LARISSA SHIOZAWA TURRI
Atividades anticâncer e antiestrogênica de extratos e
frações das folhas da Psidium guajava L.
PIRACICABA 2018
Atividades anticâncer e antiestrogênica de extratos e
frações das folhas da Psidium guajava L.
Orientador: Prof. Dr. João Ernesto de Carvalho Coorientadores: Profa. Dra. Mary Ann Foglio
Profa. Dra. Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz
Piracicaba 2018
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Odontologia, na Área de Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA LARISSA SHIOZAWA TURRI E ORIENTADA
PELO PROF. DR. JOÃO ERNESTO DE
Faculdade de Odontologia de Piracicaba
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Tese de Doutorado, em sessão pública realizada em 22 de Fevereiro de 2018, considerou a candidata LARISSA SHIOZAWA TURRI aprovada.
PROF. DR. JOÃO ERNESTO DE CARVALHO
PROFª. DRª. GIOVANNA BARBARINI LONGATO
PROFª. DRª. MARIA JOSÉ QUEIROZ DE FREITAS ALVES
PROFª. DRª. CARMEN SILVIA PASSOS LIMA
PROFª. DRª. FERNANDA KLEIN MARCONDES
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico este trabalho com todo meu amor e gratidão aos meus pais, Antonio e Tazuko (in memorian), por tudo que fizeram por mim ao longo da minha vida e por fazer dos meus sonhos os seus.
Aos meus grandes amores Diego, Massami e Simone pelo apoio e carinho em todos os momentos.
Primeiramente, agradeço a Deus, que é a minha força, que me guia em todos os meus caminhos e me possibilita a melhor esperança da vida.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas (FOP/UNICAMP), ao Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA/UNICAMP) e ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, pela estrutura e oportunidade de realização deste trabalho.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão da bolsa de Doutorado (Processo nº 2014/01283-9) e suporte financeiro.
Aos meus amados pais, Antonio e Tazuko (in memorian) por todo o amor, conhecimento e incentivo que me deram todos estes anos.
À minha irmã Simone, pelo companheirismo, paciência e por ser minha melhor amiga. Ao meu grande amor, Diego Enrico pela confiança em mim depositada, pelo amor, por todos os bons momentos que me proporcionou e por ser o meu companheiro da vida.
Aos meus sogros, Eloisa e Mauricio, pelo carinho e por serem tão amáveis comigo. Aos meus amigos Riomar e Aurila, pelo incentivo e por nos mostrar o caminho que devemos seguir.
Ao meu orientador João Ernesto, pela orientação, paciência e confiança em meu trabalho. Às minhas queridas co-orientadoras Mary Ann e Ana Lúcia, pelos ensinamentos, atenção e amizade.
Aos membros da minha banca de qualificação: Beto, Ana Paula e Priscila, pelas valiosas contribuições e pela amizade! Muito obrigada!
Aos meus queridos amigos de laboratório, que foram a minha família nos últimos cinco anos: Gi Fioritto, Gi Longato, Dri, Thais, Yumi, Paula P, Paula M, Lucia, Thais, Debs, Mari, Mi, Van, Fabi, Rafa, Erica e Tamires. E aos amigos da DQPN: Ilzetinha, Laís, Vê, Elaine, Nubia, Ícaro, Naty, Leila G, Leila Servat, Paty, Rosana e Rogério, por toda ajuda e companhia nos longos dias na fitoquímica!
À melhor técnica da Divisão de Toxicologia e Farmacologia, Sirlene, pelos ensinamentos, colaboração, paciência e amizade durante todos estes anos.
Aos professores que aceitaram o convite de serem membros da minha banca de Doutorado, meus sinceros agradecimentos!
Atualmente cerca de 75% das drogas anticâncer são derivadas de produtos naturais, demonstrando o grande potencial destes produtos na pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento desse conjunto de doenças. Estudos anteriores, realizados no Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA - Unicamp), revelaram que os extratos e os princípios ativos obtidos da Psidium guajava L. apresentam potencial ação anticâncer tanto em cultura de células tumorais humanas quanto em modelos experimentais com animais de laboratório. O tratamento com a fração enriquecida com os princípios ativos (Guajadial e Psidial A) da espécie, por via intraperitoneal, resultou na inibição do crescimento dos tumores sólidos de Ehrlich em todas as doses utilizadas (10, 30 e 50 mg/kg). O aumento significativo do peso e do tamanho dos úteros dos animais tratados com a fração sugeriu uma possível ação hormonal dos princípios ativos, que foi então avaliada utilizando a técnica de docking molecular in silico. Tanto o
Guajadial quanto o Psidial A apresentaram afinidade significativa a ambas as isoformas dos
receptores de estrógeno (ER-α e ER-β), indicando, portanto, possível ação sobre os receptores hormonais. Neste contexto, este trabalho avaliou, tanto in vitro quanto in vivo, a atividade antiproliferativa e ação estrogênica/antiestrogênica do extrato bruto e frações obtidos a partir das folhas de P. guajava L.. Por meio de diversas técnicas cromatográficas, foram obtidas frações ativas das quais, as frações FB1c e FFINAL apresentaram atividade antiproliferativa in
vitro, com seletividade para as linhagens tumorais humanas MCF-7 e MCF-7 BUS (TGI =
5,59 e 2,27 μg/mL, respectivamente), sugerindo desta forma, uma possível correlação entre a atividade antiproliferativa e ação hormonal. Esta correlação foi confirmada tanto nos testes de
E-screen quanto nos testes in vivo que avaliam atividade uterotrófica, nos quais a fração
FFINAL foi capaz de bloquear o efeito proliferativo do estradiol nas células MCF-7 BUS e no
útero de ratas pré-púberes. Os modelos in vivo de tumor sólido de Ehrlich e Hollow fiber, empregando-se a via oral como rota de tratamento, confirmaram a atividade anticâncer das frações de P. guajava evidenciada através da atividade antiproliferativa in vitro. Os testes que avaliam os mecanismos de morte celular, por meio da citometria de fluxo, revelaram que as frações FB1c (5 e 10 μg/mL) e a FFINAL (2,5 μg/mL), após 24 horas de tratamento, foram
capazes de induzir a externalização dos resíduos de fosfatidilserina nas membranas citoplasmáticas das células MCF-7 e MCF-7 BUS, sugerindo desta forma, uma morte por meio do processo de apoptose. Comparativamente à ação do tamoxifeno sobre o ciclo celular, o tratamento com a fração FFINAL sobre as células MCF-7 BUS provocou a parada do ciclo
carcinogênese induzida quimicamente pelo composto 1- metil,1-nitrosoureia (MNU) porque este modelo apresentou uma baixa taxa de indução de tumores de mama após 120 dias da administração do carcinógeno.
Palavras-chave: Psidium guajava L. Câncer. Atividade antiproliferativa in vitro. Atividade estrogênica/antiestrogênica.
Currently around 75% of anticancer drugs are derived from natural products, showing the great potential of these products in new drug research and development for the treatment of this set of diseases. Previous studies carried out at the Center for Chemical, Biological and Agricultural Research (CPQBA - Unicamp) revealed that extracts and active ingredients obtained from Psidium guajava L. show potential anticancer action both in human tumor cell culture and in experimental models with laboratory animals. Intraperitoneal treatment with the enriched fraction (Guajadial and Psidial A) of the species resulted in inhibition of the growth of Ehrlich solid tumors at all doses (10, 30 and 50 mg/kg). The significant increase in the weight and size of the uteri of the animals treated with the fraction suggested a possible hormonal action of the active principles, which was then evaluated using the in silico molecular docking technique. Both Guajadial and Psidial A showed significant affinity for both isoforms of estrogen receptors (ER-α and ER-β), thus indicating a possible action on hormone receptors. In this context, this work evaluated, both in vitro and in vivo, the antiproliferative activity and estrogenic/antiestrogenic action of the crude extract and fractions obtained from P. guajava L. leaves. By chromatographic techniques fractions were obtained, some active ones including FB1c and FFINAL that showed antiproliferative activity in vitro
with selectivity for human tumor cell lines MCF-7 and MCF-7 BUS (TGI = 5, 59 and 2.27 mg / mL, respectively), thus demonstrating a possible correlation between the antiproliferative activity and hormone action. This correlation was confirmed in both the E-screen tests for in
vivo tests that assess uterotrophic activity, which found that the FFINAL was able to block the
proliferative effect of estradiol on the MCF-7 cells BUS and uterus rats pre-pubescent. The anticancer activity was confirmed by in vivo Ehrlich´s solid tumor model and by Hollow fiber assay, after oral treatment. The tests that evaluate the mechanisms of cell death, by flow cytometry showed that fractions FB1c (5 and 10 ug / ml) and FFINAL (2.5 ug / ml) after 24
hours of treatment, were able to induce externalization of phosphatidylserine residues in the cytoplasmic membranes of MCF-7 and MCF-7 cells BUS, suggesting, therefore, death by apoptosis. Compared to the action of tamoxifen on the cell cycle, treatment with FFINAL of
MCF-7 BUS cells caused cell cycle arrest in the G1 phase of the cycle, at all time periods evaluated (24, 30 and 48 hours). Finally, the test chemical carcinogenesis induced by compound 1-methyl-1-nitrosourea (MNU), demonstrated that the induction of breast tumors was not effective with low index tumors 120 days after carcinogen administration.
