Ensaio Imunoenzimático (ELISA) para dosagem dos anticorpos IgA, IgG,

Com o intuito de verificar se houve resposta imune sistêmica após a imunização dos camundongos com as linhagens de L. lactis e também verificar se houve uma variação nesta resposta, durante todo o processo de imunização, a produção de IgA, IgG, IgG1 e IgG2a, específicas para ESAT-6, foi avaliada. O ELISA foi realizado a partir do soro dos animais, coletados duas semanas após a primeira, segunda e terceira administração orogástrica das linhagens de L. lactis aos animais.

A Figura 27 mostra os resultados obtidos para IgA sérica, anti-ESAT-6, onde foi possível verificar, no grupo imunizado com L. lactis FnBPA(pValac:ESAT-6) (FE), um aumento, estatisticamente significativo, em relação ao controle negativo, duas semanas após a 2ª imunização (tempo 2). Já duas semanas após a 3ª imunização (tempo 3), esta diferença também foi observada para o grupo L. lactis FnBPA (F) e L. lactis MG1363(pValac:ESAT-6) (ME). Porém, o grupo L. lactis FnBPA(pValac:ESAT-6) (FE), no tempo 2, não diferiu, estatisticamente, do grupo L. lactis FnBPA (F) (dados estatísticos não demonstrados na figura). No tempo 3, o grupo L. lactis FnBPA(pValac:ESAT-6) (FE) não diferiu, estatisticamente, dos grupos L. lactis MG1363(pValac:ESAT-6) (ME) e L. lactis FnBPA (F) (dados estatísticos não demonstrados na figura). Sendo assim, não foi, estatisticamente possível, confirmar um aumento de IgA sérica, após a imunização dos camundongos com as linhegens de L. lactis.

111 Figura 27: Avaliação da presença de IgA específica no soro dos animais imunizados com as linhagens de L. lactis. Resultados representados como a média ± SEM de quatro experimentos independentes. Grupos experimentais: (-): Negativo; M: L. lactis MG1363; ME: L. lactis MG1363(pValac:ESAT-6); F: L. lactis FnBPA; FE: L. lactis FnBPA(pValac:ESAT-6). *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 em relação ao grupo (-) no mesmo tempo experimental.

As Figuras 28, 29 e 30 mostram os resultados obtidos para IgG, IgG1 e IgG2a, respectivamente, nos três tempos analisados. Para IgG e IgG2a, não houve diferença, estatisticamente significativa, de nenhum dos grupos experimentais em relação ao grupo controle negativo, o qual recebeu, orogastricamente, apenas salina. Apenas para IgG1, houve um aumento visual no tempo 3 do grupo L. lactis FnBPA(pValac:ESAT-6) (FE), estatisticamente significativo em relação ao negativo. Entretanto, não houve diferença, estatisticamente significativa, entre este grupo e o grupo L. lactis FnBPA (F), não sendo possível considerar que, neste caso, houve aumento de IgG1.

Além disto, foi utilizado um soro como controle positivo para Ig anti-ESAT-6 para confirmar que havia detecção ou ainda que a técnica aqui adotada era funcional, ou seja, capaz de detectar as IgG e seus isotipos anti-ESAT-6. Para isto, camundongos que receberam a proteína rESAT-6, em hidróxido de alumínio, tiveram seu soro coletado. Este soro, positivo, foi utilizado no ELISA como controle de detecção, como apresentado abaixo de cada figura. Assim, pôde-se confirmar a confiabilidade da técnica e também a ausência de estimulação da resposta humoral sistêmica neste trabalho.

112 Figura 28: Avaliação da presença de IgG específica no soro dos animais imunizados com as linhagens de L. lactis. Resultados representados como a média ± SEM de quatro experimentos independentes. Grupos experimentais: (-): Negativo; M: L. lactis MG1363; ME: L. lactis MG1363(pValac:ESAT-6); F: L. lactis FnBPA; FE: L. lactis FnBPA(pValac:ESAT-6). Soro+ para ESAT-6. Foi considerado como diferença estatisticamente significativa quando *p<0,05, considerando cada grupo em relação ao grupo (-) no mesmo tempo experimental.

