Clonagem da ORF ESAT-6 no vetor de expressão pBAD202/D-TOPO®

O vetor escolhido para a clonagem e a expressão da proteína recombinante ESAT-6 (rESAT-6) foi o vetor comercial pBAD202/D-TOPO® (Invitrogen) (Figura 8). Por possuir a topoisomerase I ligada covalentemente à extremidade 3' fosfato de cada fita de DNA, esta enzima é capaz de fornecer energia à ligação do inserto, facilitando o processo de clonagem. Além disto, este vetor possui, após o forte promotor pBAD, a HP-thioredoxina N-terminal, uma sequência mutada da thioredoxina, transcrita como uma proteína de fusão (adição de 16 KDa na proteína expressa), capaz de aumentar os níveis de tradução da proteína de interesse e aumentar também sua solubilidade celular, facilitando o processo de purificação. A mutação ainda gera histidinas em regiões específicas da proteína dobrada, gerando um domínio de ligação a metais que, juntamente com a cauda de histidina C-terminal, possibilita a purificação da proteína utilizando coluna de níquel, devido à afinidade do aminoácido histidina por cátions bivalentes (íon Ni2+).

67 Figura 8: Representação esquemática do vetor pBAD202/D-TOPO®. pBAD: Promotor araBAD; Kmr: gene que confere resistência à canamicina; pUC ori: origem de replicação; araC gene: codifica uma proteína regulatória do promotor pBAD; (Fonte: User Manual pBAD Directional TOPO® Expression Kit , Invitrogen).

IV.3.2.1 Confecção de Escherichia coli eletrocompetente

100 µL de uma cultura de E. coli TOP10, contendo aproximadamente 108 UFC, foram inoculados em 5 mL de meio LB, sem antibiótico, e incubados a 37°C, durante 18 horas, sob agitação. Em seguida, uma alíquota de 3 mL desta cultura foi inoculada em 300 mL de LB e incubada a 37°C, sob agitação, até atingir uma DO600 entre 0,2 e

0,3. Uma vez alcançada a DO600 desejada, a cultura foi resfriada, em gelo, por 30

minutos e redistribuída em seis tubos falcon com 40 mL de cultura, em cada. Posteriormente, cada cultura foi centrifugada a 4.000 rpm durante 20 minutos a 4°C e o sobrenadante descartado. Para a lavagem do precipitado celular, a cada tubo foram adicionados 40 mL de uma solução, estéril e gelada, de glicerol 10% e as células foram ressuspensas. Os tubos foram, novamente, centrifugados a 4.000 rpm por 20 minutos a 4ºC e o sobrenadante descartado.

Esse processo de centrifugação e lavagem foi repetido mais três vezes e, após a última lavagem, o precipitado celular unificado foi ressuspenso em 1 mL da solução de glicerol 10% e alíquotas de 100 µL foram estocadas a -80°C.

68 Para análise da eficiência de transformação, uma alíquota (100 µL) com células eletrocompetentes, congelada a -70°C, foi colocada no gelo durante 5 minutos. Em seguida adicionou-se 10 ng do plasmídeo pUC18 ou pUC19 (Ampr) e a mistura foi incubada por 10 minutos no gelo. Em seguida, a mistura foi transferida para cubetas de eletroporação (2 mm) (BioAgency), previamente resfriadas. As amostras foram submetidas a um pulso de 2.500 V, capacitância de β5 µF e resistência de β00 Ω utilizando um eletroporador GenePulser XCellTM Electroporation System Quick Guide (Bio-RAD). Imediatamente após o pulso, adicionou-se às células 1 mL de meio LB e as mesmas foram incubadas a 37ºC em Banho Maria, sem agitação, por duas horas. Diluições de 10-2, 10-4 e 10-6 do cultivo bacteriano foram semeadas em meio LB ágar suplementado com ampicilina (100 µg/mL) e incubadas a 37°C durante 18 horas.

IV.3.2.2 Ligação da ORF ESAT-6 no vetor pBAD202/D-TOPO® e Transformação de Escherichia coli TOP10

O amplicon correspondente à ORF ESAT-6 foi submetido a uma reação de ligação no vetor pBAD202/D-TOPO® (Figura 5) (pBAD Directional TOPO® Expression Kit, Invitrogen) para a geração do plasmídeo pBAD:ESAT-6. A ligação foi realizada conforme as instruções do fabricante. O produto de ligação (pBAD202/D- TOPO® e inserto ESAT-6) foi utilizado para transformar células eletrocompetentes de E. coli TOP10, preparadas de acordo com o protocolo descrito no item IV.3.2.1.

A transformação foi conduzida por eletroporação. Para tanto, uma alíquota (6 µL) do produto de ligação foi misturada com 100 µL de células eletrocompetentes e incubados no gelo por 20 minutos. A eletroporação foi realizada no aparelho GenePulser XCellTM Electroporation System Quick Guide (Bio-RAD). Como controle negativo, 100 µL de células eletrocompetentes foram transformadas sem adição de qualquer plasmídeo.

Após a adição de 1 mL de meio LB às bactérias transformadas e incubação a 37ºC, o processo de seleção dos transformantes consistiu em semear alíquotas de 100 µL e o restante (precipitado celular de 850 µL), da suspensão de células eletroporadas em placas de Petri contendo meio LB ágar suplementado com 50 µg/mL de Km. As culturas foram mantidas a 37°C por, aproximadamente, 18 horas. Após este período, as placas foram avaliadas quanto à presença de colônias resistentes à Km. A etapa seguinte

69 consistiu na seleção de clones de cada uma das placas para proceder com a extração de plasmídeos e confirmar a presença da ORF ESAT-6 nos mesmos.