Figura 1 Hallmarks do câncer. Adaptado de Hanahan & Weinberg, 2011 26
Figura 2 Estruturas químicas do Guajadial (A) e Psidial A (B) e 17beta Estradiol
(C)
37
Figura 3 Fluxograma do processo de obtenção do extrato bruto diclorometânico
(EBD) e extrato bruto etanólico (EBE)
40
Figura 4 Fluxograma do processo de fracionamento e limpeza do EBD da Psidium
guajava
41
Figura 5 Esquema de coluna cromatográfica reversa C18 (condicionamento da
coluna, eluição da amostra e lavagem do cartucho)
44
Figura 6 Representação gráfica da distribuição das amostras na microplaca de 96
compartimentos utilizada no teste de atividade antiproliferativa.
47
Figura 7 Esquema de tratamento do E-screen 50
Figura 8 Representação do teste E-screen que avalia tanto a atividade estrogênica
quanto anti-estrogênica de compostos
50
Figura 9 Esquema de tratamento do tumor sólido de Ehrlich na pata 57
Figura 10 Esquema de tratamento do tumor sólido de Ehrlich no flanco 57
Figura 11 Preparo das fibras de Hollow fiber antes do inóculo dos animais 59
Figura 12 Gráfico da atividade antiproliferativa in vitro da Doxorrubicina (A), EBD
(B) e EBE (C).
64
Figura 13 Cromatofolha de CCD das frações obtidas a partir do processo de
fracionamento (Coluna Filtrante) da EBD.
66
Figura 14 A e B: Cromatofolha de CCD das frações obtidas a partir do processo de
fracionamento (Coluna Filtrante) da EBD
67
Figura 15 Gráfico da atividade antiproliferativa in vitro da fração FB1c 68
Figura 16 Cromatofolha de CCD das frações com atividades mais promissoras in
vitro
69
Figura 17 Cromatofolhas de CCD das frações obtidas após fracionamento em coluna
de fase reversa (C18)
71
Figura 18 Gráfico da atividade antiproliferativa in vitro das frações FB1c e Fa2 em
linhagens tumorais e não-tumoral
72
Figura 19 Cromatograma obtido por CG-EM da fração Fa2 74
Figura 20 Fragmentogramas do composto Guajadial (YANG et al., 2007) e do
composto com tempo de retenção de 46 minutos da fração Fa2
75
Figura 23 Influência da fração FFINAL sobre o crescimento da linhagem MCF-7 BUS, na presença e ausência do 17-ß estradiol (E2, 10-9M)
79
Figura 24 Curva de viabilidade da linhagem MCF-7 BUS em função da
concentração e do tempo de exposição à fração FB1c
80
Figura 25 Curva de viabilidade da linhagem MCF-7 frente ao tratamento com a
fração FFINAL
81
Figura 26 Subpopulações (%) de células MCF7 diferenciadas com anexina V-PE e
7AAD após 24 horas de tratamento com a fração FB1c
82
Figura 27 Subpopulações (%) de células MCF7 diferenciadas com anexina V-PE e
7AAD após 6 horas de tratamento com a fração FFINAL
83
Figura 28 Subpopulação (%) de células MCF7 BUS viáveis, diferenciadas com
anexina V-PE e 7AAD, após 24 horas de tratamento com a fração FFINAL nas concentrações de 2,5; 5,0; 10 e 15 µg/mL
84
Figura 29 Subpopulações (%) de células MCF7 BUS, diferenciadas com anexina
V-PE e 7AAD, após 24 horas de tratamento com a fração FFINAL nas concentrações de 2,5; 5,0; 10 e 15 µg/mL.
85
Figura 30 Influência de colchicina e fração FFINAL e colchicina sobre as fases do
ciclo celular da linhagem MCF-7 BUS após 24 horas de tratamento
86
Figura 31 Influência de colchicina e fração FFINAL sobre as fases do ciclo celular da
linhagem MCF-7 BUS após 48 horas de tratamento.
87
Figura 32 Evolução do peso corporal dos animais tratados com o EBD das folhas de
Psidium guajava L durante o teste de toxicidade oral aguda
88
Figura 33 Evolução do peso corporal dos animais tratados com a fração FB1c das
folhas de Psidium guajava L durante o teste de toxicidade oral aguda
89
Figura 34 Evolução do peso corporal dos animais tratados com a fração FFINAL das
folhas de Psidium guajava L durante o teste de toxicidade oral aguda
90
Figura 35 Variação do peso corporal dos animais durante o experimento de tumor
sólido de Ehrlich na pata – EBD
91
Figura 36 Progressão do volume do tumor sólido de Ehrlich na pata – EBD. 92
Figura 37 Pata direita com início de ulceração decorrente do crescimento agressivo
do tumor nos últimos dias de tratamento
93
Figura 38 Gráfico do peso relativo do tumor sólido de Ehrlich na pata – EBD e
Inibição tumoral (%) ao final do experimento
93
Ehrlich no flanco – Fração FB1c
Figura 41 Peso relativo tumoral e Inibição tumoral (%) ao final do experimento de
tumor sólido de Erhlich no flanco – Fração FB1c
96
Figura 42 Peso de úteros e ovários retirados ao final do experimento de Tumor
sólido de Erhlich no flanco – Fração FB1c
97
Figura 43 Peso relativo do tumor sólido de Ehrlich no flanco – fração FFINAL 98
Figura 44 Variação do peso corporal dos animais no experimento de tumor sólido de
Ehrlich no flanco – fração FFINAL
99
Figura 45 Hemograma do sangue total dos animais do experimento de tumor sólido
de Ehrlich no flanco – fração FFINAL
100
Figura 46 Percentual de área necrótica dos tumores sólidos de Ehrlich no flanco em
função dos tratamentos
101
Figura 47 Fotomicrografia mostrando visão geral do tumor sólido de Ehrlich,
apresentando intensa área de necrose ao centro envolvida por células neoplásicas pleomórfica
102
Figura 48 Fotomicrografia mostrando detalhes do tumor sólido de Ehrlich 103
Figura 49 Peso relativo dos órgãos no modelo de tumor sólido de Ehrlich no flanco –
fração FFINAL.
103
Figura 50 Proliferação das células MCF7 em fibras Hollow fiber implantadas no
peritônio de camundongos em função dos tratamentos
106
Figura 51 Variação do peso corporal dos animais ao longo do experimento Hollow
fiber - fração FFINAL
107
Figura 52 Peso relativo do útero de ratas Wistar pré-púberes em função do
tratamento com a fração FB1c e 17-β-estradiol
108
Figura 53 Fotos representativas dos úteros de ratas pré-puberes após três dias de
tratamento com 17β – estradiol (A) e com veículo (B)
109
Figura 54 Peso relativo dos ovários de ratas Wistar pré-púberes em função do
tratamento com a fração FB1c e 17β-estradiol
109
Figura 55 Peso relativo do útero de ratas Wistar pré-púberes em função do
tratamento com a fração FFINAL em associação ao 17-β-estradiol
110
Figura 56 Peso relativo dos ovários de ratas Wistar pré-púberes em função do
tratamento com a fração FFINAL em associação ao 17-β-estradiol
111
Figura 59 Fotomicrografia representativa do Adenocarcinoma mamário adenóide 115
Figura 60 Fotomicrografia representativa do Adenocarcinoma mamário papilar 116
Figura 61 Fotomicrografia representativa do Adenocarcinoma mamário sólido 116
Figura 62 Peso relativo dos órgãos em função do tratamento no modelo de
carcinogênese mamária induzida por MNU em ratas
117
Figura 63 Parâmetros hematológicos em função do tratamento no modelo de
carcinogênese mamária induzida por MNU em ratas
Tabela 1 Relação de gradiente da fase móvel utilizada no fracionamento por cromatografia líquida de adsorção do EBD da Psidium guajava L.
