6.1. Resumo do Capítulo
7.4.2. Citotoxicidade do extrato microemulsionado das folhas de
No estudo de toxicidade in vitro do extrato seco metanólico da folha de S.
brasiliensis (ExmSb) e do extrato seco metanólico da folha de S. brasiliensis
microemulsionado (ExMESb) realizado sobre as linhagens de células (Macrófagos, (K562) células de linhagem Leucêmica, (NCI-H292) células mucoepidermóides de
carcinoma de pulmão humano, (HT-29) células de Adenocarcinoma de cólon humano de grau II e (HEp-2) Carcinoma humano) observamos uma toxicidade seletiva tanto do ExmSb, como da própria ME e quanto do ExMESb frente a K562, NCI-H292, HEP-2, enquanto que as células macrofágicas murinas e HT-29 apresentaram IC50 superior à 50 µ g/mL, sendo de baixa citotoxicidade (Tabela 2).
TABELA 2. Estudo citotóxico do ExmSb e ExMESb frente a duas linhagens celulares. Linhagem de Células
IC50 (µg/mL)
Etoposídio ExmSb ExMESb ME
K562 4,4 43,06 13,21 >50
NCI-H292 - 27,28 8,23 9,66
HT-29 - > 50 > 50 > 50
HEP-2 - 32,53 17,23 28,58
Macrófagos murinos - > 50 > 50 > 50
IC50: Concentração que mataram aproximadamente 50% das células; K562: Células de
Linhagem leucêmicas; NCI-H292: células mucoepidermóides de carcinoma de pulmão humano; HT-29: células de Adenocarcinoma de cólon humano de grau II; HEp-2: Carcinoma humano); ExmSb: Extrato seco metanólico da folha de S. brasiliensis; ExMESb: Extrato seco metanólico da folha de S. brasiliensis microemulsionado; ME: Microemulsão; - : não testado;
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8. DISCUSSÃO
A partir do estudo bioautográfico do extrato metanólico das folhas de Schinopsis
brasiliensis (ExmSb) observou-se três halos de inibição que corresponderia a quatro
metabólitos com potencial antimicrobiano. Seguindo o parâmetro do Rf dos metabólitos ativos, conseguiu-se isolar dois dos constituintes responsáveis pelo potencial antimicrobiano do ExmSb, sendo o terceiro composto (ácido gálico) identificado utilizando-se um padrão de referência.
A atividade antimicrobiana dos isolados das folhas de Schinopsis brasiliensis: β- 1,2,3,4,6-Pentagaloil-D-Glicose (PGG) (tanino que possui cinco ácidos gálicos ligados a uma molécula de glicose) (SÖHRETOGLU et al., 2001) e o galato de metila (GM) (éster de ácido gálico, do grupo dos ácidos fenólicos) (MOURA et al., 2011) foi confirmado ação antimicrobiana pela técnica de poços difusão em ágar.
O alto conteúdo de fenóis totais (83%, sendo deste total 55% de taninos e 1,36 % de flavonóides), está intimamente relacionado ao potencial antioxidante do ExmSb (CE50 = 8,80 ± 0,94 µg/mL, sendo a CE50 do ácido ascórbico 22,53 ± 1,24 µg/mL). Ainda, a baixa ação quelante (FIC) do ExmSb (CE50 = 1440,62 ± 180,67 µg/mL, o controle (EDTA) CE50 = 9,73 ± 0,11) é um dado importante, por apresentar baixa ação quelante, o que reduz a possibilidade de formação de complexos com os componentes da microemulsão, prejudicando a estabilidade do extrato microemulsionado das folhas de S. brasiliensis (ExMESb).
Assim, a atividade antimicrobiana do ExmSb está diretamente relacionada à concentração de compostos fenólicos, sendo já isolados e/ou identificados das folhas de
Schinopsis brasiliensis o ácido gálico, galato de metila, ácido elágico, quercetina
(MOREIRA, 2009; SOUZA, 1990), em particular dos taninos, que correspondem a 55% do conteúdo fenólico, sendo um destes o β-1,2,3,4,6-Pentagaloil-D-Glicose, que também justifica a elevada atividade antioxidante encontrada do ExmSb (ZHANG et al., 2009; NIJEVELDT et al., 2001).