IV.3.2.3 Extração do DNA plasmideano de Escherichia coli TOP10

Cada colônia selecionada foi inoculada em 5 mL de meio LB contendo Km 50 µL/mL e mantidas, por cerca de 18 horas, a 37ºC, sob agitação. Uma alíquota de 1 mL de cada cultura foi estocada a -80ºC. O restante do inóculo foi transferido para tubos de microcentrífuga e procedeu-se com a extração de plasmídeos com o kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega), conforme recomendações do fabricante, ou pelo método de lise alcalina descrito por Sambrook et al. (1989).

IV.3.2.4 Confirmação da presença e do peso molcular da ORF ESAT-6 no vetor pBAD202/D-TOPO®.

Para verificar a presença da ORF e o peso molecular do fragmento de DNA clonado no vetor pBAD202/D-TOPO®, o inserto do DNA plasmideano foi amplificado por PCR utilizando uma combinação de primers: primers para ORF ESAT-6 FprotESAT e RprotESAT (Tabela 4); primers para o vetor pBAD202/D-TOPO® FTrxFus e RpBAD (Tabela 5); e a combinação de FprotESAT e RpBAD, para confirmação da orientação do inserto no vetor.

As reações de PCR foram realizadas em um volume de 25 µL contendo: 2,5 µL 10X PCR Buffer (Invitrogen); 0,75 µL de dNTP 10mM (Invitrogen); 0,3 µL de MgSO4 50 mM (Invitrogen); 0,5 µL do primer foward e 0,5 µL do primer reverse, ambos a 100 pMoles/µL; 0,5 µL da miniprep (100 ng/µL); 0,5 µL da enzima Taq DNA Polymerase Recombinant (5 u/µL) (Invitrogen); 19,65 µL de água milli-Q estéril. A amplificação por PCR foi realizada sob as seguintes condições: primeira desnaturação a 94°C durante 3 minutos, seguida por 30 ciclos de desnaturação a 94°C durante 45 segundos; anelamento dos primers a 65ºC por 30 segundos; extensão a 72°C durante 1 minuto e 30 segundos e extensão final por 10 minutos a 72°C. A reação ocorreu em um aparelho termociclador modelo ATC 401 (NYX TECHNIK, Inc.). Após a reação, 1 µL do produto amplificado foi depositado e resolvido em gel de agarose a 1% sob as mesmas condições descritas no item IV.1.3.

70 Tabela 5: Primers utilizados para a confirmação da presença da ORF ESAT-6 no vetor pBAD202/D-TOPO®. Primer Sequência forward TrxFus (FTrxFus) 5´-TTCCTCGACGCTAACCTG-3´ reverse pBAD (RpBAD) 5´-GATTTAATCTGTATCAGG-3´

Peso molecular esperado do

fragmento amplificado _{563 pb}

IV.3.2.5 Reação de sequênciamento e análises em sílico

A seqüência nucleotídica da ORF ESAT-6, clonada no vetor pBAD202/D- TOPO®, foi confirmada através de sequênciamento utilizando os primers FprotESAT e RprotESAT (Tabela 4). Para isto, foi escolhido um clone de E. coli(pBAD:ESAT-6), sendo este sequênciado duas vezes Foward e duas vezes Reverse. Cada amostra foi amplificada utilizando o kit DYEnamicTM ET Dye Terminator (GE Healthcare), como se segue: 4,0 μL do mix ET dye terminator, 1 μL do primer FprotESAT ou RprotESAT (10 pmol/μL) e 5 μL de DNA plasmideano (50 ng/μL). A reação ocorreu em termociclador sob as seguintes condições: desnaturação inicial a 95°C por 1 minuto, seguida por 30 ciclos de desnaturação a 95ºC por 20 segundos, anelamento do primer a 65ºC por 15 segundos e extensão a 60°C por 1 minuto e 20 segundos.

Logo após, os produtos da reação foram precipitados e lavados, com o objetivo de remover os nucleotídeos marcados não incorporados ao DNA amplificado. Para tanto, a cada amostra foi adicionado 1 μL acetato de amônio 7,5 M (fornecido pelo kit) e γ0 μL de etanol 96%. A mistura foi homogeneizada e incubada por β0 minutos, à temperatura ambiente, protegida da luz. Seguiu-se, então, com centrifugação (4.000 rpm, durante 45 minutos, a 4ºC) e o descarte do sobrenadante. Em seguida, adicionou-se 100 μL de etanol 70% às amostras e as mesmas foram centrifugadas (4.000 rpm durante 10 minutos), sendo o sobrenadante, novamente descartado. Por fim, as amostras,

71 precipitadas e secas, foram ressuspensas em 10 μL de “loading buffer” e armazenadas a 4°C até o momento de sua aplicação no sequênciador MegaBACETM 1000 (GE Healthcare).

As seqüências obtidas foram comparadas utilizando o programa Vector NTI suíte 8 (Invitrogen), onde a integridade da sequência nucleotídica foi avaliada considerendo-se a qualidade do seqüenciamento de cada base. As sequências também foram analisadas utilizando o algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) disponível no NCBI (National Center for Biotechnology Information; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), utilizando o programa “BLASTn” para a comparação entre seqüências de ácidos nucléicos.