42
Tabela 2 Relação de gradiente da fase móvel utilizada no fracionamento por
cromatografia líquida de adsorção da fração FATIVA
43
Tabela 3 Linhagens celulares tumorais e não tumorais utilizadas nos ensaios de
atividade antiproliferativa in vitro e suas densidades de inoculação (d.i.)
45
Tabela 4 Linhagens celulares tumorais e não tumorais de mama utilizadas nos
ensaios de atividade antiproliferativa in vitro e suas densidades de inoculação (d.i.)
49
Tabela 5 Valores referentes ao teor de umidade das folhas de P. guajava 63
Tabela 6 Valores referentes ao rendimento m/m, dos processos de extração com
os solventes Diclorometano e Etanol
63
Tabela 7 Concentração (em μg/mL) necessária para inibir totalmente o
crescimento celular (TGI, do inglês, Total Growth Inhibition) após o 48h de tratamento com EBD e EBE da Psidium guajava frente a linhagens tumorais e não-tumoral
65
Tabela 8 Concentração (em μg/mL) necessária para inibir totalmente o
crescimento celular (TGI) após o tratamento com a fração FB1c frente a linhagens tumorais e não-tumoral
68
Tabela 9 Valores de TGI em µg/mL (Total Growth Inhibition) das frações
FFINAL, FATIVA e Doxorrubicina
73
Tabela 10 Porcentagens relativas dos compostos da fração FFINAL 74
Tabela 11 Valores de TGI em µg/mL (Total Growth Inhibition) do extrato bruto
(EBD) e da fração FFINAL
77
Tabela 12 Incidência de tumores por grupo no modelo de carcinogênese mamária
induzida por MNU em ratas
112
Tabela 13 Classificação histopatológica e distribuição por grupo dos tumores
mamários retirados no modelo de carcinogênese mamária induzida por MNU em ratas
786-0: Linhagem celular humana de adenocarcinoma de rim 7-AAD: 7-Aminoactinomicina D
α: Alfa β: Beta
AMB & ANS: Agência Nacional de Saúde Suplementar & Associação Médica Brasileira ANOVA: Analysis of Variance
C18: Coluna Cromatográfica Reversa CCD: Cromatografia em camada delgada
CEMIB: Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório
CEUA: Comitê de ética em experimentação animal CGA: Campos de grande aumento
CH2Cl2: Diclorometano
CG-EM: Cromatografia gasosa acoplada a detector seletivo de massas
CGen/MMA: Conselho de Gestão de Patrimônio Genético / Ministério do Meio Ambiente CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CO2: Dióxido de Carbono
COBEA: Código Brasileiro de Experimentação Animal COX: Enzima Ciclooxigenase
COX-2: Enzima Ciclooxigenase do tipo 2 induzível CPMA: Coleção de plantas medicinais e aromáticas
CPQBA: Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas d.i.: Densidade de inoculação
DFT: Divisão de Farmacologia e Toxicologia DMSO: Dimetilsulfóxido
DNA: Ácido desoxirribonucléico Doxo: Doxorrubicina
E1: Estrona
E2: 17β - Estradiol
E3: Estriol
EBD: Extrato bruto diclorometânico EBE: Extrato bruto etanólico
ER: Receptor de estradiol EtOH: Etanol 95%
Exp1: Experimento 1 Exp2: Experimento 2
FAPESP: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo FE: Fase estacionária
FM: Fase móvel
FOP: Faculdade de Odontologia de Piracicaba FSH: Hormônio folículo-estimulante
HaCat: Linhagem celular de queratinócitos normais humanos Hbg: Hemoglobina
HER-2: Receptor de fator de crescimento epidermal 2 HRESI-MS: Espectrometria de massas com alta resolução HT-29: Linhagem celular de adencarcinoma colorretal HTS: High Trroughput Screening
iNOS: Óxido Nítrico Sintase
INCA: Instituto Nacional do Câncer “José Alencar Gomes da Silva” ION: Institute of Medicine
i.p.: intraperitoneal
Kasumi-1: Células de leucemia
KB: Células de câncer epidermal de boca L929sA: Fibrosarcoma murino
LaCTAD: Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida LH: Hormônio luteinizante
LNCaP: Adenocarcinoma de próstata humano andrógeno-sensível m/m: massa/massa
MCF 10 A: Linhagem celular humana não tumoral de mama MCF7: Linhagem celular humana de adenocarcinoma de mama
MCF7 BUS: Linhagem celular humana de adenocarcinoma de mama (superexpressa ER) MDA-MB-231: Linhagem celular humana de adenocarcinoma de mama triplo negativa MNU: Carcinógeno N-Metil-N-Nitrosuréia
NCI-ADR/RES – Linhagem celular humana de adenocarcinoma de ovário resistente a múltiplas drogas
NCI-H460 – Linhagem celular humana de adenocarcinoma de pulmão tipo não pequenas células
NT: Não testado
OMS: Organização Mundial da Saúde
OVCAR-3: Linhagem celular humana de adenocarcinoma de ovário P388: Leucemia murina
p/v: peso/volume
PBS: Tampão fosfato salina
PC-3: Linhagem celular humana de adenocarcinoma de próstata PE: Ficoeritrina
PGHS: Prostaglandina endoperoxidase H sintase pH: Potencial hidrogeniônico
PI: Iodeto de Propídio
PR: Receptor de progesterona PS: Fosfatidilserina
Pt: Plaquetas
PU-195: Célula Metastática de próstata RBC: Eritrócitos
Rf: retention fator (fator de retenção) rpm: Rotações por minuto
RPMI-1640: Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute (Série 1640) SERM´s: Moduladores seletivos de receptor de estradiol
SFB: Soro fetal bovino SRB: Sulforrodamina B
T0: Média das absorbâncias das células controle no tempo 0
T1: Média das absorbâncias das células controle após 48h de tratamento
T: Média das absorbâncias das células após 48h de tratamento com a amostra TAM: Tamoxifeno
U251: Linhagem celular humana de glioblastoma UACC-62: Linhagem celular humana de melanoma UNICAMP: Universidade Estadual de Campinas v.o.: Via oral
WBC: Leucócitos totais
1. INTRODUÇÃO ... 23
2. REVISÃO DA LITERATURA ... 25
2.1. Câncer ... 25
2.2. Câncer de mama ... 27
2.3. Produtos Naturais ... 31
2.4. Psidium guajava Linn ... 34
3. PROPOSIÇÃO ... 38
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 39
4.1. ESTUDOS FITOQUÍMICOS ... 39
4.1.1. Coleta e preparo do material vegetal ... 39
4.1.2. Teor de umidade (% m/m) ... 39
4.1.3. Obtenção dos extratos brutos ... 40
4.1.4. Fracionamento das amostras ... 40
4.1.4.1. Segundo fracionamento do EBD ... 42
4.1.4.2. Fracionamento da B1 ... 42
4.1.4.3. Fracionamento da fração FATIVA em coluna de fase reversa ... 43
4.1.5. Análise qualitativa por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM) ... 44
4.2. ESTUDOS FARMACOLÓGICOS IN VITRO ... 44
4.2.1. Avaliação da atividade antiproliferativa ... 45
4.2.1.1. Células ... 45
4.2.1.2. Cultivo Celular ... 45
4.2.1.3. Descongelamento das células ... 46
4.2.1.4. Atividade antiproliferativa em painel de células tumorais e não tumoral ... 46
4.2.1.5. Análise dos Resultados ... 48
4.2.2. Avaliação da atividade antiproliferativa em painel de células de mama ... 48
4.2.3. Avaliação da ação estrogênica ou antiestrogênica (E-screen) ... 49
4.2.4. Citometria de fluxo ... 50
4.2.4.1. Viabilidade celular ... 50
4.2.4.2. Avaliação de morte celular ... 51
4.2.4.3. Análise dos Resultados ... 52
4.3.1. Animais ... 54
4.3.2. Preparação das amostras ... 54
4.3.3. Avaliação de toxicidade aguda do EBD e das frações FFINAL e FB1c ... 55
4.3.4. Tumor sólido de Ehrlich: pata e flanco ... 55
4.3.4.1. Manutenção e preparo das células ... 56
4.3.4.2. Tumor sólido de Ehrlich na pata ... 56
4.3.4.3. Tumor sólido de Ehrlich no flanco ... 57
