EMB II Folha Seca
5.5 Citotoxidade In Vitro
A análise de citotoxicidade pelo método do MTT vem sendo utilizada no programa de screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI), que testa mais de 10.000 amostras a cada ano [116]. É um método rápido, sensível e barato. Este é um ensaio quantitativo in vitro que foi desenvolvido por Mossman em 1983 [99] para estimação de proliferação e sobrevivência celular. Este método é definido na literatura como apropriado para estimativa de citotoxicidade [117-120] e baseia-se na capacidade da succinato desidrogenase, uma enzima do Ciclo de Krebs ativa em mitocôndrias de células viáveis, em converter o sal de tetrazolium (brometo de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio ou MTT), que é hidrossolúvel e de cor amarelada, em cristais de formazan, que são de cor azul escura. Essa técnica tem a capacidade de analisar a viabilidade e o estado metabólico da célula, sendo assim, bastante útil para avaliar a citotoxicidade.
O estudo citotóxico pelo método do MTT permite definir facilmente a citotoxicidade, mas não o mecanismo de ação [121].
O teste de citoxicidade in vitro foi realizado com intuito de avaliar o percentual de inibição do crescimento celular em 4 linhagens de células tumorais (MDA-MB435, SF-295, HL-60 e HCT-8), utilizando os extratos metanólicos de J. curcas.
Para o screening inicial foram testadas quatorze amostras, entre as quais, apenas as amostras de folhas frescas dos acessos PM-12-FF, PM-14- FF e a variedade EMB-FF e as amostras de folhas secas dos acessos PM-2- FS e PM-10-FS apresentaram atividade citotóxica superior 80% para pelo
menos uma das linhagens de células tumorais testadas (Tabela 22). Isso mostra uma grande heterogeneidade, quanto a atividade citotóxica, entre os extratos testados. Provavelmente, o(s) composto(s) responsável(is) pela atividade citotóxica tem sua(s) concentração(ões) alterada(s) tanto pelo acesso em que a planta se encontra quanto pela forma em que as folhas são processadas.
Tabela 22: Atividade citotóxica, em concentração única (50 µg/mL), dos extratos de J. curcas em linhagens de células tumorais humana. A doxorrubicina foi usada como controle positivo.
Linhagem celular Amostras HL-60 HCT-8 SF-295 MDA-MB-435 Folhas frescas PM-2-FF -18,23 ± 4,97 34,49 ± 6,05 Nd 23,75 ± 5,98 PM-7-FF Nd 20,32 ± 0,11 19,65 ± 5,56 27,36 ± 2,48 PM-10-FF Nd 8,44 ± 3,85 14,37 ± 1,36 8,66 ± 5,96 PM-11-FF -8,09 ± 1,47 40,65 ± 8,44 Nd 18,71 ± 3,14 PM-12-FF Nd 90,77 ± 1,50 13,75 ± 0,20 38,64 ± 0,85 PM-14-FF Nd 88,32 ± 0,32 54,98 ± 6,58 80,65 ± 27,37 EMB-FF Nd 104,92 ± 0,32 37,24 ± 3,19 41,25 ± 2,27 Folhas secas PM-2-FS 20,67 ± 30,62 61,65 ± 3,05 Nd 81,18 ± 5,29 PM-7-FS Nd 11,01 ± 0,64 -1,02 ± 4,41 41,30 ± 5,74 PM-10-FS 101,34 ± 0,18 37,00 ± 3,16 Nd 36,39 ± 2,38 PM-11-FS -13,84 ± 17,51 45,44 ± 1,33 Nd 47,67 ± 5,29 PM-12-FS -89,18 ± 19,43 33,27 ± 0,11 Nd 46,15 ± 5,45 PM-14-FS -62,49 ± 10,85 40,38 ± 5,83 Nd 48,32 ± 1,92 EMB-FS Nd 24,63 ± 0,64 11,16 ± 7,66 15,08 ± 2,27 Doxorrubicina 99,36 ± 0,97 101,90 ± 0,22 102,04 ± 0,11 99,13 ± 0,37 Nd: Não determinado.
exposição com as células HL-60 (leucemia promielocítica), HCT-8 (cólon), SF- 295 (glioblastoma) e MDA-MB-435 (melanoma) obtidos através do programa GraphPad Prisma versão 5.0.
Segundo o Instituto Nacional do Câncer dos EUA (NCI), o screening inicial para extratos brutos é realizado numa concentração de 50 µg/mL para selecionar os extratos que apresentam substancial efeito antiproliferativo, com inibição de pelo menos 85% de proliferação da célula tumoral [122].
Após obtenção dos resultados parciais do screening inicial, as amostras PM-14-FF e EMB-FF foram selecionadas para serem avaliados na curva de dose dependente CI50 para as quatro diferentes linhagens em concentrações inferiores a 50 µg/mL.
Os valores de CI50 obtidos variaram de 30,78 a 63,67 µg/ml, nas linhagens de células HL-60 e MDAMB-435, para a amostra PM-14-FF e de 25,13 a 53,42 µg/ml, nas linhagens HL-60 e MDAMB-435, para a amostra EMB-FF, respectivamente (Tabela 23).