Na literatura é relatada a estreita relação da atividade antioxidante dos compostos fenólicos com a ação antimicrobiana (VATTEN, 2005; NIJEVELDT et al., 2001) verificada pela inibição dos radicais livres, ação quelante das proteínas, comumente associado a processos vitais nos microrganismos (NIJEVELDT et al., 2001; ZAIDI-YAHIAOUI et al., 2008). Também foi verificado que o ExmSb apresentou moderada toxicidade (705.54 ± 60.46 µg/mL), por reduzir a motilidade das larvas de A.
salina. Isto pode ser explicado pela alta concentração de polifenóis (tanino, flavonóides
e outros compostos fenólicos) que é bem conhecido pela sua toxicidade frente A. salina (SANTOS et al., 2010).
Particularmente, o maior potencial antimicrobiano de ExmSb apresentado frente às cepas de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa de reconhecida patogenicidade, virulência e importância clínica nas infecções hospitalares e comunitárias, devido resistência microbiana aos antimicrobianos usados no tratamento quimioterápico (SOUZA, 2011; FIGUEIREDO et al., 2007), foi o que motivou em isolar e elucidar os constituintes com potencial antimicrobiano presentes no extrato das folhas de S. brasiliensis.
As cepas de Staphylococcus aureus (AM594, AM793, AM858, AM902), com o perfil genético de resistência determinado, são sensíveis a um único antimicrobiano, dos oitos testados (MIRANDA et al., 2007), e algumas das cepas de Pseudomonas
aeruginosa (AM460, AM462, AM470) foram resistentes aos quatorze antimicrobianos
testados. A média da atividade antimicrobiana do ExmSb frente às cepas de S. aureus e
P. aeruginosa apresentou na concentração 1,25 mg/poço, médias de halos de inibição de
21,0 ± 1,83 mm e 22,0 ± 2,39 mm, respectivamente. Como se pode notar, os halos de inibição ou a atividade antimicrobiana do ExmSb ficaram próximo à média dos halos de inibição, apresentando um desvio padrão aproximadamente de 2 mm, para mais ou para menos, frente aos diferentes microorganismos multirresistentes e os de menor resistência ou maior sensibilidade aos grupos de antimicrobianos utilizados na clínica. Ainda, a desvio padrão está dentro da variação verificada nos testes de determinação de halos de inibição frente a bactérias padrão, para testes de sensibilidade (CLSI, 2005). Isso tudo, nos permite supor que o mecanismo de ação dos constituintes do ExmSb, seja diferente daqueles mecanismos de resistência já adquiridos por essas bactérias.
No entanto, a média dos halos de inibição do ExmSb frente às enterobactérias (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Salmonella) e leveduras (Candida albicans e Candida krusei) só se expressaram como ativos ou muito ativos (ALVES et al., 2000) nas duas concentrações superiores (10 e 5 mg/poço), o que nos indica um menor potencial antimicrobiano dos constituintes do ExmSb frente a estes microorganismos, que frente as bactérias gram positivas e as cepas de P. Aeruginosa, que apresentou halos de inibição classificados como ativos e muito ativos na concentração de 1,25 mg/poço.
Considerou-se nas concentrações de ExmSb que obteve média de halo de inibição menor ou igual a 9 mm, como sem potencial antimicrobiano.
No estudo físico-químico do extrato seco metanólico das folhas de Schinopsis
brasiliensis microemulsionado (ExMESb) apresentou-se uniforme com capacidade de
eficiência de 99,78%, para a concentração nominal de 10 mg/mL, tamanho de partícula (80,2 ± 4,16 nm, sendo o da microemulsão foi de 44,7 ± 0,62 nm) e IPD (0,301) característico de uma microemulsão monodisperso do tipo isotrópica com partículas homogêneas e inchaço da gotícula devido à encapsulação do ExmSb. O índice de refração (1,382) superior e percentual de transmitância (64,5%) inferior ao da microemulsão (1,373 e 98,0%, respectivamente), que é justificado pela encapsulação do ExmSb à microemulsão. A condutividade (651,67 µS) e densidade relativa (1,018) próxima da água, correspondente ao de uma preparação óleo/água. O pH (6,14) e potencial Zeta (-18,90 mV) do ExMESb correspondente ao esperado para uma microemulsão estável, com pH compatível com a via de administração tópica (pH 5,5 à 8,0) (SILVA et al. 2009; LEONARDI et al., 2002) e capacidade máxima de incorporar do extrato à microemulsão foi de aproximadamente 25 mg/mL.
Os isolados das folhas de Schinopsis brasiliensis, β-1,2,3,4,6-Pentagaloil-D- Glicose (PGG) e galato de metila (GM), apresentaram atividade antimicrobiana, em particular frente às cepas de S. aureus, Staphylococcus coagulase negativo. Ainda apresentou boa atividade antimicrobiana frente P. aeruginosa e Enterococcus faecalis para PGG e frente E. coli para o GM.