4.3.5. Avaliação da atividade anticâncer da fração FFINAL em modelo de Hollow fiber 58 4.3.6. Avaliação da atividade uterotrófica em ratas pré-púberes ... 59
4.3.6.1. Avaliação da atividade estrogênica ... 60
4.3.6.2. Avaliação da atividade antiestrogênica ... 60
4.3.7. Avaliação da atividade curativa do EBD em modelo de carcinoma mamário em ratas induzido pó MNU (N-metil-N-nitrosuréia) ... 60
4.3.8. Avaliação dos parâmetros sanguíneos ... 61
4.3.9. Coleta de material para análise histopatológica ... 61
4.3.10. Análises estatísticas ... 62
5. RESULTADOS ... 63
5.1. FITOQUÍMICA E ATIVIDADE FARMACOLÓGICA IN VITRO... 63
5.1.1. Teor de umidade das folhas de P. guajava (% m/m) ... 63
5.1.2. Obtenção e Rendimento dos Extratos Brutos (EBD e EBE) ... 63
5.1.3. Segundo fracionamento do EBD ... 66
5.1.4. Frações ativas obtidas em todos os processos de fracionamento ... 69
5.1.5. Fracionamento da FATIVA em coluna de fase reversa (C18) ... 70
5.2. FARMACOLOGIA IN VITRO ... 75
5.2.1. Atividade antiproliferativa em painel de células tumorais de mama ... 75
5.2.2. Atividade do Extrato bruto e fração FFINAL no crescimento da linhagem MCF-7 BUS sob estímulo estrogênico (E-screen) ... 77
5.2.3. Citometria de Fluxo ... 79
5.2.3.1. Curva de viabilidade celular ... 79
5.2.3.2. Avaliação da exposição de resíduos de fosfatidilserina – fração FB1c 81 5.2.3.3. Avaliação da exposição de resíduos de fosfatidilserina – fração FFINAL 82 5.2.3.4. Ciclo Celular ... 86
5.3.1.1. Tratamento com EBD ... 87 5.3.1.2. Tratamento com a fração FB1c ... 89 5.3.1.3. Tratamento com a fração FFINAL ... 90
5.3.2. Atividade anticâncer em tumor sólido de Ehrlich ... 91 5.3.2.1. Tumor sólido de Ehrlich na pata: atividade anticâncer do EBD ... 91 5.3.2.2. Tumor sólido de Ehrlich no flanco: atividade anticâncer da fração FB1c... 95 5.3.2.3. Tumor sólido de Ehrlich no flanco: atividade anticâncer da fração FFINAL
97
5.3.3. Atividade antiproliferativa em modelo de Hollow fiber ... 105 5.3.3.1. Atividade antiproliferativa da fração FFINAL ... 105
5.3.4. Atividade uterotrófica em ratas pré-púberes ... 107 5.3.4.1. Atividade estrogênica in vivo da fração FB1c ... 107 5.3.4.2. Atividade antiestrogênica in vivo da fração FFINAL ... 110
5.3.5. Avaliação da atividade curativa do EBD em modelo de carcinoma mamário em ratas induzido por MNU (1-methyl-1-nitrosourea) ... 111 6. DISCUSSÃO ... 120 7. CONCLUSÃO ...140 REFERÊNCIAS... 142 APÊNDICE 1 – Material e Métodos dos Estudos Fitoquímicos e Farmacológicos e
Resultados... 176 ANEXO 1 – Comitês de Ética em Pesquisa Animal do Instituto de Biologia da UNICAMP (CEUA/Unicamp) ... 214
1 INTRODUÇÃO
O câncer é a segunda maior causa de morte no mundo, superado apenas pelas doenças cardiovasculares, e estima-se que até 2030 ocorrerão aproximadamente 27 milhões de novos casos de câncer e mais de 13 milhões de mortes por câncer em todo o mundo (WCRF/AICR, 2007; OMS, 2015; Carvalho et al., 2015). De acordo com estimativas da Organização Mundial de Saúde, até 2030 ocorrerão aproximadamente 27 milhões de novos casos de câncer e mais de 13 milhões de mortes por câncer em todo o mundo (OMS, 2015). Estes dados alarmantes fazem do câncer um grande problema de saúde pública (Siegel et al., 2016) sendo portanto, necessária a intensificação dos estudos que visam o desenvolvimento de novas drogas para o seu tratamento. As plantas tem sido o principal recurso na medicina tradicional e os produtos naturais são considerados importantes fontes de drogas antitumorais (Song et al., 2014). Em uma recente revisão de Cragg & Newman (2016), ficou claro o papel fundamental que a natureza desempenha neste processo: cerca de 77% das pequenas moléculas aprovadas no mundo para o tratamento do câncer, são de origem natural ou inspiradas a partir de algum produto natural.
A partir de estudos de triagem nas áreas de química, bioquímica, farmacológica e clínica, são descobertos compostos potencialmente ativos provenientes de fontes naturais (Song et al., 2014). Os esforços multidisciplinares são, portanto, essenciais para o sucesso no desenvolvimento de compostos efetivos (Cragg & Newman, 2013).
Os efeitos adversos resultantes da quimioterapia e a reincidência do tumor são os maiores entraves no tratamento do câncer (Song et al., 2014). Diante do exposto, faz-se necessário o desenvolvimento de drogas mais seletivas que possam destruir células malignas sem afetar as células normais (Khazir et al., 2014). Os produtos naturais apresentam algumas vantagens em relação às terapias convencionais por apresentarem ações multialvos bem como menor toxicidade (Shanmugam et al., 2016).
O Brasil possui a maior biodiversidade do planeta, abrigando cerca de 20% do número total de espécies da terra (Brasil, 2017). As plantas estão entre os grupos mais bem estudados no Brasil devido aos esforços nas últimas décadas em fazer levantamentos das espécies, que resultaram na elaboração de listagens bastante completas (Forzza et al., 2012; Brazilian Flora Group, 2015; Prado et al., 2015; Costa et al., 2015; Menezes et al., 2015). Aproximadamente 35.000 espécies de plantas já foram catalogadas e, deste total, cerca de 55% são endêmicas do território nacional (Stehmann & Sobral, 2017). Por possuir uma das
biotas mais ricas do planeta, o Brasil apresenta uma fonte de oportunidades em inúmeras vertentes de pesquisa, em especial as pesquisas científicas e tecnológicas dos produtos naturais (Stehmann & Sobral, 2017).
Em 2004, por meio de um projeto financiado pela FAPESP (Fundo de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – Projeto nº. 2004/07943-9), o Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA – Unicamp) iniciou um trabalho de triagem de espécies vegetais para avaliar o potencial anticâncer e antimicrobiano dos extratos obtidos destas espécies. A espécie Psidium guajava L., conhecida popularmente como goiabeira, apresentou interessante perfil antiproliferativo em cultura de células tumorais humanas, motivo pelo qual, foi estudada posteriormente em um projeto de pesquisa de Mestrado (Processo nº. 2009/06573-7) cujo objetivo principal foi avaliar a atividade anticâncer do extrato bruto e das frações obtidos das folhas da espécie em modelos experimentais in vivo. Os resultados obtidos a partir de experimentos in vitro sugeriram que uma das frações obtidas, enriquecida com os meroterpenos guajadial e psidial, tem potencial anticâncer e hormonal já que apresentaram ação sobre a linhagem celular tumoral MFC-7 (mama) que é uma linhagem hormônio-dependente. Além disso, através da técnica de docking
molecular, foi possível verificar afinidade de ligação significativa entre os princípios ativos a
ambas as isoformas dos receptores de estrógeno (alfa e beta), indicando dessa forma, uma possível ação sobre tais receptores. A redução sobre o crescimento do tumor sólido de Ehrlich após tratamento com a fração enriquecida indicou uma ação anticâncer efetiva neste modelo experimental in vivo, confirmando o potencial da espécie.
