PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

4.1 Coleta e Identificação do Material Vegetal

As folhas dos seis acessos da espécie J. curcas (nomeados de PM-2, PM- 7, PM-10, PM-11, PM-12 e PM-14) foram coletadas no mês de janeiro de 2009 (frescas) e no mês de março de 2009 (secas ao ar por 05 dias). Os acessos são provenientes dos Estados de Minas Gerais, Goiás e Espírito Santo, cultivados no Banco de Germoplasma do Departamento de Agronomia do Campus da Universidade Federal de Sergipe em São Cristóvão-SE. Em outubro de 2008, foram coletadas as folhas de espécimes de uma cultivar (EPAMIG) de J. curcas (nomeada EMB) cultivadas no campo experimental da Embrapa Tabuleiros Costeiros, no município de Umbaúba–SE (Tabela 2).

Tabela 2: Dados dos acessos da espécie J. curcas L.

Acesso Código Estado

PM-2 JCUFLA001(02) Minas Gerais

PM-7 JCUFLA001(07) Minas Gerais

PM-10 JC016URVSHGO Goiás

PM-11 JC011URVGO Goiás

PM-12 JC012URVMG Minas Gerais

PM-14 JC014URVES Espírito Santo

EMB ---- Minas Gerais

Para verificar o efeito da secagem na composição dos voláteis das folhas de J. curcas, foi realizado no mês de maio de 2009, um experimento de secagem com o acesso PM-2, o qual foi selecionado devido a maior disponibilidade de material vegetal. Parte das folhas desse acesso foi seca ao ar durante 11 dias,

enquanto outra parte foi colocada para secar em estufa com circulação de ar durante um período de 3 dias a uma temperatura constante de 37ºC.

4.2 Obtenção dos Compostos Voláteis das Folhas

Os compostos voláteis das folhas frescas e secas de J. curcas foram obtidos em triplicata através da técnica de hidrodestilação, utilizando aparelhagem do tipo Clevenger. Sendo assim, as folhas frescas (83,4 - 271,8 g) e secas (123,7 - 242,1 g) dos seis acessos e da cultivar EMB foram trituradas separadamente em liquidificador e, em seguida, transferidas para um balão de fundo redondo (capacidade 2000 mL), onde se adicionou aproximadamente 1250 mL de água destilada.

Em seguida aqueceu-se o sistema em manta aquecedora por 3 horas. Os compostos voláteis foram arrastados juntamente com o vapor de água e posteriormente condensados. Os componentes voláteis foram separados da fase aquosa através de extração líquido-líquido usando CH2Cl2 (3 x 15mL). A fase orgânica foi seca com Na2SO4 anidro e o volume de solvente foi reduzido em rotaevaporador. Em seguida, a amostra foi cuidadosamente concentrada em fluxo de gás N2 até o volume final de aproximadamente 0,5 mL, ficando armazenada em frascos âmbar em freezer até a realização das análises por CG.

4.3 Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrômetria de Massas (CG/EM)

As amostras contendo os componentes voláteis das folhas de J. curcas foram analisadas em Cromatógrafo gasoso acoplado a um Espectrômetro de

Massas marca Shimadzu modelo QP5050A, equipado com uma coluna capilar de sílica fundida marca Phenomenex® Zebron ZB-5MS (30 m de comprimento x 0,25 mm de diâmetro interno x 0,25 µm de espessura do filme). O gás de arraste utilizado foi o Hélio (1,2 mL.min-1) e o volume injetado foi de 0,5 µL. A temperatura do forno inicial foi de 40ºC mantidos por 4 min e em seguida foi programada para aumentar 4ºC.min-1 até 220ºC e depois 20ºC.min-1 até 240ºC, perfazendo 50 min de análise. As temperaturas do injetor e detector foram 250ºC e 280ºC, respectivamente. O espectrômetro de massas operou no modo scan com intervalos de varredura de 0,5 fragmentos por segundo e energia de impacto de 70 eV, na faixa de m/z 40-350 Da.

Os índices de retenção foram obtidos co-injetando a amostra dos voláteis com uma mistura de hidrocarbonetos lineares (C9-C18). Os índices de retenção entre 700 a 899 e acima de 1800 foram obtidos por extrapolação. A percentagem de cada componente foi determinada pela área do componente dividida pela área total de todos os componentes presentes na mistura.

A identificação dos compostos foi feita com base nos índices de retenção [92] e na comparação computadorizada dos espectros de massas adquiridos com aqueles armazenados no banco de dados de espectros de massas do sistema CG/EM (NIST107 e NIST21; WILEY), juntamente com espectros de massas da literatura [93].

4.4 Determinação do Perfil Cromatográfico por CLAE dos Extratos de Jatropha curcas L.

4.4.1 Equipamentos e Reagentes

O metanol utilizado para preparação dos extratos metanólicos das folhas frescas e secas foram de grau P.A. da marca Synth (LabSynth Produtos para Lab. Ltda, Diadema, SP, Brasil) e Quimex (F. Maia Industria e Com. Ltda, comercializada pela Merck S.A).

A acetonitrila utilizada nas análises cromatográficas de alta eficiência foi de pureza analítica e grau CLAE (JT Baker, Philipsburg, PA, EUA; Carlo Erba, Duque de Caxias, RJ, Brasil).

O metanol utilizado na preparação das amostras para extração em fase sólida (SPE) foi de pureza analítica e grau CLAE (Carlo Erba, Duque de Caxias, RJ, Brasil).

Foi preparada uma solução de ácido fosfórico (85,1%) de grau analítico (JT. Baker, Philipsburg, PA, EUA) em pH 3.

A água deionizada utilizada na composição da fase móvel e no preparo das amostras para a extração em fase sólida (SPE) foi obtida em um sistema MILLI-Q (Millipore, São Paulo, SP, Brasil).

As pesagens foram realizadas em balança analítica modelo APX 200 da marca Denver Instrumet Company.

Os extratos metanólicos foram concentrados em evaporador rotatório da marca Heidolph®

Os solventes utilizados nas análises cromatográficas de alta eficiência foram previamente filtrados utilizando membrana filtrante da marca MFS de nylon de 47 mm (diâmetro da membrana) e 0,45 µm (diâmetro do poro), e sonicados em aparelho Ultra Cleaner Modelo USC-1600A da (Unique Ind. E Com. Prod. Eletr. Ltda, Brasil).

Foi utilizado um cartucho de SPE C18 com volume de 1 mL e coluna de 100 mg, da marca J.T. Baker (40 µm APD, 60A).

Para realização da SPE foi utilizada uma bomba a vácuo DIAPUMP® (FANEM, SP, Brasil) acoplada a um manifold a vácuo de 12 portas (Phenomenex).

A coluna cromatográfica utilizada nas análises por CLAE foi C18 LUNA® (5 µm, 250 x 4.60 mm, Phenomenex), coluna hexil-fenil Luna® (10µm, 150 x 4,6 mm, Phenomenex).

O liquidificador utilizado para triturar as folhas frescas e secas na preparação do extrato metanólico foi da marca Black&Decker (uso doméstico).

4.4.2 Sistemas de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Sistema 1: Cromatógrafo líquido da marca SHIMADZU (Kyoto, Japão), modelo