Em relação à atividade antimicrobiana do ExMESb frente ao ExmSb, nas duas concentrações ensaiadas (1000 µ g/poço e 3000 µg/poço), percebe-se que o ExmSb obteve melhores halos de inibição frente a todas as bactérias ensaiadas. Este fato pode ser devido à liberação retardada dos metabólitos secundários (OLIVEIRA et al., 2004), com atividade antimicrobiana, encapsulados na fase interna da microemulsão (O/A) para o meio de cultura. Então, provavelmente, as bactérias teriam crescido antes que os compostos tivessem sido liberados em quantidade suficiente para inibir as bactérias ensaiadas, o que foi observado nos halos de inibição maiores do ExmSb.
A citotoxicidade do ExmSb e do ExMESb frente às linhagens celulares (K562) células de linhagem Leucêmica, (NCI-H292) células mucoepidermóides de carcinoma de pulmão humano, (HT-29) células de Adenocarcinoma de cólon humano de grau II e (HEp-2) Carcinoma humano) observou uma toxicidade seletiva do ExmSb e do ExMESb, como da própria ME, respectivamente, frente a K562 (IC50: 43,06; 13,21; >50 µ g/mL), NCI-H292 (IC50: 27,28; 8,23; 9,66 µg/mL), HEP-2 (IC50: 32,53; 17,23; 28,58
µ g/mL), enquanto que contra macrófagos murinos e HT-29 apresentaram IC50 superior a 50 µ g/mL, sendo de baixa citotoxicidade.
Os resultados bioautográficos das frações e do extrato das folhas de Schinopsis
brasiliensis frente às duas linhagens de S. aureus e os resultados da atividade
antimicrobiana dos constituintes isolados por poços difusão em ágar, sugerem que os mecanismos de ação dos compostos isolados são diferentes daqueles os quais a linhagem multirresistente desenvolveu resistência, o que revela uma janela de possibilidades para a pesquisa de um mecanismo de ação alternativo, vislumbrando o desenvolvimento de uma nova classe de antimicrobianos. Sendo para isso, necessária a contínua pesquisa multicêntrica, em particular, a partir de rica flora brasileira, que é uma fonte inesgotável de novas moléculas (SIMÕES e SCHENKEL, 2002). Ainda, no que concernem as microemulsões, apresentam-se como um veículo biocompatível do ponto de vista farmacêutico e importante carreador de extratos e frações de plantas, fato esse, que torna essencial a pesquisa desta ferramenta para a produção de novos fitomedicamentos.
9. CONCLUSÃO
A técnica de extração foi otimizada, proporcionando melhora nas características físico-química do extrato seco metanólico das folhas de Schinopsis brasiliensis (ExmSb);
No estudo farmacognóstico do ExmSb, observou-se potencial antioxidante e toxicidade moderada frente a Artemia salina, que justificou-se pelo doseamento de polifóis totais no ExmSb, em particular pela alta proporção de tanino;
Direcionado pelos Rf dos compostos com potencial antimicrobiano, obsevado técnica de bioautografia, pode-se isolar do ExmSb e elucidar estruturalmente dois compostos fenólicos com potencial antimicrobiano;
No desenvolvimento do extrato microemulsionado das folhas de S. brasliensis (ExMESb), pode-se criar um protocolo de incorporação do ExmSb à microemulsão. Também se determinaram as características fisicoquímicas, quando se observou uma preparação estável, límpida, com capacidade de eficiência próxima aos 100% e importante capacidade máxima de encapsulação;
O potencial antimicrobiano do ExmSb foi observado frente as bactérias gram positivas, em particular as cepas de Staphylococcus aureus multirresistentes e frente as gram negativas, sendo mais relevante frente as cepas de P. aeruginosa, inclusive aquelas multirresistentes. Ainda apresentou atividade antimicrobiana frente às leveduras (Candida albicans e Candida krusei);
As substâncias isoladas das folhas do ExmSb apresentaram atividade antimicrobiana frente as cepas de S. aureus e P. aeruginosa (pentagaloil glicose ) e frente as cepas de Staphylococcus, inclusive S. aureus MRSA multirresistentes (galato de metila).
O ExMESb apresentou citotoxicidade seletiva frente as linhagens neoplásicas, baixa citotoxicidade frente células sadias e a ação cicatrizante foi estatisticamente proporcial ao controle positivo (óleo de girassol).