Estes resultados promissores obtidos com a espécie encorajam estudos mais aprofundados em relação ao seu potencial anticâncer e hormonal. Por este motivo, o presente estudo tem como principais objetivos aprofundar os estudos relacionados aos mecanismos de ação anticâncer dos seus compostos ativos e confirmar a ação hormonal utilizando tanto metodologias in vitro quanto metodologias in vivo.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Câncer
O câncer é denominado como um conjunto de mais de 100 tipos diferentes de doenças, que tem em comum o crescimento desordenado das células, que invadem tecidos e órgãos, com potencial de se espalhar para outras regiões do corpo. Quando se dividem rapidamente, de forma agressiva e incontrolável, resultam na formação de tumores malignos ou neoplasias malignas (INCA, 2018).
A carcinogênese ou oncogênese é o processo no qual as células normais se transformam em células cancerígenas, ou seja, é o processo de formação do câncer. Este processo passa por três estágios antes de chegar ao tumor: estágio de iniciação, de promoção e de progressão (Karin & Greten, 2005). No estágio de iniciação, as células sofrem modificações no DNA provocadas por agentes carcinogênicos levando a ativação de oncogenes e/ou inativação de genes supressores de tumor. O estágio de promoção é caracterizado pela transformação das células alteradas geneticamente em células malignas após um período de exposição prolongado e contínuo a agentes oncopromotores. Alguns exemplos de oncopromotores são estrógeno, progesterona, hepatite B e C, inflamações crônicas, tabaco e Helicobacter pylori (Weinberg, 2008). E por fim, na fase de progressão, as células multiplicam-se de forma descontrolada e irreversível e se estende até as primeiras manifestações clínicas da doença (Almeida et al., 2005; INCA, 2018).
As alterações genéticas que as células sofrem durante o processo da carcinogênese resultam em modificações metabólicas e promovem alterações no microambiente circundante conferindo, desta forma, vantagens para as células tumorais invadirem tecidos adjacentes e favorecer sua proliferação e manutenção. Estas alterações são denominadas como hallmarks do câncer (Hanahan & Weinberg, 2011): proliferação auto-sustentada; evasão de sinais supressores de crescimento; resistência à morte celular; replicação ilimitada; indução de angiogênese; invasão tecidual e metástase; instabilidade genômica e mutação; inflamação; alteração do metabolismo celular; e evasão da destruição pelo sistema imune (Figura 1).
Figura 1. Hallmarks do câncer. Adaptado de Hanahan & Weinberg, 2011.
Os fatores que levam à formação do câncer podem ser internos ou externos ao organismo, estando ambos inter-relacionados. A ocorrência de erros naturais durante a divisão e proliferação celular e o fator da hereditariedade, constituem fatores internos enquanto que o ambiente físico e os hábitos de vida constituem os fatores externos. Na realidade, a maioria dos cânceres (80 a 90%) está associada a fatores ambientais tais como o tabagismo, radiação solar, alcoolismo, hábitos alimentares, infecções, medicamentos e fatores ocupacionais. Além destes fatores, o envelhecimento da população está diretamente relacionado com o aumento da incidência de câncer, por conta do envelhecimento celular que aumenta a susceptibilidade à transformação maligna e ao tempo de exposição aos diferentes fatores de risco para o câncer (INCA, 2018).
Nos países em desenvolvimento, espera-se que nas próximas décadas, o impacto do câncer na população corresponda a 80% dos mais de 20 milhões de casos novos estimados para 2025 e, diante deste quadro, é inquestionável que o câncer tornou-se um problema de saúde pública, especialmente nestes países (OMS, 2014). De acordo com o projeto Globocan, no ano de 2012, dos 14 milhões de casos novos estimados (sem contabilizar os casos de câncer de pele do tipo não melanoma), mais de 60% ocorreram em países em desenvolvimento. Esta situação parece ser ainda mais grave em relação à mortalidade, já que dos oito milhões de óbitos que eram previstos, 70% ocorreram nesses mesmos países. Neste mesmo ano, os tipos de câncer mais incidentes no mundo foram pulmão (1,8 milhão), mama
(1,7 milhão), intestino (1,4 milhão) e próstata (1,1 milhão). Nos homens, os mais frequentes foram pulmão (16,7%), próstata (15,0%), intestino (10,0%), estômago (8,5%) e fígado (7,5%). Em mulheres, as maiores frequências encontradas foram mama (25,2%), intestino (9,2%), pulmão (8,7%), colo do útero (7,9%) e estômago (4,8%).
A estimativa para o Brasil, publicadas pelo INCA em 2018, e válidas para o ano de 2019, indica a ocorrência de cerca de 600 mil casos novos de câncer (170 mil casos novos de câncer de pele não melanoma e 420 mil casos novos de outros tipos de câncer). O câncer mais incidente nos homens será o de próstata (68 mil), enquanto que nas mulheres será o de mama (60 mil). Sem contar os casos de câncer de pele não melanoma, os tipos mais freqüentes em homens serão próstata (31,7%), pulmão (8,7%), intestino (8,1%), estômago (6,3%) e cavidade oral (5,2%). Nas mulheres, os cânceres de mama (29,5%), intestino (9,4%), colo do útero (8,1%), pulmão (6,2%) e tireoide (4,0%) figurarão entre os principais.
2.2. Câncer de mama
Apesar dos recentes avanços no diagnóstico e terapias medicamentosas, o câncer de mama é a neoplasia mais freqüente em mulheres e a principal causa de mortes relacionadas ao câncer, o que a torna a quinta causa de morte por câncer no mundo (WHO, 2002; Jonkers & Berns, 2005; Fujiki, 2013; WHO, 2014). Apesar de ser uma doença predominantemente feminina, este tipo de câncer também acomete homens, porém é raro, representando apenas 1% do total de casos da doença (INCA, 2018).
Estima-se no Brasil, em 2018, o aparecimento de 59.700 novos casos de câncer de mama, com um risco aproximado de 56,33 casos a cada 100.000 mulheres (INCA, 2018). Na maior parte dos casos, é possível detectar o câncer de mama em fases iniciais, o que aumenta as chances de tratamento e cura. Entretanto, no Brasil, as taxas de mortalidade decorrentes deste tipo de câncer têm se mantido muito elevadas há décadas, porque a doença ainda é diagnosticada somente em estágios avançados (INCA, 2015).
O câncer de mama pode ser causado por diversos fatores tais como: idade, fatores endócrinos, fatores ambientais e fatores genéticos. A idade constitui um dos principais fatores que aumentam o risco de se desenvolver câncer de mama e este risco aumenta significativamente a partir dos 50 anos (INCA, 2015). Porém, muitos relatos têm sido publicados sugerindo um aumento na incidência de casos de câncer de mama e da mortalidade em mulheres jovens em várias partes do mundo. Na França, por exemplo, entre os anos de 1991 a 2003, houve um aumento da incidência de câncer de mama em mulheres com menos
de 50 anos (Fontenoy et al., 2010), assim como ocorreu na Espanha (entre 1980 a 2004) em mulheres entre 25 a 45 anos de idade (Pollán et al., 2009). Na Colômbia, Cardona e Agudelo (2007) verificaram um aumento das taxas de mortalidade por câncer de mama em mulheres com idade entre 20 a 44 anos durante um período de 10 anos (1994 a 2003). Essa tendência de aumento de câncer de mama em mulheres com menos de 50 anos também foi observada em outros países, como Estados Unidos (Johnson et al., 2013), Xangai (Wu et al., 2012), Irã (Taghavi et al., 2012) e também no Brasil (Gonçalves & Barbosa, 2006; Freitas Júnior et al., 2008).
Os fatores endócrinos também constituem um dos fatores de risco para o desenvolvimento de câncer de mama. Muitos estudos epidemiológicos associam o aumento do risco de câncer de mama com a menarca precoce (Gao et al., 2000; Beji & Reis, 2007; Msolly et al., 2013; ACS, 2017; INCA, 2017), nuliparidade ou idade avançada no nascimento do primeiro filho (Lee et al., 2003; Gao et al., 2000), nunca ter amamentado (Lodha et al., 2011; Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer, 2002 a; Gao et al., 2000), menopausa tardia (Shamsi et al., 2013; Naieni et al., 2007; Gao et al., 2000), reposição hormonal durante a menopausa (Rozenberg et al., 2013) e o uso de contraceptivos orais (Urban et al., 2012; Parkin, 2011; Zhu et al., 2012). A exposição excessiva ao hormônio estrogênio durante a vida da mulher constitui um ponto em comum entre estes fatores de risco, sugerindo que esta exposição tenha um papel importante na causa do câncer de mama (Yager, 2000).
