação nas mesmas condições anteriores.

O sobrenadante foi aspirado de forma a deixar 100μL de PBS restante no tubo, o qual foi utilizado para ressuspender o precipitado de células. Cuidadosamente, essa suspensão celular foi transferida para um microtubo contendo 500 μL de etanol 70% gelado. O microtubo foi homogeneizado e mantido a 4 °C por, no mínimo, 12 horas antes do procedimento de marcação.

Após este período, os microtubos foram centrifugados por 5 minutos a 2500 rpm. O sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido em 500 μL de PBS e centrifugado novamente, a fim de se retirar todo o etanol. O precipitado celular foi resuspendido em 200 μL do reagente Guava® Cell cycle (Merck/Millipore 4500-0220) e os microtubos incubados por 30 minutos, a temperatura ambiente e protegidos da luz.

Em seguida, as amostras foram analisadas em citômetro de fluxo (5000 eventos adquiridos) com excitação por laser de argônio a 488nm e detecção de fluorescência a 650- 670nm.

4.2.4.5. Análise dos Resultados

Utilizando o software Guava Cell cycle®, foi realizada a quantificação (%) das subpopulações de células nas fases G1, S e G2/M do ciclo celular. Os dados obtidos foram de dois experimentos independentes em que cada amostra foi testada em triplicata fornecendo como resultado final a média ± erro padrão.

4.3. ESTUDOS FARMACOLOGICOS IN VIVO