A microemulsão mostrou-se ser um bom carreador do extrato seco metanólico das folhas de S. brasiliensis, o que justificaria maiores estudos para utilizar esta tecnologia na veiculação de extratos e frações de plantas para o desenvolvimento de novos fitomedicamentos.
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11. APÊNDICE – IMAGENS DOS ENSAIOS REALIZADOS
11.1. Imagens do estudo de atividade antimicrobiana do extrato seco metanólico das folhas de Schinopsis brasiliensis (ExmSb) frente bactéria de interesse clínico.
Foto 1. Foto 2. 1 Tetraciclina 30µg/Poço 2 ExmSb 10 mg/Poço 3 ExmSb 5 mg/Poço 4 ExmSb 2,5 mg/Poço 5 ExmSb 1,25 mg/Poço 6 Controle à DMSO 20% 1 Tetraciclina 30µg/Poço 2 ExmSb 10 mg/Poço 3 ExmSb 5 mg/Poço 4 ExmSb 2,5 mg/Poço 5 ExmSb 1,25 mg/Poço 6 Controle à DMSO 20% 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
11.2. Atividade antimicrobiana do extrato seco metanólico das folhas de Schinopsis
brasiliensis microemulsionado frente a bactérias de interesse clínico
Foto 3 Foto 4 Foto 5 1 Tetraciclina 30µg/Poço 2 Controle à DMSO 30% 3 ExmSb 3 mg/Poço 4 ExMESb 3 mg/Poço 5 Controle à DMSO 30% 6 ME 1 Tetraciclina 30µg/Poço 2 Controle à DMSO 30% 3 ExmSb 3 mg/Poço 4 ExMESb 3 mg/Poço 5 Controle à DMSO 30% 6 ME 1 Tetraciclina 30µg/Poço 2 Controle à DMSO 30% 3 ExmSb 3 mg/Poço 4 ExMESb 3 mg/Poço 5 Controle à DMSO 30% 6 ME 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Foto 6 Foto 7 1 Tetraciclina 30µg/Poço 2 Controle à DMSO 30% 3 ExmSb 3 mg/Poço 4 ExMESb 3 mg/Poço 5 Controle à DMSO 30% 6 ME 1 Tetraciclina 30µg/Poço 2 Controle à DMSO 30% 3 ExmSb 3 mg/Poço 4 ExMESb 3 mg/Poço 5 Controle à DMSO 30% 6 ME 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
11.3. Atividade antimicrobiana dos isolados, Pentagaloil-glicose (PGG) e galato de metila (GM), das folhas de Schinopsis brasiliensis
Foto 8 Foto 9 Foto 10 1 Tetraciclina 30µg/Poço 2 PGG 50 µg/Poço 3 PGG 100 µg/Poço 4 PGG 200 µg/Poço 5 PGG 25 µg/Poço 6 Controle à DMSO 20% 1 Gentamicina 10µg/Poço 2 PGG 50 µg/Poço 3 PGG 100 µg/Poço 4 PGG 200 µg/Poço 5 PGG 25 µg/Poço 6 Controle à DMSO 20% 1 Tetraciclina 30µg/Poço 2 PGG 50 µg/Poço 3 PGG 100 µg/Poço 4 PGG 200 µg/Poço 5 PGG 25 µg/Poço 6 Controle à DMSO 20% 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Foto 11 Foto 12 Foto 13 1 Tetraciclina 30µg/Poço 2 GM 100 µg/Poço 3 GM 400 µg/Poço 4 GM 800 µg/Poço 5 GM 200 µg/Poço 6 Controle à DMSO 20% 1 Tetraciclina 30µg/Poço 2 GM 100 µg/Poço 3 GM 400 µg/Poço 4 GM 800 µg/Poço 5 GM 200 µg/Poço 6 Controle à DMSO 20% 1 Tetraciclina 30µg/Poço 2 GM 100 µg/Poço 3 GM 400 µg/Poço 4 GM 800 µg/Poço 5 GM 200 µg/Poço 6 Controle à DMSO 20% 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
11.4. Determinação da aitividade antimicrobiana por do CMI / difusão em ágar, usando o multiinoculador de Stears Foto 14 Foto 15 Foto 16
Placa de agar Muller Hinton acrescido de 2% NaCl + Antibiótico Oxacilina. na concentração de 64 µ g/mL
Placa de agar Muller Hinton acrescido de 2% NaCl + Antibiótico Oxacilina. na concentração de 4 µ g/mL
Placa Controle (+) apenas Agar Muller Hnton
Foto 17
Foto 18
Foto 19
Placa de agar Muller Hinton + Extrato