Os estrogênios são hormônios sexuais femininos esteróides com 18 carbonos, que são secretados principalmente pelos ovários e, em menor quantidade, pelas adrenais. Estão relacionados com o crescimento, diferenciação e funcionamento do sistema reprodutivo da mulher. O estrogênio abrange três hormônios esteróides estruturalmente semelhantes: 17β – estradiol (E2), estrona (E1) e estriol (E3). Desses, o 17β – estradiol é o principal esteróide em
humanos e também o mais potente (Kendal & Esron, 2002).
Os receptores de estrogênio (ER), ERα e ERβ, são os mediadores das respostas fisiológicas dos estrogênios. Fazem parte de uma ampla família de receptores hormonais nucleares (Mangelsdorf et al., 1995). Os ERα são amplamente distribuídos em diversos tecidos, com predomínio principalmente nos tecidos reprodutivos, como o útero e mama, enquanto que os ERβ é econtrado principalmente nos ovários, próstata, epidídimo, pulmão e hipotálamo (Ignácio et al., 2009). A expressão dos receptores de estrógeno é reconhecida como marcadores na prática oncológica clínica, sendo utilizada como indicador da biologia tumoral e prognóstico, sendo capaz de predizer a resposta tumoral frente à terapia endócrina
(Rasteli & Crispino, 2008; Ma et al., 2009). A presença dos ERα em tumores de mama está associada com uma melhor resposta à terapia hormonal e, consequentemente, melhor prognóstico (Ali et al., 2000).
Concomitante à sua atividade fisiológica, o estrogênio desempenha uma função importante no desenvolvimento e progressão do câncer de mama hormônio-dependente, desencadeando um aumento na proliferação destas células (Silva, 2014). Experimentos de carcinogênese mamária realizados com ratos sugeriram que o estrogênio age promovendo e/ou permitindo o desenvolvimento de tal carcinoma (Brentani & Feldman, 1995).
Dentre os fatores ambientais relacionados ao câncer de mama, estão incluídos dietas com elevado consumo de gorduras totais e gorduras saturadas de origem animal, consumo de álcool, obesidade e exposição à radiação ionizante (Stewart & Wild, 2014; American Cancer Society, 2017; INCA, 2017).
Um estudo realizado com mulheres do European Prospective Investigation into
Cancer and Nutrition (EPIC) evidenciou que uma dieta baseada em alimentos ricos em
gorduras está associada com um risco duas vezes maior de desenvolvimento de câncer de mama (Schultz et al., 2008). Vários estudos epidemiológicos relataram uma associação positiva entre o consumo de álcool e o risco de câncer de mama (Morch et al., 2007; Thygesen et al., 2008; Islam et al., 2012). O mecanismo pelo qual o álcool aumenta as chances de desenvolver câncer de mama ainda não foi totalmente estabelecido, porém acredita-se que o consumo de álcool leve a um aumento dos níveis de estrogênio plasmático (Feigelson e Henderson, 1996). A oxidação do álcool mediada pela enzima álcool desidrogenase (ADH), que aumenta o estado redox hepático, que por sua vez inibe o catabolismo dos esteróides sexuais, tem sido sugerido como o mecanismo responsável por elevar os níveis plasmáticos de estrógenos (Scoccianti et al., 2013). A relação entre a obesidade e o risco de desenvolvimento de câncer de mama em mulheres na menopausa foi avaliada, e concluiu-se que o crescimento de tumores (ER positivos) está relacionado com o estrógeno, pois o nível deste hormônio é maior em mulheres na pós-menopausa com sobrepeso e obesidade devido à aromatização de androstendiona e testosterona em estrogênios no tecido adiposo. Indivíduos obesos possuem maior quantidade de tecido adiposo do que indivíduos com peso normal e, portanto, apresentam maior síntese endógena de estrogênios em seu tecido adiposo (Althuis et al., 2004; Khandekar et al., 2011; Morris et al., 2011; Goodwin, 2013). Constatou-se também que a obesidade está associada às características do câncer de mama, incluindo tamanho do tumor, positividade dos linfonodos e estágio do diagnóstico. Além disso, mulheres com tumores ER positivos ou PR positivos que eram
obesas (grau I e II ou III) apresentaram 52% e 86% de aumento de risco de câncer de mama, respectivamente, em comparação com mulheres com IMC (índice de massa corporal) normal (Neuhouser et al., 2016).
O risco devido à radiação ionizante (tipo de radiação presente na radioterapia e em exames de imagem como o raio X, mamografia e tomografia computadorizada) é diretamente proporcional à dose e à freqüência e está relacionado à idade de ocorrência da exposição. Se a exposição ocorre antes dos 20 anos de idade, período no qual a glândula mamária não está totalmente desenvolvida, o risco de desenvolver câncer de mama é aumentado (Ronckers, 2005).
E, por fim, alterações genéticas hereditárias decorrentes de mutações nas células germinativas, representam aproximadamente 5 a 10% de todos os casos de câncer de mama, sendo definidos como "câncer de mama hereditário" (Slattery, 1993; CGHFBC, 2001). Os casos de câncer de mama classificados como "familiares" representam 20 a 25% dos casos de câncer e são assim classificados, pois se identifica um padrão de distribuição fenotípica com características de tumor hereditário, mas não se consegue determinar uma mutação deletéria específica como agente causal na família (Slattery, 1993; Couch, 2014). Por exemplo, os membros de uma família com histórico positivo correm um risco de desenvolver um câncer de mama de 40 a 80%, nos casos dos indivíduos que possuem mutações nos genes BRCA1 ou
BRCA2 (Fackenthal & Olapade, 2007). Estes genes atuam como supressores tumorais e
desempenham um papel importante no controle do ciclo celular e no reparo de danos à molécula de DNA (Teng et al., 2008). As mutações nestes genes são responsáveis por 30 a 50% dos cânceres de mama hereditários, constituindo a chamada Síndrome de câncer de mama e ovário hereditários (Ferla et al., 2007).
Existem vários tipos de tratamentos para o câncer de mama, e sua escolha depende de diversos fatores como o estadiamento (extensão) da doença, suas características biológicas, bem como as condições do paciente (idade, status menopausal, comorbidades e preferências) (INCA, 2015). Dentre os tratamentos disponíveis, destacam-se as cirurgias, radioterapia, quimioterapia e hormonioterapia.
As cirurgias incluem a tumorectomia (retirada do tumor e parte do tecido normal que o circunda), a segmentectomia (retirada do tumor e de uma grande parte do tecido mamário que o circunda) e a mastectomia (outro tipo de cirurgia usada com menor freqüência), que corresponde à retirada da mama parcial ou totalmente (MS, 2008).
A radioterapia consiste em utilizar irradiações de alta energia para destruir as células cancerosas que podem permanecer na região depois da cirurgia (MS, 2008). A
quimioterapia é o uso de uma combinação de fármacos, por via oral ou por aplicação intravenosa, que atacam e destroem as células cancerosas e as células normais de crescimento rápido. As mulheres com tumores de mama com resposta hormonal negativa são as mais propensas a receber este tipo de tratamento (WHO, 2002; MS, 2008). Tanto a radioterapia quanto a quimioterapia podem ter finalidade neoadjuvante, quando utilizadas para destruir as células cancerosas e conseguir diminuir o tamanho do tumor antes da cirurgia (MS, 2008).
A hormonioterapia é um tratamento que consiste do uso de substâncias que bloqueiam a síntese de estradiol ou que competem com o sítio de ligação dos receptores de estrogênio (moduladores seletivos ou supressores seletivos do ER) e está associada a menores índices de recorrência da doença e metástase, resultando na redução da taxa de mortalidade e aumento da sobrevida (IOM, 1999; WHO, 2002; Coleman, 2002; Jatoi & Miller, 2003). A hormonioterapia é amplamente utilizada no tratamento do câncer de mama sensível ao estrogênio ou progesterona, tanto em estágio precoce como avançado da doença. O câncer de mama mais prevalente (60% a 80% dos casos) apresenta positividade para o receptor de estrogênio (AMB & ANS, 2009) e/ou receptor de progesterona (Weigel & Dowsett, 2010).