Figura 29: Avaliação da presença de IgG1 específica no soro dos animais imunizados com as linhagens de L. lactis. Resultados representados como a média ± SEM de quatro experimentos independentes. Grupos experimentais: (-): Negativo; M: L. lactis MG1363; ME: L. lactis MG1363(pValac:ESAT-6); F: L. lactis FnBPA; FE: L. lactis FnBPA(pValac:ESAT-6). Soro+ para ESAT-6. Foi considerado como diferença estatisticamente significativa quando *p<0,05, considerando cada grupo em relação ao grupo (-) no mesmo tempo experimental.

113 Figura 30: Avaliação da presença de IgG2a específica no soro dos animais imunizados com as linhagens de L. lactis. Resultados representados como a média ± SEM de quatro experimentos independentes. Grupos experimentais: (-): Negativo; M: L. lactis MG1363; ME: L. lactis MG1363(pValac:ESAT-6); F: L. lactis FnBPA; FE: L. lactis FnBPA(pValac:ESAT-6). Soro+ para ESAT-6. Foi considerado como diferença estatisticamente significativa quando *p<0,05, considerando cada grupo em relação ao grupo (-) no mesmo tempo experimental.

Alguns trabalhos detectaram diferenças destas Igs após a imunização de mucosas com DNA codificando ESAT-6. Wang et al. (2009) detectaram aumento nos níveis de IgG, específica, nos grupos que receberam tanto a vacina de DNA, entregue por S. typhimurium atenuada [SL(E6-85B)], quanto na combinação desta com a BCG. Além disto, um aumento expressivo de IgG2a, em relação a IgG1, também foi verificado para estes dois grupos; o que é indicativo de uma resposta direcionada para patógenos intracelulares, como é o caso do M. tuberculosis.

Neste contexto, uma das hipóteses para a ausência de uma resposta imune humoral sistêmica baseada no sistema de entrega vacinal aqui testado, seria o fato de que o plasmídeo é entregue a um pequeno número de enterócitos (Pontes et al., 2012; Del Carmen et al., 2013). Assim, estas células seriam capazes de gerar apenas uma pequena quantidade da proteína para a apresentação ao sistema imune que, provavelmente, não foi suficiente para a ativação de células B em plasmócitos, tampouco para a detecção de diferença na produção de IgGs.

Como já explicitado, a forma de apresentação antigênica, através de uma vacina de DNA, é, primariamente, via MHC, sendo estas moléculas reconhecidas por receptores de células T (TCRs). Para a ativação de linfócitos B por antígenos proteicos,

114 estes devem se encontrar extracelularmente para reconhecimento e ligação ao receptor de células B (BCR), com posterior processamento do antígeno pelas células B e apresentação do mesmo às células T CD4, necessárias para a geração de plasmócitos de longa vida (Andrew et al., 2012).

Apesar da formulação vacinal testada neste trabalho não apresentar aumento da resposta imune humoral sistêmica, sabe-se que a resposta primária, frente à infecção pelo M. tuberculosis, e responsável por gerar uma proteção vacinal, é, principalmente, uma resposta imune celular. Além disto, visto que as vacinas de DNA mimetizam uma infecção natural, como a que ocorre por M. tuberculosis, os antígenos são produzidos intracelularmente e apresentados ao sistema imune. Assim, a principal resposta a estes antígenos é a proliferação de linfócitos TCD4+ e TCD8+ e a produção de citocinas, em especial IFN- , capaz de aumentar a resposta microbiocida dos macrófagos infectados. Já a resposta de anticorpos ao referido bacilo é, praticamente, ausente na infecção natural.