Tabela 23: Determinação da CI50 dos extratos citotóxicos de J. curcas em linhagens de células tumorais humana. A doxorrubicina foi usada como controle positivo. Linhagem celular Amostras HL-60 HCT-8 SF-295 MDA-MB-435 PM-14-FF 30,78 (24,98 - 37,94) 48,15 (49,44 - 55,72) >50 63,67 (53,72 - 72,73) EMB-FF 25,13 (23,42 - 27,54) 48,32 (44,78 - 49,34) >50 53,42 (42,31 - 54,78) Doxorrubicina 0,02 0,01 – 0,03 0,01 0,01 – 0,02 0,24 0,17 – 0,36 0,48 0,34 – 0,66 A tabela apresenta os valores de CI50 (µg/mL) e o intervalo de confiança de 95% de três experimentos independentes realizados em duplicata pelo método do MTT após 72 horas de exposição com as células HL-60 (leucemia
promielocítica), HCT-8 (cólon), SF-295 (glioblastoma) e MDA-MB-435 (melanoma) obtidos por regressão não-linear através do programa GraphPad Prisma versão 5.0.
Dentre as duas amostras testadas nesta segunda análise, apenas a amostra EMB-FF apresentou significativa atividade inibitória do crescimento celular para célula tumoral HL-60, uma vez, que para o NCI um extrato é considerado promissor quando apresenta valores de CI50 inferior a 30µg/mL [123].
Balaji e colaboradores também testaram a atividade citotóxica e antimetastática da fração metanólica das folhas da espécie de J. curcas encontrada na Índia, frente à linhagem de célula tumoral melanoma B16F10. Foi obtido um valor de CI50 de 24,8 µg/mL, o qual corrobora com os dados encontrados aqui para o acesso EMB-FF frente à linhagem HL60. Neste trabalho, os autores atribuem esta atividade antiproliferativa e antimetastática à presença de flavonóides [124].
Muanza e colaboradores avaliaram a atividade anticâncer e anti-HIV de nove extratos de plantas medicinais junto ao NCI. Nesses testes o extrato metanólico de J. curcas apresentou moderado efeito citoprotetor frente à linhagem humana de célula linfoblastóide CEM-SS infectada com o vírus HIV [125].
A escolha desse tipo de teste também poderá trazer outros benefícios, tais como: a redução no uso de testes que envolvam o sacrifício de animais; e a obtenção de informações que permitem determinar quais amostras podem ser desconsideradas e quais merecem investigações mais aprofundadas com outros tipos de testes [126].
6. CONCLUSÕES
Este trabalho permitiu, pela primeira vez, determinar a composição dos voláteis das folhas frescas e secas de seis acessos, cultivados no Campus de São Cristovão da UFS, e da cultivar da EPAMIG, plantada no Campo Experimental da Embrapa Tabuleiros Costeiros no município de Umbaúba-SE, de Jatropha curcas L.
Os experimentos de secagem das folhas permitiram verificar que há variações significativas (qualitativa e quantitativa) na composição química dos voláteis de acordo com o modo e o tempo de secagem. Os principais componentes identificados nas folhas frescas foram alcoóis tais como o (Z)-3- hexen-1-ol (75,7 ± 18,2%) e (Z)-2-penten-1-ol (7,3 ± 6,9%). Os alcoóis também predominaram nas folhas secas, principalmente o (Z)-2-penten-1-ol (14,9 ± 11,37%) e o (Z)-3-hexen-1-ol (9,6 ± 9,1%), mas outros constituintes foram identificados em proporções significativas incluindo o benzaldeído (3,9 ± 2,7%) e o 1-metiltio-3-pentanona (2,59 ± 1,88%).
Análises por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a um detector por arranjo de diodos (CLAE-DAD) permitiu, pela primeira vez, a obtenção dos cromatogramas fingerprints dos extratos metanólicos das folhas frescas e secas de seis acessos e da cultivar da EPAMIG de J. curcas.
As análises quimiométricas de PCA permitiram avaliar as semelhanças e as diferenças entre as amostras das folhas frescas e secas. Para as folhas secas foi possível observar a formação de três grupos bem coesos, separados de acordo com suas procedências, excetuando o acesso PM-2. As análises de HCA corroboraram com os resultados de PCA, comprovando que a amostra
PM-2 é mais similar a amostra EMB (cultivar EPAMIG), proveniente de Umbaúba. Além disso, estes resultados sugerem que o teor dos metabólitos secundários presentes nos extratos das folhas frescas e secas diferem entre si. Através do ensaio de ingestão frente a Spodoptera frugiperda, principal praga do milho, foi possível avaliar o potencial inseticida da espécie J. curcas. Os extratos testados desta planta, reduziram a fase larval e pupal do inseto e apresentaram atividade moderada com percentuais de 60% de mortalidade larval para os extratos EMB-FF, EMB-FS e PM-14, que se apresentaram como os mais promissores para uso no controle de S. frugiperda. As altas taxas de mortalidade provocadas por estes extratos devem estar relacionadas às substâncias que ainda não foram avaliadas e que deverão ser alvo de futuros estudos.
Os testes de citotoxicidade in vitro em células tumorais puderam mostrar a atividade antiproliferativa da espécie J. curcas, uma vez que a amostra EMB-FF apresentou valor de CI50 igual a 25,13 µg/mL, dentro do intervalo recomendado pelo NCI para extratos de plantas.
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