O tamoxifeno (TAM) é um fármaco que compete com o estrogênio por sítios de ligação nas células mamárias, sendo o primeiro medicamento empregado na hormonioterapia para tratamento do câncer de mama e também o primeiro a ser usado como quimiopreventivo, tendo sido empregado desde a década de 70 em terapias hormonais de carcinoma maligno de mama. Como agente quimiopreventivo o TAM tem sido administrado a mulheres que apresentam elevado risco de desenvolvimento de câncer de mama, reduzindo a incidência da doença em 50% nos grupos de mulheres em pré- ou pós- menopausa (Fisher et al., 1998; Cuzick et al., 2003). Quando utilizado como adjuvante, o tratamento com tamoxifeno por cinco anos reduz o risco de reincidência do câncer de mama em 47% e a mortalidade em 26% das pacientes (Singh et al., 2007). É classificado como modulador seletivo do receptor de estrogênio (SERM), pois mimetiza o efeito do estrogênio em alguns tecidos enquanto que em outros tecidos, apresenta efeitos antagonistas. Sua ação agonista (parcial) é observada no endométrio e em outros tecidos, e está associada com um aumento de 2-7 vezes no risco de desenvolvimento de um carcinoma endometrial (Curtis et al., 1996; Jordan et al., 2006)
Apesar destes efeitos sobre o útero, o uso do TAM está associado com muitos efeitos benéficos devido à sua ação pró-estrogênica em outros sítios-alvo (The Breast International Group – BIG, 2005). Aparentemente, mantém e/ou restaura a densidade óssea em mulheres pós-menopausa (Love et al., 1992; Eastell et al., 2005); e diminui o colesterol em mulheres com câncer de mama (Herrington et al., 2001). Isto está associado com a
redução de infarto agudo do miocárdio e angina durante os cinco anos de tratamento (Bradbury et al., 2005).
2.3. Produtos naturais
Desde o século passado, os produtos naturais têm sido a maior fonte de diversidade química para o desenvolvimento de produtos na indústria farmacêutica. Historicamente, estas empresas utilizavam extratos de plantas para produzir formulações farmacêuticas, porém com os avanços decorrentes da descoberta dos antibióticos, em meados do século XX, estas formulações passaram a ser compostas de substâncias mais purificadas (Firn & Jones, 2003).
O uso medicinal das plantas continua a desempenhar um importante papel no sistema de saúde em todo o mundo e seu uso em diferentes culturas já foi extensivamente documentado (Moerman, 1986; Johnson, 1999). Os produtos obtidos a partir das plantas têm uma longa história no tratamento do câncer (Khazir et al., 2014). Dos fármacos utilizados na clínica como agentes anticancerígenos, os mais conhecidos são os alcalóides da vinca, vinblastina e vincristina, isolados a partir da espécie Catharantus roseus (Guerite & Fahy, 2005; Roussi et al., 2012), e o etoposídeo e tenoposídeo que são derivados semi-sintéticos da epipodofilotoxina, obtida a partir da raiz da espécie Podophyllum peltatum (Lee & Xiao, 2005; Lee & Xiao, 2012). O Paclitaxel (Taxol®), descoberto em 1962, é um dos agentes anticâncer derivados de plantas obtido a partir da casca do Taxus brevifolia e de inúmeras outras espécies do gênero Taxus (Kingston, 2005; Kingston, 2012). A descoberta, em 1979, de seu modo de ação sobre a tubulina dos microtúbulos por Schiff e Horwitz (1980), foi um marco importante, sendo que finalmente este medicamento foi aprovado para uso clínico contra o câncer do ovário (em1992) e contra o câncer de mama (em 1994). Outra descoberta de agentes quimioterápicos, derivados de plantas, foram os compostos semi-sintéticos ativos topotecan, irinotecan e belotecan, derivados da camptotecina, que por sua vez, é obtida a partir da árvore ornamental chinesa Camptotheca acuminata (Rathier et al., 2005). Com esse enfoque na descoberta de novos agentes antitumorais, o isolamento e identificação de compostos de fontes naturais têm propiciado o aumento no número de novas estruturas químicas bioativas para inúmeras indicações terapêuticas. Nesse sentido, foram desenvolvidos métodos de triagem biológicas (High Throughput Screening - HTS) que permitem testar in vitro milhares de substâncias frente a alvos biológicos específicos em curto espaço de tempo (Brandão, 2010).
Um levantamento feito por Cragg e Newman (2016), indicou que entre 1940 a 2014, foram desenvolvidas, em média, 136 drogas (pequenas moléculas) para o tratamento de câncer e deste total, 77% eram derivadas de produtos naturais (plantas, microorganismos e organismos marinhos) ou inspiradas a partir destes. As plantas medicinais utilizadas na forma de extrato bruto ou fração contendo seus princípios ativos apresentam efeitos quimiopreventivos e terapêuticos em diversos tipos de cânceres, induzindo ou suprimindo atividades específicas e mecanismos associados com sinalização molecular (Aravindaram & Yang, 2010). A contribuição dos produtos naturais para a expansão do "armamentário" quimioterápico é claramente evidente, e ainda há muito que se descobrir nesta área de pesquisa (Newman & Cragg, 2016).
A complexidade e a diversidade molecular dos produtos naturais são claramente evidentes, e por estes motivos os produtos naturais têm despertado até hoje, o interesse para o desenvolvimento de novas drogas. Dentro deste contexto, outro aspecto adicional importante, é que os produtos naturais possuem atividades biológicas altamente específicas e seletivas quando nos referimos aos seus mecanismos de ação (Cragg & Newman, 2013).
Um exemplo desta especificidade de mecanismo de ação é observado no caso dos fitoestrógenos, que são compostos produzidos naturalmente pelas plantas e capazes de mimetizar o hormônio humano 17- β-estradiol (Setchell et al., 2001; Ko et al., 2010). Por conta desta similaridade estrutural, os fitoestrógenos são capazes de interferir na ação do hormônio através da interação com os receptores estrogênicos, ou então, através da modulação das concentrações do estrógeno endógeno (Matsumura, 2005). A ligação dos fitoestrógenos aos receptores hormonais pode resultar em efeitos estrogênicos ou antiestrogênicos, sendo dependente da dose (Roberts, 2010) e do sítio de atuação, sendo classificados como SERM’s.
Os fitoestrógenos mais comuns nos alimentos são as isoflavonas, que estão presentes principalmente na soja, e em outros grãos como ervilha verde, lentilha, feijão e derivados de legumes (Liggins et al., 2000). Além desta classe, os lignanos e coumestanos também são classificados como fitoestrógenos (Mense et al., 2008).
O consumo das isoflavonas (presentes na soja) está associado com inúmeros benefícios que incluem prevenção de doenças cardiovasculares, diabetes, osteoporose e câncer de mama, ovário e próstata. Outros estudos também indicam que o consumo das isoflavonas ameniza os sintomas relacionados à menopausa (Markovic et al., 2015; Sorensen, 2015; Alipour, Jafari-Adli & Eskandari, 2015; He et al., 2015).
2.4. Psidium guajava Linn.
A espécie Psidium guajava L., popularmente conhecida como goiaba, pertence à Família Myrtaceae, que abrange cerca de 130 gêneros e mais de 3800 espécies de arbustos e pequenas árvores de até 10 metros. É nativa da América Central, porém é amplamente distribuída e cultivada em diversos países tropicais do mundo e seus frutos constituem a dieta de milhões de pessoas nestas regiões (Rathish & Sumira, 2007; El-Mahmood, 2009).
O histórico do uso da espécie P. guajava na medicina natural por curandeiros tradicionais levou muitos pesquisadores modernos a estudar o efeito de extratos da goiaba no tratamento de diferentes doenças (Pakpahan et al., 2013). Os usos etnomedicinais incluem a trituração das folhas e a aplicação do extrato em feridas, furúnculos e infecções (Bala, 2006). Outros estudos mostraram que a espécie é utilizada no tratamento de inúmeras doenças como hipertensão, diabetes, úlceras e possui efeitos antiinflamatório e analgésico (Gutierrez et al., 2008). A planta, como um todo, possui diversos fins medicinais (Geidam et al., 2007), sendo utilizada em muitos países na forma de infusão, decocção e na forma pastosa para tratamento de problemas de pele, dismenorréia, abortos, hemorragias uterinas, trabalho de parto prematuro e feridas (Gutierrez et al., 2008). A decocção das folhas é utilizada na Índia como antipirético, antiespasmódico e para o reumatismo (Hernandez, 1971).
No Brasil, a ingestão tanto dos frutos quanto das folhas (na forma de chás) são utilizados para o tratamento da anorexia, diarréia, problemas digestivos, disenteria, inflamações nas membranas mucosas, laringite, problemas de pele, dores de garganta, úlceras e corrimentos vaginais (Holetz et al., 2002).
Muitos estudos que avaliaram as propriedades farmacológicas do caule, frutos e folhas da espécie comprovaram atividades antibacterianas, hipoglicêmica, antiinflamatória, antipirética, espasmolítico e depressor do sistema nervoso central (Begum et al., 2002).
Análises fitoquímicas da espécie revelaram mais de 20 compostos que podem ser isolados a partir das folhas, incluindo alcalóides, antocianinas, carotenóides, óleos essenciais, ácidos graxos, lectinas, fenóis, saponinas, taninos, triterpenos e vitaminas (ácido ascórbico). O óleo essencial é constutuído por alfa-pineno, cariofileno, cineol, D-limoneno, eugenol e mirceno (Latza et al., 1996; Olajide et al., 1999; Begun et al., 2002; Conde Garcia et al., 2003; Belemtrougri et al., 2006).
A atividade anticâncer de diversos extratos obtidos a partir das folhas de P.
guajava é descrita em inúmeros estudos realizados com a espécie. Um dos primeiros estudos
antiproliferativa do óleo essencial de 17 plantas medicinais da Tailândia. Neste estudo, dentre as espécies avaliadas, o óleo obtido das folhas de P. guajava demonstrou a melhor atividade antiproliferativa em células KB (câncer epidermal de boca) e em P388 (leucemia murina). Os autores sugeriram que os principais flavonóides da espécie eram a miricetina e apigenina, que são potentes antioxidantes, antimutagênicos e anticarcinogênicos. Os compostos polifenólicos solúveis e os flavonóides, de acordo com Chen et al. (2007), possuem grande potencial de atividade anticâncer. A grande quantidade destes compostos nos extratos das folhas da goiaba (1 mg/mL) foram ativos na linhagem metastática de próstata (DU-195), apresentando atividade quimiopreventiva e quimioterapêutica. Os mesmos autores, em 2009, avaliaram os polifenólicos solúveis do extrato das folhas e foram encontradas altas concentrações de ácido gálico, catequinas, epicatequinas, rutina e quercetina; em 2010 avaliaram o extrato aquoso e verificaram um efeito citotóxico com indução de morte celular por apoptose sobre a linhagem tumoral LNCaP (adenocarcinoma de próstata humano andrógeno-sensível) bem como alteração do ciclo celular desta linhagem, com parada na fase G0/G1. Os efeitos citotóxico e indutor de apoptose de extratos das folhas de P. guajava também foram observados na linhagem humana de câncer cervical (Joseph & Priya, 2011). A atividade citotóxica do extrato hexânico das folhas foi avaliada em células de leucemia (Kasumi-1) e sua atividade foi atribuída à presença dos flavonoides quercetina e kaempferol no extrato (Levy & Carley, 2012).
Pesquisas realizadas com os extratos obtidos a partir das folhas de P. guajava revelaram promissoras atividades antiproliferativas e anti-inflamatória para as linhagens de fibrosarcoma murino (L929sA) e adenocarcinoma mamário (MCF7), e os estudos acerca do mecanismo de ação sugerem que estas atividades devam estar relacionadas com a inibição da via NF-kB (Kaileh et al., 2007). Choi e colaboradores (2008) determinaram que o extrato fermentado das folhas de espécie inibia de forma significativa a ativação transcricional da NF-kB, assim como o óxido nítrico sintase (iNOS) e COX-2. Em 2009, a atividade antiproliferativa sobre células tumorais de cólon observada foi relacionada com a inibição da prostaglandina endoperoxidase H sintase (PGHS) que desempenha importantes funções na inflamação e carcinogênese (Kawakami et al., 2009).
Na medicina popular, especialmente em tribos africanas, a decocção das folhas de
P. guajava são comumente empregadas para tratar uma gama de desordens reprodutivas.
Acredita-se que os extratos das folhas melhoram a ereção e a impotência em homens. Entretanto, não há dados documentados que sustentam tais práticas (Uboh, 2010). Em uma pesquisa realizada por Uboh e colaboradores (2010), verificou que o extrato aquoso das folhas
de P. guajava aumentou os níveis plasmáticos de estradiol e progesterona em ratas em 17,6 e 34,6%, respectivamente, enquanto que em machos o nível de testosterona aumentou em 38,6%. Não foram observadas alterações dos níveis plasmáticos de FSH e LH. Os resultados publicados sugerem que o extrato tem efeito sobre as gônadas, estimulando a secreção de hormônios. Esta capacidade de alterar os níveis hormonais pode servir de base para o tratamento de distúrbios hormonais e problemas de fertilidade.
Durante os anos de 2004 a 2008, a Divisão de Farmacologia e Toxicologia do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA-UNICAMP), participou do projeto BIOPROSPECTA – FAPESP (04/15410-0) com o objetivo de buscar compostos promissores, obtidos a partir de plantas, para o tratamento de diversas doenças. Uma das espécies avaliadas neste projeto foi a P. guajava, que foi estudada posteriormente em outros estudos, devido aos resultados obtidos relacionados à atividade anticâncer. Mais recentemente, verificou-se que o extrato diclorometânico obtido a partir das folhas da P.
guajava, apresentou uma promissora atividade anticâncer in vivo em modelo de tumor sólido
de Ehrlich e uma possível atividade sobre os receptores de estrogênio, que foi confirmada através da técnica de docking molecular. Os princípios ativos presentes na fração avaliada, responsáveis pela atividade biológica observada, eram o guajadial e psidial A (Figura 2), os quais apresentavam semelhança estrutural com o estrogênio, sugerindo, desta forma, uma promissora atividade hormonal (Rizzo et al., 2014).
Os resultados obtidos até o momento estimularam o presente estudo sobre o potencial farmacológico da Psidium guajava. Espera-se confirmar a ação sobre os receptores de estrógeno, utilizando metodologias in vitro e in vivo, avaliar os mecanismos de ação anticâncer e confirmar se a administração via oral, dos extratos e frações, é efetiva na inibição do desenvolvimento tumoral.
Figura 2. Estruturas químicas do Guajadial (A), Psidial A (B) e 17beta Estradiol (C)
Fonte: Lawrence et al., 2010.
A B
C
3 PROPOSIÇÃO
Geral
Avaliar a atividade farmacológica dos extratos brutos e frações obtidos das folhas da Psidium guajava L. em modelos experimentais de câncer (in vitro e in vivo), e em modelos que avaliam a atividade sobre os receptores de estrogênio.
Específicos
• Obter extratos brutos e frações a partir das folhas de Psidium guajava L. em quantidades suficientes para os estudos experimentais in vivo e in vitro;
• Avaliar a atividade antiproliferativa em cultura de células tumorais dos extratos brutos e frações de P. guajava e determinar o extrato e as frações mais promissoras para continuação do estudo, conforme segue;
• Avaliar parâmetros celulares envolvidos na atividade antiproliferativa in
vitro deste extrato e fração por citometria de fluxo;
• Avaliar a atividade anticâncer do extrato e da fração através dos modelos experimentais murinos de Tumor sólido de Ehrlich em pata e no flanco de camundongos;
• Avaliar a atividade antiproliferativa em células MCF7 encapsuladas em fibras semipermeáveis (Hollow fibers) implantadas em camundongos;
• Avaliar a atividade curativa em modelo de carcinoma mamário em ratas induzido por MNU (1-methyl-1-nitrosourea);
• Avaliar a influência na proliferação da linhagem tumoral MCF-7 BUS (mama) sob estímulo estrogênico (E-screen);
